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乳酸杆菌S-层蛋白对H2O2诱导的HT-29细胞线粒体凋亡通路的影响

2020-12-08阅读(702)

乳酸杆菌S-层蛋白对H2O2诱导的HT-29细胞线粒体凋亡通路的影响

论文摘要

S-层蛋白是乳杆菌表面结构的主要成分,占细胞总蛋白的10%-15%,占网格表面的70%。据报道S-层蛋白对乳杆菌益生菌的作用有积极的贡献。目前关于S-层蛋白对宿主细胞的线粒体凋亡通路的影响的研究较少,所以本课题以H2O2作为氧化损伤刺激物,研究从Lactobacillus paracasei subsp.paracasei M5-L、Lactobacillus casei Q8-L及Lactobacillus rhamnosus GG（LGG）三种乳酸杆菌上分离的S-层蛋白对HT-29细胞的线粒体凋亡通路的影响。本研究采取5 mol/L的LiCl提取S-层蛋白,并利用1 mol/L的LiCl通过盐析的方法来纯化粗提蛋白,SDS-PAGE检测表明三株菌均在43 kDa处有单一条带。选择不同浓度S-层蛋白作用细胞,经MTT实验最终确定其作用浓度为150μg/mL,活菌体与热灭活菌体的浓度为107cfu/mL和108cfu/mL,H2O2与细胞作用的最佳浓度是0.8 mM,作用时间为6 h进行后续实验。MTT实验证实作用时间为6 h时,三种S-层蛋白、活菌体与热灭活菌体能够抑制H2O2对HT-29细胞增殖的影响。检测HT-29细胞抗氧化酶系统的T-AOC、SOD、CAT、MDA和LDH五个指标,实验证明三种S-层蛋白可以通过提高T-AOC、SOD和CAT的含量,降低MDA和LDH的含量,进而拮抗H2O2对HT-29细胞的影响。三种S-层蛋白的各处理组对H2O2导致的Caspase-3和Caspase-9活性的异常具有显著的正向调节作用。实验结果表明,三种S-层蛋白均能通过降低其的活化作用进而减缓H2O2引起的HT-29的凋亡。通过流式细胞仪对三种S-层蛋白及H2O2对HT-29细胞中线粒体膜电位的变化及对细胞中Ca2+的影响两个凋亡指标的研究,进而确定M5-L的S-层蛋白（预防组）拮抗H2O2对HT-29的作用效果最佳,所以最终选择M5-L的S-层蛋白（预防组）来进行细胞凋亡机制部分的研究。为探讨三种S-层蛋白拮抗H2O2的机制,利用qRT-PCR检测HT-29细胞线粒体凋亡通路相关mRNA表达情况,实验结果表明:S-层蛋白可以通过降低APAF-1、Caspase-3、Caspase-9、CytC、Smac和Bid基因的表达量,升高XIAP和Bcl-2基因的表达量,进而通过线粒体细胞凋亡通路来抑制H2O2诱导的细胞凋亡作用。由于AIFM1和ENDOG基因相对其他基因表达含量过少,从本实验的结果看各组的AIFM1和ENDOG的变化趋势不是很有规律,是否M5-L的S-层蛋白通过非Caspase依赖的AIFM1和ENDOG途径抑制细胞调亡仍有待进一步研究。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 课题背景及研究的目的和意义
  •   1.2 发展概况
  •   1.3 抗凋亡作用机理
  •     1.3.1 内质网细胞凋亡通路
  •     1.3.2 线粒体细胞凋亡通路
  •   1.4 本文的主要研究内容
  •     1.4.1 主要研究内容
  •     1.4.2 技术路线
  • 第2章 材料和方法
  •   2.1 材料及仪器
  •     2.1.1 材料与试剂
  •     2.1.2 实验仪器
  •     2.1.3 培养基
  •     2.1.4 菌种及细胞来源
  •   2.2 乳酸杆菌的培养
  •   2.3 热灭活菌体的制备
  •   2.4 乳酸杆菌S-层蛋白的提取和纯化
  •     2.4.1 乳酸杆菌S-层蛋白的提取
  •     2.4.2 乳酸杆菌S-层蛋白的纯化
  •     2.4.3 SDS-PAGE电泳测定S-层蛋白分子量
  •     2.4.4 BCA法测定S-层蛋白浓度
  •   2.5 乳酸杆菌对HT-29 细胞的干预处理
  •     2.5.1 S-层蛋白、活菌体及热灭活菌体对细胞的影响
  •     2.5.2 S-层蛋白对细胞信号通路及凋亡的影响
  •   2.6 MTT法检测HT-29 细胞的活性
  •   2.7 S-层蛋白、活菌体及热灭活菌体对HT-29 抗氧化酶系统的影响
  •   2.8 S-层蛋白、活菌体及热灭活菌体对HT-29 细胞凋亡的影响
  •     2.8.1 线粒体膜电位评估
  • 2+的测定'>    2.8.2 细胞内Ca2+的测定
