谭秀文[1]2004年在《小鼠胚胎共培养：体细胞状态影响及作用机理》文中研究指明在一些简单的培养基中,受精卵往往发生“发育阻断”。尽管近年来在几种动物(如小鼠和牛)用成份明确的培养基已经能够使胚胎克服体外阻断而发育到囊胚,但许多动物的胚胎在体外还必须依靠共培养才能发育到囊胚期。另外,胚胎与体细胞共培养对于了解体细胞与胚胎的相互作用也十分重要。因此,有必要深入研究共培养的影响因素和作用机理。本实验首先把昆明白小鼠原核胚分别与小鼠、山羊和鸡的输卵管上皮细胞(OEC)、大鼠肝细胞(BRL)和非洲绿猴肾细胞(VERO)共培养,确定异种体细胞、细胞贴满程度和传代次数对小鼠胚胎发育的影响;接着,分别用流式细胞计量仪和Annexin标记检测不同贴满程度和传代次数山羊OEC的细胞周期和凋亡程度,确定体细胞的生理状态与胚胎发育的关系;最后,通过使用不同的条件化培养液和加隔离膜共培养,以及用高效液相色谱分析条件培养液中的HX浓度的方法探讨了体细胞与共培养胚胎相互作用的机理。结果表明: 1、小鼠胚胎与原代贴满1d的小鼠、山羊和鸡OEC共培养,发育到囊胚的比例(分别为61.7%、57.2%和56.2%)差异不显着。说明体细胞的种属差异不影响共培养胚胎的发育效果。 2、小鼠胚胎与半贴满、贴满1d、3d和5d的山羊、小鼠和鸡原代OEC共培养,与贴满1d的OEC共培养的胚胎的囊胚发育率显着高于其它组。说明体细胞的贴壁程度影响共培养胚胎的发育效果。 3、小鼠胚胎与原代、Ⅱ代和Ⅲ代贴满1d的鸡OEC,原代、Ⅲ代和Ⅴ代贴满1d的山羊和小鼠OEC共培养,与鸡原代OEC、山羊和小鼠的原代和Ⅲ代OEC共培养的胚胎的囊胚发育率(分别为51.1%;54.3%、57.2%;57.1%和52.4%)较高。说明体细胞的传代次数影响共培养胚胎的发育效果。 4、贴满不同天数山羊原代OEC和不同传代次数贴满1d山羊OEC的细胞周期的检测显示,S期细胞的比率随贴满时间的延长和传代次数的增加而下降,而G1+G0期的细胞比率明显升高。Annexin-V和PI结合检测贴满不同天数山羊原代OEC和不同传代次数贴满1d山羊OEC的凋亡表
刘淑娟[2]2007年在《昆白系小鼠体外受精》文中进行了进一步梳理体外受精在医学、生物学等相关领域已得到广泛的应用,但是体外受精及受精卵体外培养体系还有待于进一步完善。昆白小鼠是我国自行繁殖的近交系小鼠,由于其遗传背景清楚、生殖周期短、环境适应能力强等优点,是研究哺乳动物体外受精的良好的实验动物。为了建立更为简单、高效的体外受精及胚胎培养体系,提高体外受精率和体外发育的胚胎质量。本研究以昆白小鼠为研究对象,从胚胎培养液的筛选、肝素对精子活力的影响、不同获能液对受精率的影响、不同培养液对胚胎发育的影响、不同培养体系对胚胎发育的影响等,5个方面对昆白小鼠体外受精进行了研究。结果表明:1.添加10%NBS的KSOM和G1/G2培养液均能较好支持小鼠2-细胞胚胎发育到囊胚(89.52%和87.08%)。同时,添加10%FBS组的囊胚率也显着高于相应的添加BSA组(P<0.01)。2.筛选小鼠精子获能液中的肝素的最佳添加量。未添加肝素组受精率(41.75%)高于添加1μg/mL、3μg/mL及5μg/mL组(31.00%、18.80%、22.43%),差异显着。3.原装进口精子获能液HTF(MR-070)受精率(85.71%)显着高于自配的叁种体外受精HTF、T6、Whittingham的体外受精率(38.58%、10.22%、24.64%)。受精卵培养24h观察,HTF、T6、Whittingham中碎裂率(23.62%、20.44%、32.61%),显着高于原装HTF(3.57%)。4. G1/G2中培养的体外受精胚胎囊胚率达到77.50%,明显高于原装KSOM和自配KSOM组(22.78%、0)。5.与非共培养体系相比,颗粒细胞共培养,能够促进昆白小鼠胚胎克服2-细胞阻滞,显着提高小鼠体外受精胚胎的4-细胞(37.97%、59.72%)、桑椹胚(27.85%、48.61%)及囊胚率(22.70%、45.83%)。
