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控制TaAGPL1基因表达上游调控因子的分离及其功能研究

2020-12-08阅读(168)

控制TaAGPL1基因表达上游调控因子的分离及其功能研究

论文摘要

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）是淀粉生物合成中的关键酶,由成对的两个大亚基（AGPL）和成对的两个小亚基（AGPS）组成的异源四聚体,分为胞质型和质体型两种,因此,在植物细胞内存在四类AGPase亚基:AGPase胞质型大亚基（AGPL1）、胞质型小亚基（AGPS1）、质体型大亚基（AGPL2）和质体型小亚基（AGPS2）。课题组前期研究结果表明,小麦淀粉合成基因TaAGPL1的过表达能显著提高小麦籽粒AGPase活性和淀粉积累速率,从而证明了它在小麦籽粒淀粉合成中的重要作用。本研究运用酵母单杂交技术,通过将TaAGPL1 promoter与小麦籽粒cDNA文库进行酵母单杂交,筛选出控制TaAGPL1基因表达的上游调控因子,并利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默（BSMV-VIGS）技术对调控因子进行功能研究,从而探究了调控TaAGPL1基因表达的分子机制。主要结果如下:（1）运用酵母单杂交技术筛选出控制TaAGPL1表达的两个调控因子（TabHLH39转录因子和TaPDIL1-2分子伴侣）。分离出TabHLH39基因的cDNA序列,它编码了486个氨基酸,蛋白序列包含了bHLH家族所共有的四个经典结构域。通过烟草瞬时转化和酵母自激活试验,发现TabHLH39仅定位于细胞核且具有转录自激活活性。利用小麦基因组数据库搜索获得TaPDIL1-2基因定位于4BS,其ORF编码了512个氨基酸,蛋白序列包含有四个经典的硫氧还蛋白结构域。（2）田间利用BSMV-VIGS沉默技术研究了TabHLH39基因的功能。构建BSMV-VIGS-TabHLH39沉默载体并对其进行线性化、纯化和体外转录,成功后用于接种田间灌浆期的小麦穗部。结果显示,在花后19 d、24 d、29 d和34 d,BSMV-VIGS-TabHLH39沉默植株中TabHLH39基因表达量显著降低（94.698.7%）;BSMV-VIGS-TabHLH39沉默植株成熟籽粒中粒长、粒宽、粒重及淀粉含量均显著降低（降幅为10.1%、11.7%、3.7%和8.8%）;对接种后14 d、19 d、24 d、29 d和34 d的小麦籽粒进行qPCR检测,发现BSMV-TabHLH39沉默植株籽粒内TaAGPL1的表达量也均显著下降。这些结果表明TabHLH39可能通过正向调控淀粉合成基因TaAGPL1的表达,进而参与了小麦籽粒淀粉的合成。（3）田间利用BSMV-VIGS沉默技术研究了TaPDIL1-2基因的功能。构建BSMV-VIGS-TaPDIL1-2沉默载体并对其进行线性化、纯化和体外转录,成功后用于接种田间灌浆期的小麦穗部,并对成功沉默的小麦植株籽粒进行定量检测,结果显示BSMV-VIGS-TaPDIL1-2沉默植株成熟籽粒中粒长、粒宽、粒重和淀粉含量均显著上升（升幅为3.8%、5.7%、6.8%和1.9%）;且BSMV-TaPDIL1-2沉默植株籽粒内TaAGPL1的表达量均显著上升。因此推测作为参与氧化蛋白质正确折叠的重要伴侣蛋白TaPDIL1-2,它能够确保一些转录因子（C2H2-ZFS和AP2/ERF等）的正确折叠,从而间接和负向调控TaAGPL1基因的表达并在淀粉生物合成中起重要作用。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • 1 文献综述
  •   1.1 淀粉合成相关酶路径及功能
  •   1.2 AGPase同工酶基因研究进展
  •   1.3 调控基因功能的相关研究
  •     1.3.1 启动子
  •     1.3.2 转录因子
  •     1.3.3 酵母单杂交技术
  •   1.4 大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默（BSMV-VIGS）技术
  •   1.5 研究目的与意义
  • 2 引言
  • 3 材料与方法
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 植物材料
  •     3.1.2 试验所用载体与菌株
  •     3.1.3 试验所用工具酶、试剂及仪器
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 小麦籽粒DNA的提取
  •     3.2.2 小麦籽粒RNA的提取和c DNA的合成
  •       3.2.2.1 小麦籽粒RNA的提取
  •       3.2.2.2 cDNA的合成
  •     3.2.3 Ta AGPL1 启动子活性的GUS定性和定量检测
  •     3.2.4 小麦籽粒c DNA文库的构建
  •     3.2.5 酵母单杂交筛选与互作验证
  •     3.2.6 转录因子的亚细胞定位
  •     3.2.7 转录因子自激活活性检测
  •     3.2.8 田间小麦籽粒的基因沉默
  •     3.2.9 实时荧光定量PCR
  • 4 结果与分析
  •   4.1 控制Ta AGPL1 基因表达上游调控因子的分离
  •     4.1.1 Ta AGPL1启动子的分离
  •     4.1.2 Ta AGPL1启动子的GUS表达活性辨析
  •     4.1.3 酵母单杂交技术筛选控制TaAGPL1-1D表达的调控因子
  •   4.2 调控Ta AGPL1 基因表达的转录因子TabHLH39的功能验证
  •     4.2.1 TabHLH39 转录因子的序列、结构域及系统进化树
  •     4.2.2 Tab HLH39转录因子与Ta AGPL1-1D淀粉合成基因的互作验证
  •     4.2.3 转录因子TabHLH39 的亚细胞定位和转录自激活验证
  •     4.2.4 BSMV-VIGS技术沉默TabHLH39 基因
  •     4.2.5 Tab HLH39 基因在小麦籽粒淀粉合成中的功能鉴定
  •     4.2.6 BSMV-GFP和 BSMV-TabHLH39 基因沉默籽粒内淀粉粒的分布
  •   4.3 控制Ta AGPL1基因表达的调控因子TaPDIL1-2的功能验证
  •     4.3.1 Ta PDIL1-2基因与TaAGPL1-1D启动子的互作
  •     4.3.2 TaPDIL1-2蛋白质二硫键异构酶的结构域、进化树和组织表达
  •     4.3.3 BSMV-VIGS技术沉默Ta PDIL1-2 基因
  •     4.3.4 TaPDIL1-2 基因在小麦籽粒淀粉合成中的功能鉴定
  •     4.3.5 TaPDIL1-2 基因参与小麦籽粒淀粉合成的机理研究
  • 5 结论与讨论
  • 6 本研究主要结论、创新点及下一步研究计划
  •   6.1 主要结论
  •   6.2 本研究创新点
  •   6.3 下一步研究计划
  • 攻读硕士学位期间发表文章及获得荣誉情况
  • 参考文献
  • ABSTRACT

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 董洁

    导师: 康国章,李鸽子

    关键词: 葡萄糖焦磷酸化酶,小麦,酵母单杂交,淀粉合成,调控机制

    来源: 河南农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 河南农业大学

    基金: 国家自然科学基金(31871550,31701345和31571575),国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2016ZX08002003),河南省科技创新杰出青年基金(174100510002)

    分类号: Q943.2;S512.1

    DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000029

    总页数: 56

    文件大小: 5262K

    下载量: 56

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