导读:本文包含了抗瘤免疫论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:树突,细胞,肿瘤,粒细胞,免疫,白细胞,抑制。
抗瘤免疫论文文献综述
徐培淇[1]（2017）在《二甲双胍抑制G-MDSCs的免疫功能及其在小鼠抗瘤免疫应答的研究》一文中研究指出目的:二甲双胍(metformin)体外处理小鼠粒细胞样髓源抑制性细胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs),观察 G-MDSCs 免疫抑制功能的变化,检测G-MDSCs相关效应分子的表达变化,并探讨可能的作用机制;在CT-26荷瘤小鼠体内,研究二甲双胍是否能够通过调控G-MDSCs的功能影响肿瘤的生长。方法:(1)使用皮下注射CT-26细胞的方式构建结肠癌荷瘤小鼠模型,采取MACS分离荷瘤小鼠脾脏中的G-MDSCs。经二甲双胍作用后,使用Western-blot技术检测STAT3磷酸化的表达水平;利用CFSE检测G-MDSCs对CD4+T细胞的免疫抑制功能的变化;流式细胞术(FCM)检测G-MDSCs中的活性氧(reactive oxygen specise,ROS)的表达情况;精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性。(2)将分离得到的G-MDSCs在体外经二甲双胍刺激后,通过Western-blot检测G-MDSCs中AMPK的磷酸化水平。利用AMPK抑制剂(Compund C)抑制G-MDSCs中AMPK分子的磷酸化,再经二甲双胍作用,Western-blot检测细胞中AMPK以及STAT3分子的磷酸化;CFSE检测G-MDSCs的免疫抑制功能;FCM检测G-MDSCs中的ROS的表达情况;精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性。(3)对荷瘤小鼠进行腹腔注射二甲双胍。观察小鼠皮下肿瘤的生长情况,观察肿瘤大小并测量其体积;FCM检测总MDSCs、G-MDSCs、CTLs、Th1及Treg细胞的比例。(4)分离经二甲双胍处理的荷瘤小鼠脾脏G-MDSCs,CFSE检测G-MDSCs的免疫抑制功能;FCM检测G-MDSCs中的ROS的表达情况;精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性;运用Western-blot技术检测G-MDSCs中STAT3分子的磷酸化水平。结果:(1)从荷瘤小鼠脾脏中分选出的G-MDSCs经二甲双胍处理后,结果显示二甲双胍能够下调其STAT3磷酸化水平(P<0.05);二甲双胍明显减弱G-MDSCs对CD4+T细胞的免疫抑制功能(P<0.01)并显着抑制G-MDSCs精氨酸酶活性以及ROS表达水平(P<0.05)。(2)G-MDSCs经二甲双胍处理后AMPK磷酸化水平明显上调(P<0.05)。在G-MDSCs培养体系中加入Comound C预处理,再加入二甲双胍处理后,G-MDSCs中AMPK的磷酸化水平与对照组相比明显下调(P<0.05),但STAT3的磷酸化水平显着上调(P<0.05);G-MDSCs对CD4+T细胞的免疫抑制功能与对照组相比显着增强(P<0.001);ROS表达水平较对照组明显升高(P<0.05);精氨酸酶活性则无明显变化。(3)与生理盐水对照组相比,二甲双胍处理组肿瘤生长速度减缓(P<0.01),肿瘤体积减小,肿瘤重量减轻(P<0.01);FCM结果显示:二甲双胍处理后,小鼠体内浸润的总 MDSCs(P<0.05)、G-MDSCs(P<0.01)、Tregs(P<0.001)的比例较对照组明显降低;CTLs、Th1较对照组显着升高(P<0.05)。(4)与生理盐水对照组相比,二甲双胍处理组小鼠脾脏G-MDSCs的免疫抑制功能明显下降(P<0.001);ROS表达水平明显下降(P<0.05);ARG-1活性显着降低(P<0.05,P<0.01);G-MDSCs中STAT3磷酸化水平明显下调(P<0.01)。结论:(1)二甲双胍在体外能够通过增强AMPK的磷酸化,抑制STAT3分子的磷酸化水平,从而下调G-MDSCs的免疫抑制功能。(2)在荷瘤小鼠体内,二甲双胍能通过下调G-MDSCs的免疫抑制功能从而延缓肿瘤的生长。(本文来源于《江苏大学》期刊2017-06-12）
田新宇[2]（2017）在《LncRNA AK 036396对粒细胞样髓源抑制性细胞免疫抑制功能的调控机制及其在抗瘤免疫中的作用》一文中研究指出目的:恶性肿瘤目前已经成为人类死亡的主要疾病,尽管针对肿瘤的靶向治疗发展迅速,但是总体治疗效果仍然不够理想。大量临床研究表明,肿瘤的免疫逃逸是造成肿瘤治疗失败的主要因素。本研究中,我们通过探索长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA ) AK036396对粒细胞样髓源性抑制细胞(Granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)发育及功能的调控,寻找肿瘤免疫治疗的新靶点。方法:1.采用Arraystar LncRNA表达谱芯片技术检测在野生型小鼠脾脏来源CDllb+Ly6G+细胞与荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中表达的lncRNA,筛选出表达呈现明显差异的lncRNA,并利用实时荧光定量定量PCR(realtimefluorescene quantitative PCR, qRT-PCR)进行进一步的确认;利用 qRT-PCR 分析 lncRNA AK036396在不同髓系细胞以及不同发育阶段G-MDSCs中的表达。2.分析Arraystar LncRNA表达谱芯片,筛选出lncRNA可能调控的靶分子,并使用qRT-PCR进行进一步验证。利用qRT-PCR与Western-blot检测在不同髓系细胞中靶分子Fcnb的表达情况。利用特异性siRNA抑制G-MDSCs中lncRNA AK036396的表达后,利用qRT-PCR与Western-blot检测细胞中靶分子Fcnb的表达变化。3.利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH )确定 lncRNA AK036396在G-MDSCs细胞中定位;利用RNA pull down与RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验确认 lncRNA AK036396与Fcnb蛋白是否存在结合;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白合成抑制剂环已酰亚胺(Cycloheximide, NCX )(40μg/mL),随后利用 Western-blot 确认 lncRNAAK036396 对 Fcnb 蛋白稳定性的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白酶体抑制剂MG132 (20pM),随后利用Western-blot确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白稳降解的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,随后通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白泛素化的调控。