家蚕Anillin基因的鉴定及Aurora B对Anillin的磷酸化调控研究

论文摘要

作为肌动蛋白结合蛋白的Anillin在细胞有丝分裂进程中扮演者着重要的角色。然而家蚕Anillin的序列和功能尚未有报道。此外,在有丝分裂过程中,Anillin会经历明显的磷酸化修饰,然而对其进行修饰的激酶、修饰位点以及不同修饰在有丝分裂过程中的功能仍亟待深入挖掘。本研究中,我们对家蚕Anillin基因（BmAnillin）进行了全长cDNA序列克隆和表达谱分析,利用RNAi等技术分析了BmAnillin在家蚕细胞周期中的功能。同时,我们探究了Aurora B激酶对Anillin磷酸化的调控作用。主要的研究结果如下:1.家蚕Anillin基因的全长cDNA克隆及时空表达特征分析我们以果蝇Anillin氨基酸序列在家蚕数据库中进行同源性比对检索,结果发现家蚕预测基因BMgn004275与果蝇Anillin具有很高的序列相似性。基于RACE方法并以家蚕翅原基为模板,我们克隆获得了家蚕Anillin（BmAnillin）的全长cDNA序列,其序列全长为6552 bp（GenBank accession no.MK327369）。对BmAnillin的cDNA序列进行生物信息学分析的结果显示,BmAnillin基因包含167 bp的5′端非编码区域、2374 bp的3′端非编码区域以及4011 bp的开放阅读框,共编码1336个氨基酸。将BmAnillin基因与家蚕基因组序列进行比对发现,BmAnillin由21个外显子和20个内含子组成。结构域预测分析表明,BmAnillin基因所编码的氨基酸序列的C端有一个Anillin同系物所具有的共有区域AHR区域,其中包含一个AH区域和一个PH区域。我们通过BLAST比对分析了一些物种的Anillin基因,并由此评估了不同物种Anillin基因的分子进化关系。结果显示,Anillin基因在家蚕及其他所分析的物种中均以单拷贝形式存在,表明其具有功能保守性。进一步利用家蚕及其他物种Anillin的全长氨基酸序列,构建了系统发生树。结果显示,Anillin系统发生树的拓扑结构与物种的经典分类一致。例如,包括家蚕在内的所有鳞翅目昆虫的Anillin首先先被归为一类,然后与其他昆虫的Anillin进行聚类。Anillin的系统发生树显示,家蚕先与鳞翅目昆虫聚为一枝后再与其他昆虫聚类,最后再与脊椎动物聚为一枝,这进一步表明Anillin在不同物种间具有功能保守性。我们分析了BmAnillin在家蚕幼虫五龄第三天不同组织中的表达情况。基于qRT-PCR分析的结果表明,BmAnillin在诸如生殖腺、血淋巴等进行有丝分裂的组织中的表达量相对较高,而在丝腺等进行核内周期的器官中相对低表达。进一步分析家蚕不同发育阶段生殖腺和丝腺中BmAnillin的时期表达情况,发现BmAnillin在家蚕不同发育阶段的生殖腺中持续表达,而丝腺中仅能在眠期够检测到BmAnillin的表达。2.Anillin在家蚕细胞胞质分裂中作用我们在家蚕卵巢来源的BmN4-SID1细胞中对BmAnillin基因进行了双链RNA干涉,以调查其在家蚕细胞周期进程中的作用。通过免疫荧光分析的结果显示,与干涉RFP基因相比,BmAnillin基因的RNAi导致细胞分裂异常的比例上升至21.1%。进一步对BmAnillin基因RNAi后家蚕细胞有丝分裂不同时期各关键事件的完成情况进行检测,结果显示,在有丝分裂中期,BmAnillin的干涉导致染色体排列的异常并出现多极纺锤体。在后期,BmAnillin的下调导致了分裂沟处F-actin纤维的缺失。综合这些结果表明,BmAnillin在家蚕BmN4-SID1细胞的染色体分离和最终的细胞分裂过程中是必不可少的。3.Aurora B激酶对Anillin磷酸化的调控研究我们在前期的磷酸化蛋白组学研究中发现,Aurora B激酶可能参与了对Anillin的磷酸化修饰。我们采用Western blot分析经过不同条件处理后Anillin在SDS-PAGE凝胶上的迁移情况,结果初步表明Anillin在有丝分裂过程中发生磷酸化。进一步的实验结果证实,Aurora B激酶参与了细胞有丝分裂过程中Anillin的磷酸化。抑制Aurora B激酶的活性导致Anillin在细胞膜上的定位异常,进而出现细胞分裂异常。此外,通过对细胞内源的Anillin与Aurora B进行共定位分析以及免疫沉淀分析发现,Anillin与Aurora B在细胞内存在相互作用。结合磷酸化位点预测网站与相关文献,我们确定了Ser485、Thr1071、Thr1079三个位点为Anillin上Aurora B激酶的潜在磷酸化位点。进一步的实验结果表明,Ser485和Thr1071氨基酸残基的磷酸化是保证有丝分裂中期染色体紧密排列及纺锤体正确组装的必要条件。而Thr1079的磷酸化参与到了细胞分裂间期Anillin核定位的调节以及在胞质分裂过程中调节Anillin及时被募集到细胞膜上。这些结果表明,Aurora B对Anillin的磷酸化修饰直接参与调控了胞质分裂过程。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章文献综述

