鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

论文摘要

【目的】构建鸡胚成纤维细胞（CEF）的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒（ARV）σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础。【方法】采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA（ds cDNA）,ds c DNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建c DNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析。【结果】构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106CFU,文库滴度为3.1×108CFU/mL,插入片段大小集中在300～2000 bp,重组率为91.67%。以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba（SD/-4/X/A）固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基（NACA）、核苷二磷酸激酶2（NME2）、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9（MRPS9）。【结论】通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据。

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文章来源

类型: 期刊论文

作者: 叶丽娜,谢芝勋,谢丽基,王盛,邓显文,谢志勤,范晴,黄娇玲,曾婷婷,张艳芳,罗思思

关键词: 禽呼肠孤病毒,蛋白,文库,互作蛋白,酵母双杂交

来源: 南方农业学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 广西兽医研究所/广西畜牧疫苗新技术重点实验室

基金: 国家自然科学基金项目(31660715,31160512),国家“万人计划”领军人才专项(2016-37),广西八桂学者专项(2019-79)

分类号: S852.65

页码: 1362-1368

总页数: 7

文件大小: 2328K

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