4.为了确认Fcnb与G-MDSCs发育及功能的联系,利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,检测①利用qRT-PCR检测细胞中CD244的表达;②G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测精氨酸酶1 (Arginase1,Arg1)活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测活性氧(Reactive oxygen species, ROS)表达。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②使用FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR检测肿瘤来源G-MDSCs中CD244表达情况;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部CD3+CD4+IFN-γ+ T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T细胞比例。6.为了确定lncRNA AK036396对G-MDSCs发育及功能的调控,利用小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396后,①检测G-MDSCs发育变化,其中包括:使用qRT-PCR和Western-blot检测Fcnb的表达、使用qRT-PCR检测CD244的表达、通过瑞氏-吉姆萨染色检测细胞形态学改变;②检测G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR与Western-blot检测肿瘤局部G-MDSCs中Fcnb的表达,利用qRT-PCR检测肿瘤局部G-MDSCs中CD244的表达;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部 CD3+CD4+IFN-γ+ T 细胞和 CD3+CD8+IFN-γ+ T 细胞比例。8.利用qRT-PCR检测肺癌患者外周血单个核细胞(PBMCs)中小鼠Fcnb同源物M-ficolin的表达水平,并分析M-ficolin的表达水平与肺癌发展之间的联系。结果:1.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,lncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P<0.001);与外周成熟中性粒细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)以及肿瘤来源 M-MDSCs (P<0.001)相比,lncRNAAK036396 在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中高表达;lncRNAAK036396的表达随着G-MDSCs分化发育逐渐下降(P<0.05)。2.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,Fcnb在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P<0.01);与外周成熟中性粒细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)以及肿瘤来源M-MDSCs (P<0.001)相比,Fcnb在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中的表达水平最高;在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,FcnbmRNA (P<0.05)与蛋白(P<0.05)表达发生显着下调。3.通过FISH实验发现lncRNAAK036396主要位于肿瘤来源G-MDSCs细胞核中;通过RNA pull down和RIP实验证实lncRNAAK036396与Fcnb蛋白之间存在相互结合;Western-blot结果显示在抑制G-MDSCs中lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白稳定性显着下调;Western-blot结果显示在抑制蛋白酶体活性后,siAK036396无法继续下调Fcnb蛋白稳定性;IP结果显示,抑制lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白结合的泛素水平显着升高。4.利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,①CD244的表达显着下调(P<0.01);②Arg1活性显着下调(P<0.05)、ROS表达显着下调(P<0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P<0.05)。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P<0.05);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显着下调(P<0.05);③肿瘤来源G-MDSCs中CD244的表达显着下降(P<0.05);④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P<0.01)、ROS表达(P<0.05)均发生显着下调;⑤脾脏(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例出现显着上调。同时,脾脏(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例出现显着上调。6.在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,①Fcnb(P<0.05)和CD244 (P<0.01)表达均发生显着下调,G-MDSCs形态学特点由杆状核为主分页核少见转变为多见分页核;②Arg1活性显着下调(P<0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P<0.05),但是ROS的表达未出现显着变化(ns=no significance)。