变形链球菌中必需蛋白酶FtsH的功能研究

论文摘要

生命体离不开蛋白质,它是生命特征的物质基础,具有催化、运输和储存、免疫保护等功能,生命体的存在方式是这些蛋白质化学组份的不断自我更新,而自我更新过程就需要蛋白酶工具来完成,蛋白酶是细胞用来调控特定蛋白和消除错误折叠蛋白的,是生命体想要维持体内稳态、保持细胞结构、适应环境突变的重要工具。AAA蛋白酶家族,是一种膜结合蛋白控制体系,是依赖于ATP、金属Zn2+的蛋白酶,它具有蛋白酶活性,同时兼具分子伴侣活性,能够对细菌、叶绿体、线粒体等中膜蛋白进行修复与降解。AAA蛋白酶大家族中的FtsH蛋白酶（Filamentation Temperature-Sensitive H）是由ftsH基因编码的重要蛋白:参与生命体内正常的代谢生长调节、应激反应、环境胁迫、蛋白质量平衡控制等过程。以变形链球菌Streptococcus mutans UA159为主体,研究AAA蛋白酶家族中FtsH蛋白酶:（1）变形链球菌Streptococcus mutans UA1 59菌株中,不能正常获得ftsH敲除突变株,表明ftsH可能是必需基因。构建ftsH木糖诱导表达菌株,该菌株的生长依赖于木糖的添加,进一步证实ftsH是必需基因。（2）对变形链球菌Streptococcus mutans UA159进行ARTP诱变,对诱变后的菌株进行ftsH的敲除,成功筛选到ftsH敲除突变株S517。表明在S517中包含FtsH的遗传抑制子（Suppressor）突变。（3）对S517进行全基因组测序,通过SNP分析并结合重转化实验最终将Suppressor 突变定位于 VicR（SMU1517）。（4）vicR基因编码响应调节因子（Response Regulator）,与vicK共同构成双组份信号转导系统,VicRK是变形菌中唯一的一套必需双组分调控系统。本研究首次揭示VicRK双组份信号转导系统与FtsH蛋白酶调控系统存在紧密遗传联系。基于此发现,我们提出了 FtsH参与细胞生长的调控机制假说,为FtsH类蛋白酶调控机制的最终阐明打下良好基础。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 引言

1.2 蛋白酶的重要性

1.3 国内外研究动态及发展趋势

1.4 FtsH蛋白酶的生物信息

1.4.1 FtsH蛋白酶的发现

1.4.2 FtsH蛋白酶的结构

1.4.3 FtsH蛋白酶必需性

1.5 实验课题研究思路

1.5.1 菌株的特性简介

1.5.2 研究背景及意义

1.5.3 研究内容

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株及质粒

2.1.2 药品、试剂

2.1.3 仪器、设备

2.1.4 培养基及溶液

2.2 实验方法

2.2.1 Streptococcus mutans UA159野生型基因组的获取

2.2.2 Streptococcus mutans UA159的转化

2.2.3 质粒常规提取

2.2.4 pDL278载体介绍

2.2.5 Streptococcus mutans的敲除原理

2.2.6 Streptococcus mutans木糖诱导系统构建

2.2.7 野生型菌株的诱变

2.2.8 诱变菌株的敲除

2.2.9 突变点预测分析

2.2.10 预测突变点的初步定位

2.2.11 预测突变点的最终定位

2.2.12 构建vicR*点突变的菌株

2.2.13 vicR*点突变菌株敲除ftsH的验证

2.2.14 野生型菌株与vicR*点突变菌株转化的对比

3 结果与讨论

3.1 FtsH蛋白酶相关的生物学信息

3.2 木糖诱导系统构建部分

3.2.1 xylose诱导系统组份元件扩增

3.2.2 xylose诱导系统3个元件的回收及组装

3.3 筛选xylose诱导系统构建成功的菌株

3.4 筛选携带突变且可ΔftsH的菌株

3.4.1 诱变前菌体浓度预实验

3.4.2 对野生型菌株进行ARTP诱变

3.4.3 携带突变菌株敲除ftsH的筛选

3.5 突变点的预测及分析

3.5.1 S517（△ftsH/Suppressor+）菌株中突变点预测

3.5.2 筛选野生型菌株可敲除ftsH的菌株

3.5.3 预测突变点的测序分析

3.6 突变点的定位

3.6.1 单个突变、双突变点的扩增

3.6.2 单个突变点、双突变点的转化结果

3.6.3 单个突变点、双突变点的最终定位

3.7 vicR*点突变菌株的构建

3.7.1 构建IFDC2插入至vicR、vicK之间的片段

3.7.2 筛选IFDC2成功插入vicR、vicK之间的菌株

3.7.3 筛选vicR*突变的菌株

3.7.4 vicR*突变菌株的测序验证

3.8 S685（vicR*点突变菌株）的敲除验证

3.9 野生型菌株与vicR*点突变菌株转化比对结果

3.10 FtsH与VicR的关系

3.10.1 VicR信息的相关介绍

3.10.2 FtsH与VicR相互作用的假说

4 结论

4.1 全文总结

4.2 文章的创新性及猜想

4.3 文章的不足之处

5 展望

6 参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

8 致谢

附图1

附图2

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蔡佳佳

导师: 刘浩

关键词: 蛋白酶,双组份信号转导,变形链球菌

来源: 天津科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津科技大学

分类号: Q936

DOI: 10.27359/d.cnki.gtqgu.2019.000006

总页数: 78

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