杨培先[3]2007年在《Aroclor 1254对小鼠早期胚胎体外发育毒性的研究》文中指出本试验从体外培养小鼠2-细胞胚胎开始,在小鼠胚胎体外培养液中加入不同浓度剂量的Aroclor 1254,探讨Aroclor 1254对小鼠早期胚胎体外发育的影响,分析Aroclor 1254对小鼠早期胚胎发育的毒性机制。1.筛选了适合昆白系小鼠胚胎体外发育的培养体系。选择6,7,8,9和10周龄昆白系小鼠,进行超数排卵和配种,取出并计数2-细胞小鼠胚胎;将2-细胞胚胎分别放入体积分数10 %的胎牛血清(FBS)、牛血清(BS)和新生牛血清(NBS)的不同CZB培养液中取代牛血清白蛋白(BSA),并设BSA对照组;在胚胎放入含10 % NBS培养液的0,8,16和24 h的培养液中加入5.56 mmol/L葡萄糖浓缩液。结果,6,7,8,9和10周龄每只小鼠平均获取可用枚胚胎数分别为16.8,37.3,47.9,44.1和41.5枚,8周龄和9周龄小鼠可用胚率为90.9 %和89.9 %,显着高于6周龄和7周龄可用胚率(p<0.05);CZB培养液中含有体积分数为10 %的NBS的囊胚发育率(83.3 %)和孵化率(71.4 %)极显着高于体积分数10 %的FBS和BS组(30.6 %, 55.4 %)和(18.8 %, 43.0 %)(p<0.01);不添加组,0,8,16和24 h将培养的胚胎移入含有5.56 mmol/L葡萄糖的CZB培养液的桑椹胚率分别为58.7 %,0,75.9 %,90.5 %和78.8 %,囊胚率分别为30.4 %,0,53.1 %,84.6 %和41.7 %,16 h组极显着高于0,8 h和24 h组。结论认为,8周龄和9周龄的小鼠超排效果最佳;FBS、BS都不能有效代替BSA,NBS可以代替BSA取得较理想的试验结果;CZB中培养16 h换成含有葡萄糖的CZB液中培养,能更好的提高囊胚发育率(84.6 %)。2.探讨Aroclor 1254对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响。将小鼠2-细胞,分别培养于Aroclor 1254浓度为0.05,0.25,1.25μg/mL和6.25μg/mL的胚胎培养液中,并设Aroclor 1254溶剂对照组(添加乙醇)和空白对照组。结果表明,0.05μg/mL的Aroclor 1254会影响2-细胞胚的孵化(55.7 %),与溶剂对照组(66.7 %)差异显着(p<0.05);0.25μg/mL的Aroclor 1254组,2-细胞胚的囊胚发育率(72.5 %)及囊胚孵化率(23.2 %)与溶剂对照组(84.2 %,66.7 %)差异极显着(p<0.01);1.25μg/mL的Aroclor 1254组,2-细胞胚发育到8-细胞阶段的比率(32.1 %)极显着低于对照组(p<0.01);6.25μg/mL的Aroclor 1254组,2-细胞胚发育到4-细胞和8-细胞阶段的比率(58.1 %和29.6 %)极显着低于对照组(p<0.01)。结论认为,Aroclor 1254对小鼠2-细胞胚胎体外发育存在明显的剂量-毒性关系,随着培养液中Aroclor 1254浓度的增加,对小鼠早期胚胎的发育毒性表现地越早;胚龄越小,毒性敏感性越强。3.探讨Aroclor 1254对小鼠8-细胞胚胎体外发育的影响。将小鼠8-细胞胚胎,分别培养于Aroclor 1254浓度为0.05,0.25,1.25μg/mL和6.25μg/mL的胚胎培养液中,并设Aroclor 1254溶剂对照组(添加乙醇)和空白对照组。结果表明,0.05μg/mL的Aroclor 1254对8-细胞胚发育无明显影响;0.25μg/mL的Aroclor 1254会影响8-细胞胚的孵化(64.7 %),与溶剂对照组差异显着(p<0.05);1.25μg/mL的Aroclor 1254组,8-细胞胚囊胚发育率(68.6 %)及孵化率(25.5 %)极显着低于溶剂对照组(92.4 %,75.7 %)(p<0.01);6.25μg/mL Aroclor 1254组的8-细胞胚未能发育。结论认为,Aroclor 1254对小鼠8-细胞胚胎体外发育有毒性作用,存在明显的剂量——毒性关系。