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P<0.001);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显着下调(P<0.01);③肿瘤局部来源G-MDSCs中Fcnb (P<0.01)与CD244 (P<0.001)的表达显着下调;④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P<0.05)与ROS的表达(P<0.001)发生显着下调;⑤脾脏(ns)、引流淋巴结(ns)、肿瘤局部(ns) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例未出现显着变化。但是脾脏(P<0.05)、引流淋巴结(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例均出现显着升高。8.与健康对照相比较,肺癌患者PBMCs中M-ficolin (小鼠Fcnb的同源物)的表达水平显着升高(P<0.05)。肺癌患者PBMCs中M-ficolin表达水平与MDSCs比例及Arg1表达水平呈现明显的正相关(P<0.01, P<0.05)。且M-ficolin的表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P<0.05)密切相关。结论:LncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中的表达呈现阶段特异性与细胞特异性。LncRNAAK036396通过Fcnb能够有效调控G-MDSCs免疫抑制功能进而影响机体抗肿瘤免疫。(本文来源于《江苏大学》期刊2017-04-18）
王娟[3]（2016）在《IL-17通过抑制MDSCs凋亡影响小鼠抗瘤免疫应答的实验研究》一文中研究指出目的:体外观察白细胞介素17(interleukin17,IL-17)对小鼠髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells)凋亡的影响,并探讨ERK1/2分子在其中的作用;于Lewis荷瘤小鼠体内研究IL-17是否通过调控MDSCs凋亡而影响肿瘤的生长。方法:(1)通过皮下注射Lewis细胞构建荷瘤小鼠模型,采用免疫磁珠分选技术(MACS)分离脾脏MDSCs细胞,常规培养。经IL-17处理后,使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs凋亡情况,通过Western-blot技术检测BCL-2的表达以及ERK1/2的磷酸化水平。(2)在MDSCs培养体系中加入不同浓度ERK1/2分子磷酸化抑制剂(U0126)预处理,再经IL-17作用,运用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs的凋亡情况并通过Western-blot技术检测BCL-2的表达水平。(3)在荷瘤小鼠体内腹腔注射IL-17,2.5μg/只/次,共叁次。观察肿瘤生长情况,测量肿瘤重量和大小;通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测核蛋白(Ki67)mRNA、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达情况。采用流式细胞术(FCM)检测树突状细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例,免疫荧光技术(IF)检测肿瘤组织中MDSCs的浸润情况。(4)IL-17处理荷瘤小鼠后,通过MACS分选出MDSCs细胞。运用Western-blot技术检测细胞中ERK1/2磷酸化水平。常规培养后,使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs的凋亡情况,采用精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性,运用Western-blot技术检测BCL-2表达水平。(5)IL-17处理荷瘤小鼠后,使用吉西他滨清除荷瘤小鼠体内MDSCs,过继转移经U0126处理后的MDSCs(简称过继转移模型)。测量肿瘤体积、重量,采用qRT-PCR检测肿瘤组织中iNOS mRNA表达水平,通过MACS分选MDSCs,常规培养,使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs凋亡情况,使用ARG-1试剂盒检测ARG-1活性,运用Western-blot技术检测BCL-2表达水平。结果:(1)IL-17处理MDSCs细胞24h,对照组活细胞比例为(45.33±1.556)%,il-17处理组为(59.55±2.831)%(p<0.001),晚期凋亡细胞比例对照组为(22.87±1.349)%,il-17处理组为(13.70±1.003)%(p<0.01)。western-blot结果显示:il-17处理组erk1/2分子磷酸化水平(p<0.001)、bcl-2表达水平都明显上调(p<0.01)。(2)在mdscs培养体系中加入erk1/2分子磷酸化抑制剂(u0126)预处理,再加入il-17处理。24h后,当u0126浓度为7.5μm时,空白对照组活细胞比例为(39.08±2.718)%,u0126处理组为(15.57±1.009)%(p<0.001),空白对照组晚期凋亡细胞比例为(8.007±1.777)%,u0126处理组为(26.95±1.179)%(p<0.01)。western-blot检测发现,u0126处理组抗凋亡蛋白bcl-2表达明显减少。(3)与pbs对照组相比,il-17处理荷瘤小鼠后,肿瘤生长速度加快(p<0.01),肿瘤体积增加[pbs组为2.753±0.7803cm3,il-17处理组为6.000±0.8653cm3)(p<0.05)],肿瘤重量增加[pbs组为1.886±0.2020g,il-17处理组为3.480±0.4586g(p<0.05)],核蛋白ki67mrna表达增加(p<0.05)。fcm结果显示:对照组脾脏中mdscs数量为(2.187±0.2541)×107、比例为(13.40±0.3606)%,il-17处理组数量为(3.967±0.1133)×107,比例为(24.43±1.1240)%(p<0.001)。if结果显示肿瘤组织中mdscs浸润数目增加,qrt-pcr检测发现肿瘤组织中inosmrna表达增加(p<0.05)。(4)与pbs对照组相比,western-blot检测发现经il-17处理后的荷瘤小鼠脾脏mdscs中erk1/2磷酸化水平、bcl-2表达水平明显上调(p<0.05);arg-1活性明显增强(p<0.05)。体外培养24h后,pbs对照组活细胞比例为(44.23±3.477)%,il-17处理组为(59.33±2.718)%(p<0.05);pbs对照组晚期凋亡细胞比例为(33.28±4.104)%,il-17处理组为(19.26±2.494)%(p<0.05)。(5)与对照组相比,过继转移经u0126处理的mdscs后,脾脏和肿瘤组织中mdscs分别减少了3.6%(p<0.05)、5.3%(p<0.01),肿瘤体积减小,肿瘤重量减轻(对照组为2.948±0.7537g,u0126处理组为0.7830±0.1597g)(p<0.05),肿瘤组织中ki67mrna(p<0.01)、inosmrna的相对表达水平降低(p<0.05),脾脏分离出的mdscs经培养后,凋亡水平明显增加,bcl-2表达量明显减少(p<0.001)。结论:(1)IL-17在体外能够通过增强ERK1/2分子的磷酸化抑制MDSCs的凋亡(2)IL-17能通过抑制MDSCs的凋亡和增强其免疫抑制活性促进肿瘤的生长。IL-17在荷瘤小鼠体内可明显促进肿瘤生长,这种作用与IL-17抑制MDSCs的凋亡有关。(本文来源于《江苏大学》期刊2016-06-14）