1.1 细胞周期

1.1.1 有丝分裂

1.1.2 胞质分裂

1.1.3 家蚕不同组织器官的细胞周期类型

1.2 胞质分裂的组织者Anillin

1.2.1 Anillin的结构

1.2.2 Anillin的细胞定位调节细胞周期进程

1.3 有丝分裂过程中的磷酸化调控研究

1.3.1 Aurora B激酶及其参与细胞分裂的功能概述

1.3.2 Anillin在细胞周期中的磷酸化研究

第2章引言

2.1 研究背景及目的意义

2.2 研究内容

2.2.1 家蚕Anillin基因编码序列的克隆与时空表达特征分析

2.2.2 家蚕Anillin参与胞质分裂的功能研究

2.2.3 Aurora B激酶对Anillin的磷酸化调控研究

2.3 技术路线

第3章家蚕Anillin基因的全长cDNA克隆与时空表达特征分析

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验试剂

3.2 实验方法与步骤

3.2.1 相关试剂及配制

3.2.2 RACE扩增方法

3.2.3 RACE产物的PCR验证

3.2.4 BmAnillin原核表达检测

3.2.5 RNA提取

3.2.6 cDNA反转录

3.2.7 RT-PCR

3.2.8 qRT-PCR

3.2.9 丝腺冷冻切片

3.2.10 生物信息学分析所用软件及在线数据库

3.3 实验结果与分析

3.3.1 家蚕BmAnillin基因全长cDNA的克隆及序列分析

3.3.2 家蚕与其它物种Anillin的进化分析

3.3.3 家蚕BmAnillin基因的时空表达特征分析

3.3.4 家蚕丝腺微丝骨架的观察分析

3.4 讨论

第4章家蚕Anillin在细胞胞质分裂中的功能

4.1 实验材料与试剂

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验试剂

4.2 实验方法与步骤

4.2.1 主要试剂及配制

4.2.2 家蚕Anillin基因dsRNA合成

4.2.3 细胞培养

4.2.4 dsRNA干涉

4.2.5 细胞提取RNA

4.2.6 RT-PCR分析

4.2.7 免疫荧光染色

4.2.8 生物信息学分析所用软件

4.3 实验结果与分析

4.3.1 家蚕细胞系中BmAnillin基因的RNAi

4.3.2 家蚕BmAnillin基因RNAi导致胞质分离异常

4.3.3 家蚕BmAnillin基因RNAi导致有丝分裂中期染色体分离紊乱

4.3.4 家蚕BmAnillin基因RNAi导致胞质分裂过程中F-actin纤维的缺失

4.4 讨论

第5章 Aurora B激酶对Anillin的磷酸化调控研究

5.1 实验材料与试剂

5.1.1 实验材料

5.1.2 实验试剂

5.2 实验方法与步骤

5.2.1 主要溶液及配制

5.2.2 Anillin序列定点突变

5.2.3 细胞培养

5.2.4 细胞周期阻滞

5.2.5 转染

5.2.6 细胞蛋白提取

5.2.7 IP实验

5.2.8 Western Blot检测

5.2.9 免疫荧光检测

5.2.10 生物信息分析软件及在线数据库

5.3 实验结果与分析

5.3.1 Aurora B激酶对Anillin的磷酸化

5.3.2 Aurora B激酶与Anillin的亚细胞共定位及互作分析

5.3.3 抑制Aurora B活性导致胞质分裂过程中Anillin分布异常

5.3.4 Anillin上Aurora B磷酸化位点的鉴定

5.4 讨论

第6章综合与结论

参考文献

附件

附件一用于系统发育分析的各种生物的Anillin基因目录

附件二用于Anillin定点突变的引物序列

硕士期间发表论文及参研课题

发表论文

参研课题

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王鹏

导师: 程道军

关键词: 家蚕,胞质分裂,磷酸化

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q78

总页数: 86

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