宁国柱[4]2009年在《叁种生长因子和体细胞对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响》文中研究说明无透明带技术已经成为现代转基因动物生产、核移植和动物克隆领域的一项重要技术。然而目前无透明带胚胎的体外培养体系相对于完整透明带胚胎培养体系的研究相对较少。为完善无透明带胚胎体外培养体系,提高无透明带胚胎体外发育的质量,本试验在无血清培养基中分别添加了叁种生长因子EGF、hNGF-β和TGF-a,研究其对无透明带小鼠原核期胚胎的2-细胞、4-细胞、囊胚发育率,以及对囊胚回收率和囊胚细胞数的影响,并采用彗星电泳分别分析叁种生长因子对2-细胞、4-细胞和囊胚胚胎的凋亡情况。同时分别研究了小鼠颗粒细胞、输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞叁种体细胞共培养体系,以及在培养基中添加不同浓度的胎牛血清(FBS)对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响,获得如下结果:1.在无血清培养基KSOM+AA中添加适当浓度的叁种生长因子均可克服小鼠无透明带胚胎的2-细胞发育阻滞,0.01ng/ml EGF(88.0%)、0.01ng/ml hNGF-β(91.3%)、10ng/ml TGF-a(85.6%)添加组无透明带卵裂率均高于对照组(84.14%,P<0.05)。其中0.01ng/ml hNGF-β添加组卵裂率和囊胚发育率最高(91.3%,33%),但是在培养基中添加高浓度的叁种生长因子会对无透明带胚胎体外发育有明显的抑制作用。2.在无血清培养液KSOM+AA中添加0.01ng/ml EGF、0.01ng/ml hNGF-β10ng/ml TGF-a,其囊胚回收率、囊胚细胞数与对照组相比均差异性显着(P<0.05),0.01ng/ml EGF、0.01ng/ml hNGF-β添加组囊胚回收率最高,其囊胚回收率为89%,而10ng/ml TGF-a添加组囊胚细胞数最高,其囊胚细胞数为74。3.添加0.01ng/ml EGF、0.01ng/ml hNGF-β、10ng/ml TGF-a组可明显抑制胚胎细胞的凋亡,其中0.01ng/ml hNGF-β正常囊胚比对照组高10%左右,0.01ng/ml hNGF-β添加组其2-细胞无透明带胚胎严重凋亡比例最低(4%),而4-细胞和囊胚严重凋亡比例最低的为10ng/ml TGF-a组(7%,11%)。4.小鼠颗粒细胞、输卵管上皮细胞和子宫内膜细胞条件化的共培养体系对小鼠无透明带胚胎体外培养的卵裂率、4-细胞和囊胚发育率有明显的促进作用,优于对照组(P<0.05)。颗粒细胞(89.1%)与输卵管上皮细胞共培养组(89.4%)的卵裂率差异不显着(P>0.05),但均高于子宫内膜细胞共培养组(87.1%,P<0.05)。而子宫内膜组共培养组的囊胚发育率最高(34.6%),显着高于其它处理组(P<0.05)。5.在共培养体系中添加不同浓度的胎牛血清,5%的FBS组其卵裂率(89.0%)、囊胚发育率(36.7%)均高于对照组(87.1%,34.6%,P<0.05),但是10%的FBS组其卵裂率(85.1%)、囊胚发育率(29.6%)却低于对照组(P<0.05)。而培养基中添加0、5%、10%FBS其4-细胞发育率无显着差异(P>0.05)。
华进联[5]2005年在《人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究》文中指出原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