田洁[4]（2014）在《β-葡聚糖对髓源性抑制细胞的分子调控及其在抗瘤免疫中的作用》一文中研究指出肿瘤能够通过多种机制诱导免疫抑制细胞的产生来介导机体免疫抑制,这是造成肿瘤免疫逃逸非常重要的机制,也是肿瘤免疫治疗失败的主要原因。近年来,越来越多的研究发现,肿瘤患者体内存在着一群具有免疫抑制功能的髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)。 MDSCs是一群骨髓来源的、未成熟的异质性髓系细胞,包括粒细胞样MDSCs(G-MDSCs)和单核细胞样MDSCs (M-MDSCs)。在健康个体体内,MDSCs从骨髓产生之后能够迅速分化为树突状细胞(dendritic cell, DC).巨噬细胞和粒细胞。在病理状况下,MDSCs的分化过程受阻,大量积聚于体内。在肿瘤患者体内,MDSCs能够负向调节免疫应答,有效地抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的抗瘤免疫效应,促进肿瘤的生长。MDSCs在肿瘤诱导的免疫抑制中发挥重要作用,严重阻碍了肿瘤免疫治疗的效果。目前人们主要通过清除MDSCs、阻断MDSCs的免疫抑制功能或者促进MDSCs分化成熟等方法来实现靶向MDSCs的免疫治疗p-葡聚糖是许多植物、微生物细胞壁的组成成分,包括燕麦、海藻、真菌、酵母以及某些细菌等。p-葡聚糖作为一种免疫调节剂,具有正向免疫刺激作用和抗肿瘤活性,但对其作用机制尚不十分清楚。目前的研究主要发现β-葡聚糖通过对DCs、巨噬细胞以及中性粒细胞的调控来增强天然免疫应答和适应性免疫应答,而关于p-葡聚糖对免疫抑制细胞的作用尚不清楚。那么,β-葡聚糖能否对MDSCs的生物学活性进行调控呢?因此,我们采用酿酒酵母来源的颗粒型p-葡聚糖(whole β-glucan particles, WGP)来研究其对MDSCs的调控作用。MicroRNA (miRNA)是一种非编码的、内源性的小分子RNA,它能够特异性地与靶基因mRNA上3’非编码区(3'UTR)的互补序列结合,从而阻止蛋白的合成。miRNA在体内参与多种细胞的发育、成熟、增殖、分化和凋亡。miRNA还可从细胞的分化、功能、存活以及细胞因子的释放和胞内信号传导等方面调控多种免疫细胞参与天然免疫应答和适应性免疫应答。目前已经发现多种miRNA参与免疫细胞的调控,而对于调控MDSCs生物学活性的miRNA研究甚少,仍需我们进一步地探究。基于以上分析,我们对所提出的问题进行了系统的研究。分别探讨了p-葡聚糖对MDSCs分化和功能的调控,挖掘调控作用的潜在机制；探究与p-葡聚糖调控MDSCs有关的miRNA,并进一步揭示miRNA的作用机制,旨在寻求具有潜在临床应用价值的肿瘤免疫治疗新靶点。一、WGP通过调控M-MDSCs的分化与功能来增强抗瘤免疫应答本部分的目的是明确WGP能否对MDSCs进行调控,若可以,进一步探讨具体机制。为了观察WGP对MDSCs的作用,我们首先检测MDSCs表面是否表达p-葡聚糖的受体Dectin-1。结果发现在M-MDSCs和G-MDSCs表面均表达Dectin-1。这就说明p-葡聚糖能够直接作用于MDSCs。接着,我们采用WGP作用于MDSCs,发现WGP能够通过Dectin-1途经促进M-MDSC分化为更为成熟的髓系细胞,这群细胞表型为CD11c+F4/80+Ly6Clow,且高表达CD40, CD80, CD86以及MHCII分子。进一步研究发现该诱导分化过程是依赖于NF-κB途经的。另外,WGP刺激后的M-MDSCs的免疫抑制能力明显降低。利用荷瘤小鼠模型发现,给予荷瘤小鼠口服WGP后,肿瘤的发展进程明显减缓。小鼠体内脾脏以及肿瘤组织局部中的MDSCs显着减少,而局部引流淋巴结和肿瘤组织中的DCs和巨噬细胞的比例显着上升；另外,脾脏、淋巴结和肿瘤组织中浸润的CD4+IFNγ+Th1细胞和CD3+CD8+IFNγ+CTL细胞明显增多,肿瘤组织中的CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)显着减少,而脾脏和淋巴结中的Treg细胞比例与对照组相比并无明显变化,但是其免疫抑制功能明显下调。我们的结果表明WGP能够通过Dectin-1途经促进M-MDSCs的分化与成熟,降低其免疫抑制能力,而这一作用是依赖于NF-κB途经的。体内发现WGP能够通过降低MDSCs的比例,增加DCs和巨噬细胞的比例,进而增强Thl和CTL细胞反应,降低Treg细胞的抑制能力,从而延缓肿瘤的发展。二、miR-9通过靶向Runxl的表达来调控MDSCs的成熟分化与功能接下来,我们进一步探讨调控MDSCs分化成熟和功能的分子机制。首先,我们发现WGP能上调MDSCs中Runx1的表达,而经研究发现Runx1又与MDSCs的成熟和功能密切相关,Runx1能够促进M-MDSCs的成熟且降低其免疫抑制能力。接着,我们采用miRNA芯片检测方法寻找可能调控MDSCs成熟和功能的miRNA。经miRNA表达谱分析以及筛选发现,WGP刺激M-MDSCs和G-MDSCs后,miR-9的表达量明显降低,且预测结果显示Runx1很可能是miR-9作用的靶基因。经荧光素酶报告基因检测分析,证实了miR-9与Runx1之间的靶向关系。另外,我们还发现miR-9的表达受转录因子CREB的调控,CREB能够结合到pre-miR-9-1的启动子上,调控miR-9的表达。接下来,我们将miR-9拟似物或抑制剂转染至MDSCs中研究miR-9对MDSCs的调控作用。我们发现过量表达miR-9能够明显增强MDSCs的免疫抑制活性,抑制WGP诱导M-MDSCs的分化过程；相反地,下调MDSCs中的miR-9则可以促进M-MDSCs的成熟,而削弱MDSCs的免疫抑制能力。为了在体内观察miR-9对MDSCs的调控,我们建立了小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,将转染了miR-9拟似物或抑制剂的MDSCs局部注射入小鼠体内后,与对照组相比,抑制了MDSCs中miR-9表达后荷瘤小鼠的肿瘤生长缓慢,小鼠的存活率明显增高；相反地,增加MDSCs中miR-9的表达能够促进肿瘤的生长,显着降低小鼠的存活率。此外,直接注射miR-9抑制剂于小鼠肿瘤局部,也能够达到延缓肿瘤的效果。临床研究发现肺癌患者肿瘤组织中存在大量MDSC的浸润,在肺癌患者肿瘤组织以及外周血中miR-9呈高水平表达,且与MDSC的主要效应分子精氨酸酶的含量有较好的正相关性,提示miR-9具有用于临床肿瘤治疗新靶点的潜在应用价值,以及作为临床肿瘤诊断的新指标。