  •     2.8.3 Casepase-3和Casepase-9 活性的分析
  •   2.9 qRT-PCR检测HT-29 线粒体细胞凋亡通路相关mRNA含量
  •     2.9.1 实验细胞、药物及分组
  •     2.9.2 总RNA的提取和检测
  •     2.9.3 cDNA第一条链的合成
  •     2.9.4 特异引物设计
  •     2.9.5 qRT-PCR
  •     2.9.6 数据分析
  •   2.10 数据处理及绘图
  • 2O2 诱导的细胞活性影响的研究'>第3章 乳酸杆菌对H2O2诱导的细胞活性影响的研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 乳酸杆菌S-层蛋白的分离纯化
  •     3.2.1 乳酸杆菌S-层蛋白的SDS-PAGE
  •     3.2.2 BCA法测定S-层蛋白的浓度
  •   3.3 MTT法检测不同处理下HT-29 细胞活性
  • 2O2 及作用时间对HT-29 存活率的影响'>    3.3.1 不同浓度H2O2 及作用时间对HT-29 存活率的影响
  •     3.3.2 三种菌株的S-层蛋白在不同时间下对HT-29 细胞的抑制率
  • 2O2对HT-29 细胞的抑制率'>    3.3.3 三种菌株的S-层蛋白与H2O2对HT-29 细胞的抑制率
  •     3.3.4 三种活菌体、热灭活菌体在不同时间下对HT-29 的抑制率
  • 2O2对HT-29 细胞的抑制率'>    3.3.5 三种活菌体、热灭活菌体与H2O2对HT-29 细胞的抑制率
  •   3.4 S-层蛋白、活菌体及热灭活菌体对HT-29 抗氧化酶系统的影响
  •     3.4.1 对总抗氧化能力（T-AOC）的影响
  •     3.4.2 对超氧化物歧化酶（SOD）的影响
  •     3.4.3 对过氧化氢酶（CAT）的影响
  •     3.4.4 对脂质氧化（MDA）的影响
  •     3.4.5 对乳酸脱氢酶（LDH）的影响
  •   3.5 本章小结
  • 2O2 对细胞凋亡的研究'>第4章 乳酸杆菌S-层蛋白拮抗H2O2对细胞凋亡的研究
  •   4.1 引言
  •   4.2 S-层蛋白对HT-29中Caspase-3和Caspase-9 活性的影响
  • 2O2 诱导的HT-29 细胞中线粒体膜电位的评估'>  4.3 S-层蛋白对H2O2 诱导的HT-29 细胞中线粒体膜电位的评估
  • 2O2 诱导的HT-29 中线粒体膜电位的评估'>    4.3.1 M5-L的S-层蛋白对H2O2 诱导的HT-29 中线粒体膜电位的评估
  • 2O2 诱导的HT-29 中线粒体膜电位的评估'>    4.3.2 Q8-L的S-层蛋白对H2O2 诱导的HT-29 中线粒体膜电位的评估
  • 2O2 诱导的HT-29 中线粒体膜电位的评估'>    4.3.3 LGG的S-层蛋白对H2O2 诱导的HT-29 中线粒体膜电位的评估
  • 2O2 诱导的HT-29 细胞中Ca2+的影响'>  4.4 S-层蛋白对H2O2 诱导的HT-29 细胞中Ca2+的影响
  • 2O2诱导的HT-29中Ca2+的影响'>    4.4.1 M5-L的S-层蛋白对H2O2诱导的HT-29中Ca2+的影响
  • 2O2诱导的HT-29中Ca2+的影响'>    4.4.2 Q8-L的S-层蛋白对H2O2诱导的HT-29中Ca2+的影响
  • 2O2诱导的HT-29中Ca2+的影响'>    4.4.3 LGG的S-层蛋白对H2O2诱导的HT-29中Ca2+的影响
  •   4.5 qRT-PCR检测HT-29 线粒体细胞凋亡通路相关mRNA含量
  •     4.5.1 引物特异性电泳图
  •     4.5.2 qRT-PCR检测HT-29 线粒体细胞凋亡通路相关mRNA含量
  •   4.6 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 刘晶

    导师: 张英春

    关键词: 层蛋白,细胞凋亡,线粒体细胞凋亡通路

    来源: 哈尔滨工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 哈尔滨工业大学

    分类号: Q936

    DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.002224

    总页数: 78

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