潘阳阳[6]2016年在《生长因子提高牦牛IVF、SCNT胚胎发育和卵母细胞冷冻适应性的机制研究》文中研究说明牦牛作为青藏高原地区重要物种资源,通过辅助繁殖技术提高其繁殖性能对我国“丝绸之路经济带”畜牧业的发展至关重要。为了提高体外生产牦牛胚胎的质量,阐明生长因子对牦牛体外胚胎发育的调控作用,及其对细胞凋亡的影响,并试图通过生长因子改善牦牛卵母细胞和胚胎冷冻技术,本研究进行了以下实验并取得了一定成果。(1)采用Real-time PCR和间接免疫荧光方法检测COCs成熟及体外受精胚胎发育过程中EGF及EGFR表达动态,分析EGF对牦牛卵母细胞成熟率、胚胎发育能力、囊胚质量的影响,并检测细胞凋亡相关基因的表达变化。研究发现卵母细胞成熟和胚胎发育各个时期均可表达EGF和EGFR,且成熟卵母细胞的表达水平高于未成熟卵母细胞,囊胚的表达水平高于其他发育时期的胚胎,EGFR的表达水平高于EGF。加入EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率、胚胎的发育能力和囊胚质量,最佳的作用浓度为100 ng·mL-1。EGF作用后成熟卵母细胞中促凋亡基因Bax表达显着降低(p?0.05),而抗凋亡基因Baxi的表达水平显着增加(p?0.05),囊胚中HSP70和Survivin的表达也可在100 ng·mL-1 EGF处理组中显着提高。结果表明牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中EGF和EGFR作为重要的自分泌或旁分泌因子,可通过调控Bax、Baxi、HSP70和Survivin等凋亡相关基因的表达提高牦牛卵母细胞和体外受精胚胎的发育能力。(2)运用Real-time PCR、WB和间接免疫荧光方法从基因和蛋白水平检测COCs成熟及体外受精胚胎发育过程中IGF-1及IGF-1R表达动态,同时在牦牛卵丘细胞体外培养、体外胚胎发育中加入不同浓度的IGF-1,分析卵丘细胞的凋亡率及凋亡相关基因的表达变化,及其对胚胎发育能力的影响。研究发现卵母细胞成熟和胚胎发育各个时期均可表达IGF-1和IGF-1R,成熟卵母细胞的表达水平高于未成熟卵母细胞,囊胚的表达水平高于其他发育时期的胚胎,IGF-1R的表达水平高于IGF-1、外源的IGF-1可以显着提高卵母细胞的成熟率、胚胎的发育能力和囊胚质量,浓度为100 ng·mL-1时,作用效果最佳。体细胞培养过程中IGF-1可以显着降低细胞凋亡率(p?0.05),在IGF-1浓度为100 ng·mL-1处理组中卵丘细胞的凋亡率最低,且Bax的表达水平最低,HSP70和Bcl-2的表达水平最高。研究结果表明,igf-1可调节卵丘细胞的hsp70、bax和bcl-2表达,降低细胞凋亡率,且igf-1在牦牛移植前胚胎发育过程中作为重要的生长因子,可以提高囊胚的形成和细胞增殖。(3)采集6月龄和24月龄牦牛睾丸组织,real-timepcr、wb和ihc方法从基因和蛋白水平分析牦牛睾丸发育过程中egf和egfr的表达变化;在牦牛冻精体外获能过程中加入不同浓度的igf-1,分析获能后精子的活性、评估不同处理组受精后胚胎的卵裂率,并采用real-timepcr、wb和间接免疫荧光方法从基因和蛋白水平检测igf-1对牦牛精子bax和bcl-2表达的变化。研究发现24月龄牦牛睾丸组织中egf和egfr的表达水平显着高于6月龄睾丸组织(p?0.05),egfr的水平高于egf,24月龄睾丸组织中表达更广,睾丸间质细胞、曲精小管肌上皮细胞、睾丸支持细胞、生殖细胞和精子均可表达egf和egfr。100ng·ml-1igf-1可以显着提高牦牛的精子活性(p?0.05),该处理组中受精后胚胎卵裂率也显着提高(p?0.05),而精子中bax基因的表达显着降低,bcl-2表达增加。综上表明生长因子可调控牦牛精子的生成和活性,从而促进后续胚胎的发育,且这种调控作用与细胞凋亡有关。(4)牦牛卵母细胞体外成熟过程中加入不同浓度的bmp6,分析卵母细胞成熟率、用成熟的卵母细胞生产克隆胚胎,并评估其发育能力,采用real-timepcr和间接免疫荧光方法分析2细胞胚胎和囊胚中h3k9ac,h3k18ac,和h3k9me3表达的变化,同时分析囊胚bax和bcl-2的表达。研究发现100ng·ml-1bmp6可以显着提高卵母细胞成熟率、克隆胚胎卵裂率和囊胚形成率(p?0.05),囊胚质量也有所提高。在bmp6处理组中,h3k9ac、h3k18ac、bcl-2基因表达增加、而bax、h3k9me3基因表达降低,h3k9ac,h3k18ac,和h3k9me3在2细胞克隆胚胎的表达差异更显着(p?0.05)。