上述结果表明WGP通过下调CREB的表达,进而下调miR-9的表达,而miR-9又通过靶向Runxl的表达来调控MDSCs的分化成熟与功能。体外下调MDSCs中的miR-9可以促进M-MDSCs的成熟,而削弱MDSCs的免疫抑制能力。体内抑制MDSCs中miR-9的表达可以有效地延缓肿瘤的发展进程,延长小鼠的生存时间。这些数据均表明了miR-9具有作为肿瘤免疫治疗新靶点的潜在应用价值。综上,通过两部分实验内容,我们研究了β-葡聚糖对MDSCs分化与功能的调控作用及其机制,证明了WGP能够通过Dectin-1途经诱导M-MDSCs的分化和成熟,降低MDSCs的免疫抑制能力,从而增强抗瘤免疫应答。进一步研究发现,WGP主要是通过下调MDSCs中miR-9的含量,继而靶向Runxl的表达来调控MDSCs的分化成熟和功能,抑制MDSCs中miR-9的表达能够有效地延缓肿瘤的生长。该研究从新的角度揭示并丰富了β-葡聚糖的作用机制,阐述了p-葡聚糖对抑制性细胞MDSCs的作用,从miRNA分子角度探讨了调控MDSCs分化和功能的新机制,为肿瘤的临床免疫治疗挖掘了新的治疗靶点和治疗策略。(本文来源于《江苏大学》期刊2014-04-21）
钮柏琳,慎华平,龚建平,杜慧敏,杨仕明[5]（2011）在《树状串联hTERT表位肽负载mDC疫苗体外激发抗瘤免疫应答的效应研究》一文中研究指出目的通过树状串联hTERT表位肽的髓样树突状细胞(mDC)递呈,刺激同源淋巴细胞,探索一种更优的肿瘤免疫治疗方法。方法人工固相合成4分支的树状串联hTERT表位肽(MAP)及其各分支单肽,免疫荧光检测hTERT的表达情况,免疫磁珠分选mDC,尼龙毛柱纯化T细胞,ELISA检测mDC的IL-12p70和淋巴细胞的(LC)TNF-α、IFN-γ分泌量,流式细胞技术检测mDC、LC的相关表面分子以及效应性T细胞对HLA-A2型肿瘤A549、MDA-MB-231和SW480的杀伤率,并作统计学分析。结果所有肿瘤细胞都表达hTERT,且胞核大于胞浆;MAP和混合单肽对3种肿瘤细胞都有杀伤效应,且MAP的杀伤效应大于混合单肽,有统计学差异。结论人工合成hTERT的MAP肽通过mDC能足够强的激活同源淋巴细胞,在肿瘤疫苗的研发中有重要意义。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2011年06期）
马洁[6]（2010）在《mGITRL 基因重组腺病毒转染DC增强Lewis肺癌移植瘤小鼠抗瘤免疫的实验研究》一文中研究指出肺癌是目前临床较为常见的恶性肿瘤,肺癌发病率约占所有癌症发病率的12%。每年全世界有超过130万人被确诊患有肺癌,超过110万人死于肺癌。尽管目前肺癌的临床治疗已取得一些进展,但总体治疗效果仍不理想,因此,有必要寻求更为有效的治疗手段。围绕着树突状细胞(dendritic cell, DC)建立的特异性肿瘤免疫治疗方法,为肺癌的生物治疗提供了新思路和新方法。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand, GITRL)是最近发现的TNF超家族成员,可参与对效应性T细胞和调节性T细胞功能的调控。在本研究中,我们制备携带小鼠GITRL (mGITRL)基因的重组腺病毒(pAd-GITRL),将pAd-GITRL转染小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cell, BMDC),并研究其生物学功能变化。在建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的基础上,探讨pAd-GITRL能否通过上调DC的免疫刺激功能,调控效应性T细胞和调节性T细胞的功能,从而增强荷瘤小鼠机体特异性抗瘤免疫应答。第一部分：携带小鼠GITRL基因重组腺病毒的制备与鉴定目的：构建能有效转导mGITRL基因的重组腺病毒,进行病毒包装、扩增和滴度测定,以用于mGITRL基因治疗的实验研究。方法：应用AdEasy-1腺病毒表达载体系统构建携带mGITRL基因的重组腺病毒(pAd-GITRL)和对照腺病毒(pAd-null)。首先将目的基因克隆至pAdTrack-CMV形成穿梭载体,然后与腺病毒病毒骨架质粒共转染至大肠埃希菌BJ5183中,进行细菌内同源重组,产生包含目的基因的重组腺病毒载体,由于pAdTrack-CMV携带增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因,因此该病毒载体转染293A细胞后,可通过荧光显微镜观察eGFP的表达来判断病毒转染效率,通过qRT-PCR和Western blot鉴定目的基因在293A细胞中的表达,病毒滴度采用TCID50法测定。结果：经酶切、PCR及测序鉴定证实,重组腺病毒载体插入片段为mGITRL基因。包装的重组腺病毒载体具有良好的感染性,细胞产生明显的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),可以在293A细胞中形成病毒颗粒。通过TCID50法测定pAd-GITRL病毒滴度为2.0×109 pfu/ml; pAd-null病毒滴度为2.5×109 pfu/ml。pAd-GITRL感染293A细胞48h后,荧光显微镜观察可见eGFP的表达。qRT-PCR检测结果显示,转染了pAd-GITRL的293A细胞表达GITRL的mRNA, pAd-null转染的293A细胞及未转染的293A细胞不表达GITRL的mRNA (mRNA的相对表达量用2△ct值×103表示)(2△ct值×103: 261.90±1.35 vs 0.36±0.039vs0)。Western blot结果亦显示,转染了pAd-GITRL的293A细胞表达GITRL蛋白, pAd-null转染的293A细胞及未转染的293A细胞不表达GITRL蛋白。结论：成功构建了复制缺陷型携带mGITRL基因的pAd-GITRL, pAd-GITRL能有效介导mGITRL在293A细胞内表达。第二部分：pAd-GITRL转染小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的实验研究目的：采用pAd-GITRL转染BMDC,观察转染前后BMDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子的表达情况。同时体外研究pAd-GITRL转染的BMDC(pAd-GITRL-BMDC)对CD4+CD25-T细胞增殖和CD4+CD25+Treg细胞免疫抑制功能的影响。方法：小鼠骨髓前体细胞经终浓度均为10ng/ml的GM-CSF和IL-4体外诱导培养7 d,并通过显微镜和流式细胞术(FCM)进行形态和纯度鉴定。7 d后分别用pAd-GITRL和pAd-null转染BMDC,通过免疫荧光染色和FCM检测pAd-GITRL转染前后BMDC表面MHCⅡ类分子、CD40、CD80和CD86的表达情况。通过体外细胞增殖试验检测pAd-GITRL-BMDC对抗CD3 mAb刺激的CD4+CD25-T细胞的增殖,以及对CD4+CD25+ Treg细胞免疫抑制功能的影响。