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重组绵羊FSH在CHO悬浮细胞中的表达及其初步应用

2020-12-08阅读(739)

重组绵羊FSH在CHO悬浮细胞中的表达及其初步应用

论文摘要

促卵泡激素FSH是由垂体前叶嗜碱性细胞合成并分泌的一种糖蛋白类促性腺激素,由α亚基和β亚基通过非共价键结合而形成,常用于增进动物的快速繁殖,诱导雌性动物超数排卵。兽用促卵泡激素FSH多数是采用从垂体中提取,人用FSH一般是采用尿源性的FSH,即从绝经期妇女尿液中提取,但是生产成本依旧较高,且纯度无法达到99%。如果进一步提高纯度,成本只会更加昂贵。因此本研究使用重组DNA技术对重组绵羊FSH进行分泌表达并对其进行应用研究。首先对重组绵羊促卵泡激素FSH序列进行设计,构建重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα。构建好的重组表达质粒通过电转染至CHO-K1细胞中,转染后利用G418筛选出单克隆细胞M-FSH-βα-B31A4,单克隆细胞表达重组绵羊FSH的含量达到350 ng/mL。使用5 L生物反应器对单克隆细胞进行培养,培养68 h收集细胞上清液。之后采用分子量为10 kD的膜包对细胞上清液超滤浓缩,得到531ng/mL的重组绵羊促卵泡激素FSHβα。重组绵羊促卵泡激素FSHβα制备完成后,采用多次皮下注射雌鼠的方法进行试验,注射一次后,间隔一天再次进行注射,72 h后对雌鼠进行眼球采血,收集血清进行黄体生成素LH和孕酮Pg的ELISA检测,其含量显著上调。雌鼠处死后解剖取其卵巢,观察卵巢大小并称重,卵巢重量显著增大。综上所述,本研究成功构建合成了重组表达质粒pcNDA3.1-FSHβα,表达质粒成功转染至CHO细胞中,经过筛选获得了单克隆细胞。单克隆细胞表达的重组蛋白经过超滤浓缩,获得了更高浓度的重组绵羊FSH。通过小鼠试验,发现重组绵羊FSH对小鼠具有一定的生物活性,能促进卵巢增大,生殖因子显著上调,为下一步工业化应用奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一章 绪论
  •   1.促卵泡激素的研究进展
  •     1.1 促卵泡激素的结构和机制
  •     1.2 促卵泡激素的研究与应用
  •     1.3 重组FSH研究进展
  •     1.4 重组FSH的分离纯化
  •   2.CHO细胞真核表达系统研究进展
  •     2.1 CHO细胞简介
  •     2.2 CHO细胞无血清培养研究进展
  •     2.3 搅拌式细胞生物反应器
  •   3 本论文的立项依据及研究意义
  • 第二章 重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα的构建
  •   1 材料及仪器设备
  •     1.1 主要材料
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 仪器设备
  •   2 方法
  •     2.1 目的基因序列设计
  •     2.2 密码子优化后序列比对
  •     2.3 序列的信号肽分析
  •     2.4 获取重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα
  •     2.5 重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα验证
  •   3 结果
  •     3.1 目的基因序列设计
  •     3.2 重组表达质粒pcDNA3.1-FSHβα验证
  •   4 小结与讨论
  • 第三章 绵羊FSH全悬浮CHO单克隆细胞的制备
  •   1 材料及仪器设备
  •     1.1 主要材料
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 仪器设备
  •   2 方法
  •     2.1 FSH蛋白含量的ELISA检测
  •     2.2 重组质粒pcDNA3.1-FSH-βα电转染全悬浮CHO-K1-S2 细胞
  •     2.3 CHO-K1-S2-FSH单克隆细胞筛选
  •   3 结果
  •     3.1 FSH蛋白含量的ELISA检测
  •     3.2 重组质粒pcDNA3.1-FSH-βα电转染全悬浮CHO-K1-S2 细胞
  •     3.3 CHO-K1-S2-FSH单克隆细胞筛选
  •   4 小结与讨论
  • 第四章 单克隆细胞生物反应器培养
  •   1 材料及仪器设备
  •     1.1 主要材料
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 仪器设备
  •   2 方法
  •     2.1 摇瓶中培养CHO-FSH-βα细胞表达FSH条件优化
  •     2.2 艾贝泰5L细胞生物反应器操作方法
  •     2.3 CHO-K1-S2 全悬浮细胞生物反应器培养条件探究
  •     2.4 CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 单克隆细胞的生物反应器培养
  •   3 结果
  •     3.1 摇瓶中培养CHO-FSH-βα细胞表达FSH条件优化
  •     3.2 艾贝泰5L细胞生物反应器的准备
  •     3.3 CHO-K1-S2 全悬浮细胞生物反应器培养条件探究
  •     3.4 CHO-K1-S2-FSHβα-B31A4 单克隆细胞的生物反应器培养
  •   4 小结与讨论
  • 第五章 重组绵羊FSH超滤及生物活性初探
  •   1 材料及仪器设备
  •     1.1 主要材料
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 仪器设备
  •   2 方法
  •     2.1 重组绵羊FSH蛋白超滤
  •     2.2 重组绵羊FSH生物活性初探
  •   3 结果
  •     3.1 重组绵羊FSH蛋白超滤
  •     3.2 重组绵羊FSH生物活性初探
  •   4 小结与讨论
  • 第六章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 硕士期间已发表论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王兴陇

    导师: 马忠仁,冯若飞

    关键词: 绵羊促卵泡激素,重组,细胞,生物反应器,生物活性

    来源: 西北民族大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北民族大学

    基金: 教育部“创新团队发展计划”(IRT_17R88)

    分类号: S826;Q78

    DOI: 10.27408/d.cnki.gxmzc.2019.000409

    总页数: 68

    文件大小: 2288K

    下载量: 88

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