研究结果表明bmp6可以提高牦牛卵母细胞和后续克隆胚胎的发育潜能,其作用类似于其他osfs,且这种调节作用与其调控组蛋白修饰和细胞凋亡有关。(5)收集牦牛cocs,采用ct和ssv方法对其进行玻璃化冷冻,冷冻-解冻后分析不同处理组卵母细胞的成熟率和胚胎发育能力,采用real-timepcr、wb从基因和蛋白水平检测成熟卵母细胞、卵裂胚胎、和囊胚中hsp90的表达变化;同时在牦牛卵母细胞体外成熟过程中加入不同浓度的igf-1,分析卵母细胞的成熟率和CIRP的表达水平,将不同处理组成熟的卵母细胞采用CT法玻璃化冷冻,冷冻解冻后进行孤雌激活,分析胚胎的发育能力。研究发现CT和SSV冷冻组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率比较接近、其中成熟率和卵裂率显着低于对照组(p?0.05),HSP90的表达水平也低于对照组,而叁组囊胚率和HSP90的表达水平比较接近。100 ng·mL-1 IGF-1可以提高成熟卵母细胞CIRP表达和卵母细胞的成熟率,冷冻-解冻后孤雌激活胚胎的卵裂率和囊胚率有所提高,但囊胚质量差异不显着。结果表明CT和SSV玻璃化冷冻方法对牦牛未成熟卵母细胞具有相同的冷冻效果,且其对发育能力的影响主要集中在成熟期到早期卵裂期,并与HSP90的表达水平有一定关联性,而卵母细胞成熟过程中IGF-1可以调控CIRP的表达,提高成熟卵母细胞对低温的适应能力,降低低温对卵母细胞损伤,从而提高后续发育能力。
吴曙限[7]2009年在《黄牛卵母细胞的体外成熟培养和孤雌胚胎体外培养体系的优化》文中提出动物克隆技术在人们的生产生活中有着广阔的应用前景。但目前的克隆技术还不够成熟,还处于不断的发展中,克隆技术的完善依赖于人们对克隆机理的研究。制约胚胎工程进一步发展的瓶颈是卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养技术,体外培养体系的不完善导致卵母细胞和胚胎代谢及基因表达的紊乱,从而导致体外生产胚胎效率和质量的下降,因此进一步完善卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养体系具有重要的理论及实践意义。本研究着重于模拟体内环境,系统研究了卵母细胞成熟培养和孤雌胚胎体外培养的各种条件,以期建立一套稳定胚胎体外培养体系。1.以牛卵巢为材料,研究了不同培养温度、培养时间、卵丘细胞和卵泡液对卵母细胞体外成熟的影响。对不同浓度ITS在卵母细胞体外成熟中的作用进行了比较。结果表明,①体外培养温度37℃和38.5℃、39℃下的卵母细胞成熟率相比差异显着(P<0.05)。38.5℃的卵母细胞成熟率与39℃的成熟率无显着差异(P>0.05)。②体外成熟18h-30h的卵母细胞,随着时间延长,成熟率和卵裂率有上升趋势。卵母细胞成熟24h或30h囊胚的发育率(40.53%,35.38%)明显高于18h的囊胚发育率(25.85%)(P<0.05)。③周围卵丘细胞层3-8层和少于3层的卵母细胞中,成熟率前者显着高于后者(P<0.05);孤雌胚都能正常卵裂,并前者获得了33.33%囊胚,而但后者都未发育至囊胚。④在成熟液中添加ITS能显着提高卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率,而且添加10μL/mL ITS组略高于添加5μL/mL ITS组,但差异不显着(P>0.05)。⑤含有卵泡液组的卵母细胞成熟率均高于对照组,特别是含10%组中卵裂率(66.72%)和囊胚率(42.53%),显着高于其它添加组。2.研究了不同胎龄、消化液、培养液对转绿色荧光蛋白基因小鼠胚胎成纤维细胞分离和培养的影响,并对其生长形态进行观察。结果表明,在实验室条件下,12. 5～14. 5 d胎龄的GFP -MEF分离效果最好,0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高;GFP -MEF形态以小梭形为主,呈漩涡状、鱼群状生长;最佳培养液为DMEM添加10 %胎牛血清。研究获得了实验室分离制备GFP-MEF的方法,为制作饲养层和进一步构建转基因动物奠定基础。3.研究了牛胚胎体外培养过程中不同换液体积及血清灭活与否对黄牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响,结果表明,以SOFaa为基础培养液,在更换培养液体积1/2组与1/4组和3/4组之间的黄牛孤雌胚胎囊胚率有显着差异(P<0.05),分别为38.84%、23.39%和21.71%;不同处理的血清添加组的卵裂率、囊胚率和孵化囊胚率均无显着差异(P>0.05)。