结果：小鼠骨髓前体细胞体外诱导培养7 d后,在倒置显微镜下可观察到细胞体积增大,且呈不规则突起,形似树突状；FCM检测CDllc+比例达79.07%。通过荧光显微镜观察eGFP的表达可知pAd-GITRL能有效转染BMDC。FCM结果显示BMDC转染pAd-GITRL后,体外培养8 d仍能稳定表达GITRL。相对于BMDC组,pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC表面CD40、CD80和CD86均有所升高,但组间无显着性差异,MHCⅡ类分子无明显变化。抗CD3 mAb刺激的CD4+CD25- T细胞增殖试验中,pAd-GITRL-BMDC组的cpm值为6888±1304,与BMDC (848±59)和pAd-null-BMDC(1231±75)相比有显着性差异(p<0.05)。CD4+CD25+ Treg细胞免疫抑制功能试验结果显示,pAd-GITRL-BMDC共培养体系中Treg细胞的抑制率为44.7±17.2%,与BMDC (63.7±17.4%)和pAd-null-BMDC (90.3±11.9%)相比明显下降(p<0.05)。结论：体外成功诱导和培养BMDC, pAd-GITRL在体外能有效转染BMDC,并且持续性表达GITRL。pAd-GITRL-BMDC能显着增强CD4+CD25-T细胞的增殖,同时能部分下调CD4+CD25+T细胞的免疫抑制功能。第叁部分：pAd-GITRL-BMDC增强Lewis肺癌移植瘤小鼠抗瘤免疫应答的实验研究目的：探讨pAd-GITRL-BMDC能否增强Lewis肺癌移植瘤小鼠体内抗瘤免疫应答,寻求mGITRL在调控免疫应答中的作用及其抗瘤免疫的机制。方法：通过皮下接种小鼠Lewis肺癌细胞,建立Lewis肺癌移植瘤小鼠模型。随机分为BMDC、pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC和PBS四组。按照3：1的比例,将3.0×106 Lewis细胞的裂解液分别加入BMDC、pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC(1.0×106/孔)培养体系中,37℃、5%CO2孵育24 h。皮下接种Lewis后第10d、第12d和第14d,每组小鼠分别瘤内多点注射1×106/100μ1肿瘤抗原负载的BMDC、pAd-null-BMDC和pAd-GITRL-BMDC, PBS组仅注射100μl PBS,观察荷瘤小鼠体内肿瘤的生长情况。部分小鼠在最后一次注射6d后,断颈处死荷瘤小鼠,FCM检测荷瘤小鼠脾脏中CD8+IFN-γ+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T细胞和CD4+IL-17+T细胞的数量与比例,qRT-PCR检测肿瘤组织中GITRL、IFN-γ、Foxp3、IL-17、ROR-γt和CCL20的表达情况,免疫荧光染色法检测肿瘤组织中CD8+IFN-γ+T细胞、CD4+Foxp3+T细胞和CD4+IL-17+T细胞的分布情况。结果：pAd-GITRL-BMDC组抑制肿瘤生长的作用较pAd-null-BMDC组、BMDC组和PBS组明显,皮下种植Lewis后第30 d,各组肿瘤的大小分别为210.5±20.5,327.7±39.1,419.0±91.9和646.6±98.7mm2。在70 d的观察期内,pAd-GITRL-BMDC组的生存率为75%, pAd-null-BMDC组生存率为29%,BMDC组和PBS组生存率为0%。FCM分析小鼠脾脏中CD8+IFN-γ+ T细胞的比例,pAd-GITRL-BMDC组为32.29±14.5%,明显高于pAd-null-BMDC组(24.32±6.83%,p<0.05)。CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例在各组间没有明显差异,但pAd-GITRL-BMDC组小鼠脾脏中Treg细胞的数量与pAd-null-BMDC组相比却显着降低(9.48×105±2.21×105vs2.07×106±1.21×106,p<0.05)BMDC、pAd-null-BMDC、pAd-GITRL-BMDC叁组小鼠脾脏中CD4+IL-17+T细胞比例均明显高于PBS组,但各治疗组间并无显着性差异。肿瘤组织免疫荧光染色结果显示,pAd-GITRL-BMDC组与其他各组相比,肿瘤组织中CD8+IFN-γ+T细胞和CD4+IL-17+T细胞明显增多,而CD4+Foxp3+T细胞明显减少。qRT-PCR检测显示(各个指标mRNA的相对表达量用2△ct值×103表示),pAd-GITRL-BMDC组与pAd-null-BMDC组的GITRL分别为55.30±26.50和16.27±5.12,IFN-γ分别为17.42±4.87和9.37±2.72,IL-17分别为13.10±4.20和8.12±0.45,ROR-γt分别为273.44±51.20和72.42±5.21,CCL20分别为273.44±51.20和72.42±5.21,表明pAd-GITRL-BMDC组与pAd-null-BMDC组肿瘤组织中GITRL. IFN-γ、IL-17、ROR-γt和CCL20的表达均有显着性增高(p<0.05)；但pAd-GITRL-BMDC组与pAd-null-BMDC组肿瘤组织中的Foxp3分别为3.09±0.93和12.78±5.60(p<0.05)。结论：pAd-GITRL-BMDC能显着抑制体内肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期。其可能的机制一方面是pAd-GITRL-BMDC能降低荷瘤小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量,减少肿瘤组织中CD4+Foxp3+Treg细胞的浸润。另一方面是增加荷瘤小鼠体内CD8+IFN-γ+T细胞的比例,促进肿瘤组织中CD8+IFN-γ+T细胞及CD4+IL-17+T细胞的浸润,从而增强Lewis肺癌移植瘤小鼠的抗瘤免疫效应。(本文来源于《江苏大学》期刊2010-11-11）
黄学亮,冯曼玲,丁军颖[7]（2010）在《IL-15基因转染抗瘤免疫研究回顾与展望》一文中研究指出在人体多种正常组织细胞中,IL-15 mRNA广泛表达,但长信号肽阻碍其蛋白的表达,即IL-15的mRNA表达与蛋白表达不一致。肿瘤细胞中也存在此现象,并且发现部分肿瘤细胞株IL-15 mRNA与IL-15蛋白同时缺失。针对此现象,学者们结合IL-15似于IL-2又优于IL-2的抗瘤特性,进行了不同形式IL-15基因转染不同细胞的抗瘤免疫研究。(本文来源于《武警医学院学报》期刊2010年09期）
张峻岭,李卫泊,李冬斌,谢绍建,蔡建辉[8]（2010）在《肿瘤细胞免疫原性死亡中特征性表达抗原在抗瘤免疫应答中的作用》一文中研究指出最新研究显示凋亡并非是一种均一的细胞死亡方式,研究发现:通过高温、射线、化疗药物等一些手段处理肿瘤细胞并引起其凋亡的同时细胞表面表达引起机体免疫攻击的蛋白分子,从而引起抗肿瘤免疫反应,被称为肿瘤的免疫原性死亡。免疫原性死亡的肿瘤细胞表面高表达钙网蛋白、热休克蛋白、高迁移率族蛋白B1等引起机体免疫反应的抗原分子能够提高树突状细胞识别肿瘤细胞的能力,激活肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤的攻击。肿瘤细胞免疫原性死亡及其特征性表达抗原为肿瘤生物治疗提供了新的治疗依据和手段。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2010年08期）