彭辉[8]2008年在《黄牛孤雌胚胎体外培养体系的优化及体细胞核移植胚构建初探》文中认为本试验通过在成熟基础液中添加不同浓度的HMG(人尿促性素)和ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠)以观察对黄牛卵母细胞体外成熟率的影响,分析了卵巢运输过程中保存温度和时间及卵巢所处性周期阶段与黄牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的关系;探讨了培养过程中培养微滴大小、每次换液量、添加血清是否灭活及血清添加时间和添加浓度对黄牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响,并比较了4种培养液的培养效果;研究了有无颗粒细胞单层、不同类型及种属的颗粒细胞单层、颗粒细胞单层体外培养时间及在不同时间更换培养单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响,旨在优化黄牛孤雌胚胎体外培养体系;对以黄牛颗粒细胞为核供体,去核卵母细胞为核受体构建核移植胚胎进行了初步探讨。结果如下:1.在成熟基础液中添加0.05IU/mL和0.1IU/mL的HMG卵母细胞成熟率极显着高于0.025 IU/mL组(71.26%,74.30%/31.52%;P<0.01);而添加10μL/mL ITS则对卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大(71.52%/69.47%;84.96%/ 82.42%),但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67%/32.0%);就卵母细胞成熟率和囊胚率而言,卵巢置于20～29℃保存(61.11%/33.33%)与10～19℃(41.18%/17.65%)和30～39℃保存(71.34%/41.84%)无显着差异(P>0.05),但后两组之间差异显着(P<0.05);30～39℃中保存1～3h抽出的卵母细胞较保存8～10h抽出的卵母细胞有较高的成熟率、卵裂率和囊胚发育率(68.57%/32.29%,86.11%/25.81%,40.32%/0;P<0.05);黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率,但差异不显着(P>0.05)。2.与50μL组和200μL组相比,黄牛孤雌胚胎体外培养在100μL微滴中可以获得较高的囊胚率,3组之间无显着差异(43.20%/31.34%/38.82%) (P>0.05);每次更换培养液体积的1/2组比每次更换1/4组和3/4组更有利于黄牛孤雌胚胎的体外发育,就囊胚率而言有显着差异(41.84%/26.39%/25.71%)(P<0.05);添加的血清是否进行灭活对牛孤雌胚胎体外发育的影响不大,未灭活组的囊胚率和孵出囊胚率(40.23%/57.14%)略优于灭活组(38.95%/51.35%)。在黄牛卵母细胞孤雌激活后的第3d添加血清可得到较高的囊胚率和孵出囊胚率(46.55%/53.70%),而以孤雌激活后的第3d添加10%FBS囊胚发育率最高(45.97%);综合卵裂率和囊胚发育率,对4种培养液比较后认为黄牛孤雌胚胎的体外培养液应首选SOFaa。3 .孤雌胚胎体外培养时有颗粒细胞单层组的卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率(85.10%/41.81%/52.70%)较对照组(66.13%/7.32%/0%)均差异显着(P<0.05);壁颗粒细胞和丘颗粒细胞单层均能较好地支持黄牛孤雌胚胎的体外发育,其卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率分别为86.11%/ 83.72%、40.32% /41.67%、52. 0% /53.33%,无显着差异(P>0.05);来自黄牛、猪和小鼠的颗粒细胞单层在支持黄牛孤雌胚胎体外发育方面无种属特异性,其卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率分别为83.42% / 85.16% / 82.58%、42.17% / 41.67% / 39.45%、54.29% / 52.73% / 48.84%,3组之间无显着差异(P>0.05);将培养2d和4d后的颗粒细胞单层分别用于胚胎的体外共培养,其卵裂率和囊胚发育率与对照组相比差异不显着(P>0.05),但4d组与对照组之间差异显着(P<0.05),3组在孵出囊胚率方面均无显着差异(P>0.05);就囊胚发育率而言,共培养的第3/6d两次更换单层与共培养的第4d更换单层和始终不更换单层的对照组相比无显着差异(P>0.05),但第4d更换单层与对照组相比差异显着(P<0.05),3组在孵出囊胚率方面差异不显着(P>0.05)。4.将卵母细胞在体外成熟培养17～19h、19～21h和21～23h后分别进行去核并构建核移植胚胎,3组的卵裂率和囊胚率无显着差异(P>0.05),17～19h组和19～21h组的去核率高于21～23h组且差异显着(P<0.05),而19～21h组的囊胚发育率优于其它两组;卵母细胞体外成熟培养19～21h后去核并构建核移植胚胎,经体外培养1～3h、3～5h和5～7h后再进行激活,结果表明核移植胚胎在体外培养3～5h进行化学激活可以得到较高的卵裂率(75.0%)和囊胚发育率(11.46%)。
董彬[9]2008年在《添加筛选的中药培养液对小鼠体外受精及胚胎发育的影响》文中提出中药是我国特有的资源,中药中的有效成分在动物繁殖中治疗不孕症、流产、保胎及促进精子活力等方面作用突出,还具有抗过氧化效应、清除自由基、促进卵母细胞成熟和细胞增殖等作用。共培养是近10多年来在胚胎培养方面最引人注目的变革之一。共培养能改善胚胎的形态、促进卵裂并有较高的细胞数、提高囊胚的形成率及孵化率。目前,胚胎体外生产技术的累积效率还很低,卵母细胞的存活力与异常卵母细胞的产生也是制约胚胎体外生产的瓶颈之一。本研究旨在探讨一种稳定的适合小鼠子宫内膜上皮细胞培养的方法,筛选能促进体外受精及胚胎体外发育的中药添加剂,并探讨其合适的添加时间,从而构建一种理想的培养体系,以提高胚胎体外生产的累积效率。本试验为了研究适宜的中药培养液对小鼠体外受精及胚胎发育的影响,进行了叁个阶段试验研究:第一阶段是筛选了适合于小鼠子宫内膜上皮细胞的培养方法,获得了高纯度子宫内膜上皮细胞;第二阶段在小鼠胚胎不同培养阶段在培养液中分别加入叁种中药添加剂,观察其对体外受精及胚胎体外发育的影响,筛选适宜的中药培养液并确定其合适的添加时间;第叁阶段结合前两项试验结果,构建新的共培养体系,观察小鼠体外受精胚胎体外发育的效果。试验结果表明:(1)采用酶消化法可以获得小鼠子宫内膜上皮细胞,但酶会影响细胞活力,致使细胞增殖缓慢,且酶消化法获得的上皮细胞纯度不高;采用子宫翻转组织块培养法培养小鼠子宫内膜上皮细胞,细胞活力高,增殖速度快,可以获得较好的原代培养效果。该方法为下一步研究胚胎共培养提供了可靠的体细胞来源。(2)经筛选试验表明,0.5mg/L川芎嗪与4mg/L黄芩苷对小鼠体外受精及早期胚胎发育的作用并不十分显着(P>0.05),且会延缓2-细胞阶段以后胚胎体外发育的速度; 0.1mg/L小檗碱在体外受精过程中能显着提高受精卵存活率(49.5%对照组7.5%,P<0.05),但会严重阻碍受精卵后续阶段的胚胎培养(P<0.05)。(3)共培养体系能显着降低2-细胞发育阻滞率(46.2%对照组34.2%,P<0.05)。