刘晶晶,Lacey,Gunn,Richard,Hansen,严俊,沈培[9]（2010）在《肿瘤特异性单克隆抗体与酵母β-葡聚糖联合用于抗瘤免疫治疗的研究进展》一文中研究指出近年来提出了肿瘤特异性单克隆抗体(mAb)联合酵母β-葡聚糖用于肿瘤治疗的作用模式。已经证实,巨噬细胞能摄取、加工微粒子或大分子质量的可溶性β-葡聚糖,分泌活性物质,从而提高中性粒细胞补体受体3(complement receptor 3,CR3)水平,(本文来源于《江苏大学学报(医学版)》期刊2010年04期）
马昌云,吴芳,孔繁义,戴国光[10]（2010）在《肺癌可溶性抗原联合超抗原修饰致敏DC诱导抗瘤免疫的研究》一文中研究指出目的观察经肺癌肿瘤可溶性抗原(TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合修饰致敏树突状细胞(DC)体外诱导抗肺癌的免疫效应。方法3mol/L氯化钾提取法获得人肺癌细胞GLC-82的可溶性抗原;从人外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增DC,并用流式细胞仪(FCM)检测表型;以肺癌TSA和SEA联合修饰致敏的DC、单纯肺癌抗原致敏的DC和未经抗原修饰的DC分别与同种异体外周血T淋巴细胞共同孵育,刺激T淋巴细胞活化增殖(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、DCL),直接活细胞计数法观察增殖倍数;MTT法检测不同DC:T淋巴细胞比例的效应细胞对靶细胞GLC-82的体外杀伤效应。结果诱导出高表达CD1a、CD80、HLA-DR的DC,光镜下具有典型的DC特性;联合抗原修饰后的DC具有较强的免疫刺激活性,少量致敏DC即可强烈激发T细胞的增殖;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL及DCL;联合抗原修饰的DC以1:100与T淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应最强。结论经肺癌TSA和SEA联合修饰致敏的DC可强烈激发同种异体T淋巴细胞活化增殖;肺癌TSA联合超抗原SEA诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效杀伤作用,经肺癌TSA与超抗原SEA联合修饰DC的活性明显强于单用肺癌TSA。(本文来源于《临床肿瘤学杂志》期刊2010年01期）
抗瘤免疫论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:恶性肿瘤目前已经成为人类死亡的主要疾病,尽管针对肿瘤的靶向治疗发展迅速,但是总体治疗效果仍然不够理想。大量临床研究表明,肿瘤的免疫逃逸是造成肿瘤治疗失败的主要因素。本研究中,我们通过探索长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA ) AK036396对粒细胞样髓源性抑制细胞(Granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs)发育及功能的调控,寻找肿瘤免疫治疗的新靶点。方法:1.采用Arraystar LncRNA表达谱芯片技术检测在野生型小鼠脾脏来源CDllb+Ly6G+细胞与荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中表达的lncRNA,筛选出表达呈现明显差异的lncRNA,并利用实时荧光定量定量PCR(realtimefluorescene quantitative PCR, qRT-PCR)进行进一步的确认;利用 qRT-PCR 分析 lncRNA AK036396在不同髓系细胞以及不同发育阶段G-MDSCs中的表达。2.分析Arraystar LncRNA表达谱芯片,筛选出lncRNA可能调控的靶分子,并使用qRT-PCR进行进一步验证。利用qRT-PCR与Western-blot检测在不同髓系细胞中靶分子Fcnb的表达情况。利用特异性siRNA抑制G-MDSCs中lncRNA AK036396的表达后,利用qRT-PCR与Western-blot检测细胞中靶分子Fcnb的表达变化。3.利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH )确定 lncRNA AK036396在G-MDSCs细胞中定位;利用RNA pull down与RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)实验确认 lncRNA AK036396与Fcnb蛋白是否存在结合;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白合成抑制剂环已酰亚胺(Cycloheximide, NCX )(40μg/mL),随后利用 Western-blot 确认 lncRNAAK036396 对 Fcnb 蛋白稳定性的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,加入蛋白酶体抑制剂MG132 (20pM),随后利用Western-blot确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白稳降解的调控;利用特异性siRNA敲减G-MDSCs中lncRNA AK036396后,随后通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验确认lncRNAAK036396对Fcnb蛋白泛素化的调控。4.为了确认Fcnb与G-MDSCs发育及功能的联系,利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,检测①利用qRT-PCR检测细胞中CD244的表达;②G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测精氨酸酶1 (Arginase1,Arg1)活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用流式细胞术(Flow cytometry, FCM)检测活性氧(Reactive oxygen species, ROS)表达。