徐小明[10]2006年在《胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离》文中提出本研究以猪不同类型的细胞为供核细胞,体外成熟去核卵母细胞为受体胞质在体外构建胚胎,建立了体外生产体细胞核移植胚胎的技术体系,为体细胞克隆猪及核移植源胚胎干细胞(ntESCs)系的分离提供良好的平台。论文主要从以下5个方面进行了研究:1.供核细胞的准备共从4例胎儿肌肉组织中分离得到4个猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, pFF)株,从1例新生猪耳组织中用组织块培养法分离得到一个耳部皮肤成纤维细胞(porcine ear skin fibroblasts, pESF)株,从3例胎猪骨髓中分离得到3个胎猪骨髓间充质干细胞(porcine fetal mesenchymal stem cells, pFMSCs)株。将1~5代的pFF、pESF及pFMSCs分别进行冷冻保存,解冻复苏后形态及活力没有明显变化。pFMSCs形态为成纤维样,呈长梭形,连续传13代后形态没有明显改变。传代培养的pFMSCs生长潜伏期为1~2 d ,之后进入对数增殖期,接种后的第6天进入平台期。透射电镜分析表明,pFMSCs细胞核质比高,胞浆中细胞器少。核型分析表明,pFMSCs具有正常的核型(2n=38,XY)。流式细胞仪检测显示,pFMSCs表达细胞表面抗原CD44,CD166,CD105,CD117,不表达CD45,CD90,CD11a,CD14。在β-巯基乙醇作用下,pFMSCs可诱导分化为神经样细胞,Nestin染色阳性。经血清饥饿和接触抑制处理的pFMSCs,流式细胞仪检测G0/G1期的细胞分别为86.72%和88.44%。以上细胞的分离培养为猪体细胞核移植相关研究打下了基础。2.猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集猪卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:①mM199组猪卵母细胞成熟率显着高于M199组(71.7% vs 59.7%)(p<0.05),mM199组和M199组较NCSU-23组(43.6%)均能显着提高卵母细胞的成熟率(p<0.01)。②PMSG+hCG+FSH组卵母细胞成熟率略高于FSH+LH组,二组卵母细胞成熟率显着高于hMG组(p<0.01)。③分别添加FBS和PFF与对照组(分别不添加FBS和PFF)成熟率无统计学上的差异,但电激活后,均能显着提高卵裂率(p<0.05),桑囊率二者无显着差异(p>0.05)。④单独添加EGF和联合添加EGF和ITS卵母细胞成熟率较不添加组稍有提高。电激活后,均能显着提高桑囊率(p<0.05)。⑤选择颗粒细胞层数3层以上的COCs可以显着提高卵母细胞体外成熟率
参考文献：
[1]. 小鼠胚胎共培养：体细胞状态影响及作用机理[D]. 谭秀文. 山东农业大学. 2004
[2]. 昆白系小鼠体外受精[D]. 刘淑娟. 西北农林科技大学. 2007
[3]. Aroclor 1254对小鼠早期胚胎体外发育毒性的研究[D]. 杨培先. 西北农林科技大学. 2007
[4]. 叁种生长因子和体细胞对无透明带小鼠胚胎体外发育的影响[D]. 宁国柱. 西北农林科技大学. 2009
[5]. 人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究[D]. 华进联. 西北农林科技大学. 2005
[6]. 生长因子提高牦牛IVF、SCNT胚胎发育和卵母细胞冷冻适应性的机制研究[D]. 潘阳阳. 甘肃农业大学. 2016
[7]. 黄牛卵母细胞的体外成熟培养和孤雌胚胎体外培养体系的优化[D]. 吴曙限. 西北农林科技大学. 2009
[8]. 黄牛孤雌胚胎体外培养体系的优化及体细胞核移植胚构建初探[D]. 彭辉. 西北农林科技大学. 2008
[9]. 添加筛选的中药培养液对小鼠体外受精及胚胎发育的影响[D]. 董彬. 西北农林科技大学. 2008
[10]. 胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离[D]. 徐小明. 西北农林科技大学. 2006