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②使用FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR检测肿瘤来源G-MDSCs中CD244表达情况;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部CD3+CD4+IFN-γ+ T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+ T细胞比例。6.为了确定lncRNA AK036396对G-MDSCs发育及功能的调控,利用小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396后,①检测G-MDSCs发育变化,其中包括:使用qRT-PCR和Western-blot检测Fcnb的表达、使用qRT-PCR检测CD244的表达、通过瑞氏-吉姆萨染色检测细胞形态学改变;②检测G-MDSCs免疫抑制功能变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①连续监测肿瘤生长情况;②FCM检测肿瘤组织中G-MDSCs比例;③利用qRT-PCR与Western-blot检测肿瘤局部G-MDSCs中Fcnb的表达,利用qRT-PCR检测肿瘤局部G-MDSCs中CD244的表达;④肿瘤局部G-MDSCs免疫抑制分子表达变化,其中包括:利用比色法检测Arg1活性、利用3H-TdR掺入实验确认G-MDSCs对T细胞增殖的抑制作用、利用FCM检测ROS表达;⑤FCM检测脾脏、引流淋巴结、肿瘤局部 CD3+CD4+IFN-γ+ T 细胞和 CD3+CD8+IFN-γ+ T 细胞比例。8.利用qRT-PCR检测肺癌患者外周血单个核细胞(PBMCs)中小鼠Fcnb同源物M-ficolin的表达水平,并分析M-ficolin的表达水平与肺癌发展之间的联系。结果:1.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,lncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P<0.001);与外周成熟中性粒细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)以及肿瘤来源 M-MDSCs (P<0.001)相比,lncRNAAK036396 在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中高表达;lncRNAAK036396的表达随着G-MDSCs分化发育逐渐下降(P<0.05)。2.与野生型小鼠脾脏来源CD11b+Ly6G+细胞相比,Fcnb在肿瘤来源G-MDSCs中高表达(P<0.01);与外周成熟中性粒细胞(P<0.001)、单核细胞(P<0.001)以及肿瘤来源M-MDSCs (P<0.001)相比,Fcnb在荷瘤小鼠肿瘤来源G-MDSCs中的表达水平最高;在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,FcnbmRNA (P<0.05)与蛋白(P<0.05)表达发生显着下调。3.通过FISH实验发现lncRNAAK036396主要位于肿瘤来源G-MDSCs细胞核中;通过RNA pull down和RIP实验证实lncRNAAK036396与Fcnb蛋白之间存在相互结合;Western-blot结果显示在抑制G-MDSCs中lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白稳定性显着下调;Western-blot结果显示在抑制蛋白酶体活性后,siAK036396无法继续下调Fcnb蛋白稳定性;IP结果显示,抑制lncRNAAK036396表达后,Fcnb蛋白结合的泛素水平显着升高。4.利用小鼠Fcnb特异性siRNA敲减肿瘤组织来源G-MDSCs中Fcnb后,①CD244的表达显着下调(P<0.01);②Arg1活性显着下调(P<0.05)、ROS表达显着下调(P<0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P<0.05)。5.肿瘤局部注射小鼠Fcnb特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P<0.05);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显着下调(P<0.05);③肿瘤来源G-MDSCs中CD244的表达显着下降(P<0.05);④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P<0.01)、ROS表达(P<0.05)均发生显着下调;⑤脾脏(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例出现显着上调。同时,脾脏(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例出现显着上调。6.在肿瘤组织来源G-MDSCs中lncRNAAK036396表达被抑制后,①Fcnb(P<0.05)和CD244 (P<0.01)表达均发生显着下调,G-MDSCs形态学特点由杆状核为主分页核少见转变为多见分页核;②Arg1活性显着下调(P<0.05)、G-MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制作用下调(P<0.05),但是ROS的表达未出现显着变化(ns=no significance)。7.肿瘤局部注射小鼠lncRNA AK036396特异性siRNA后,①肿瘤生长被有效延缓(P<0.001);②肿瘤组织中G-MDSCs比例发生显着下调(P<0.01);③肿瘤局部来源G-MDSCs中Fcnb (P<0.01)与CD244 (P<0.001)的表达显着下调;④肿瘤局部来源G-MDSCs中Arg1活性(P<0.05)与ROS的表达(P<0.001)发生显着下调;⑤脾脏(ns)、引流淋巴结(ns)、肿瘤局部(ns) CD3+CD4+IFN-γ+T细胞比例未出现显着变化。但是脾脏(P<0.05)、引流淋巴结(P<0.05)、肿瘤局部(P<0.05) CD3+CD8+IFN-γ+T细胞比例均出现显着升高。8.与健康对照相比较,肺癌患者PBMCs中M-ficolin (小鼠Fcnb的同源物)的表达水平显着升高(P<0.05)。肺癌患者PBMCs中M-ficolin表达水平与MDSCs比例及Arg1表达水平呈现明显的正相关(P<0.01, P<0.05)。且M-ficolin的表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.001)、TNM分期(P<0.05)密切相关。结论:LncRNAAK036396在肿瘤来源G-MDSCs中的表达呈现阶段特异性与细胞特异性。LncRNAAK036396通过Fcnb能够有效调控G-MDSCs免疫抑制功能进而影响机体抗肿瘤免疫。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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