赤红球菌定量蛋白质组学及其二鸟苷酸环化酶的融合表达和催化特性研究

论文摘要

红球菌作为一类耐有机溶剂的极端微生物,在生物转化和生物修复等领域具有潜在作用。挖掘赤红球菌SD3菌株有机溶剂响应相关蛋白并进行功能表征,有利于加深对微生物有机溶剂耐受性机制的理解,也能促进微生物在有机相催化反应中的应用。本研究的主要内容和结果如下:1)通过iTRAQ标记技术和液相色谱-串联质谱方法分析了赤红球菌SD3菌株在甲苯和苯酚胁迫下响应情况。与对照组相比,分别鉴定出362和488个差异蛋白。同时挖掘了赤红球菌SD3菌株的有机溶剂耐受性相关的应激蛋白、膜蛋白、调控系统和代谢途径。此外,应用qPCR在转录水平上证明甲苯或苯酚胁迫下,赤红球菌SD3菌株的CspA家族应激蛋白、4-硝基苯酚2-单加氧酶和二鸟苷酸环化酶的表达水平发生了上调。2)通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶基因dgc,利用生物信息学手段对二鸟苷酸环化酶（diguanylate cyclase,DGC）的理化性质和结构特征进行分析,初步判断DGC蛋白是含6段跨膜区的疏水性蛋白,含有50%以上的稳定α螺旋结构,具有典型的GGDEF催化活性结构域。进化树分析表明赤红球菌SD3和食醚红球菌的DGC亲缘关系较近,推测赤红球菌SD3的DGC也属于Class III nucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能。通过I-TASSER建模工具得到了DGC蛋白的三级结构,利用分子对接技术模拟了底物GTP与DGC蛋白通过疏水作用和氢键产生相互作用,从而形成稳定结合的构象。3)为了进一步研究赤红球菌SD3有机溶剂响应相关蛋白二鸟苷酸环化酶的功能和合成c-di-GMP的活力。对赤红球菌SD3中的dgc基因进行密码子优化,构建了重组表达质粒pPGH-Dgcs,并转入E.coli BL21（DE3）进行异源表达。通过优化表达条件,在16℃和0.1 mM IPTG诱导条件下,融合GST标签以帮助DGC膜蛋白的正确折叠和异源表达。经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化得到一个新的全长GST-DGC融合蛋白,并由LC-MS/MS分析确定为目的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定GST-DGC蛋白的大小为71.9 kDa,与理论值73.0 kDa大致相符。Blue Native PAGE结果表明GST-DGC融合蛋白形成了八聚体。GST-DGC酶的最适反应pH值和最适反应温度分别为8.0和47°C,并且表现出高热稳定性,在87℃孵育1 h后,依然保留了94%的活性。此外,GST-DGC融合蛋白也表现出pH稳定性。该酶催化GTP底物生成c-di-GMP的反应动力学分析表明,其Km、Vmax和Kcat值分别为9.8μM、0.7μM/min和1.3 S-1。一些金属离子如Zn2+、Mn2+、Fe2+、Ni2+和Co2+对GST-DGC蛋白质有抑制作用,而金属离子Mg2+、K+和Na+和螯合剂EDTA则对GST-DGC蛋白质有激活作用。更重要的是,该融合蛋白在甲苯、环己烷和正己烷存在下也显示出相当高的稳定性。进一步应用分子对接方法预测了GST-DGC蛋白可能的金属离子和有机溶剂激活或抑制位点,为酶分子的定点改造以提高c-di-GMP产量提供靶点。总之,本研究通过蛋白质组学和荧光定量PCR初步证明了二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关系。首次异源表达得到红球菌中含有6段跨膜区的完整二鸟苷酸环化酶,与已报道的海栖热袍菌嗜热二鸟苷酸环化酶的Kcat值2.6 min-1相比,本研究纯化得到GST-DGC融合蛋白催化合成c-di-GMP效率提高了约30倍。本研究为大规模催化合成c-di-GMP提供了可能,为揭示二鸟苷酸环化酶与微生物有机耐受性的关联机制奠定基础。

论文目录

摘要

Abstract

第1章前言

1.1 红球菌与有机溶剂耐受性

1.2 二鸟苷酸环化酶及其功能

1.3 环二鸟苷酸的作用

1.4 蛋白质组学在耐有机溶剂微生物研究中的应用

1.5 膜蛋白可溶性表达及条件优化

1.6 研究内容和意义

第2章有机溶剂胁迫下赤红球菌SD3 定量蛋白质组学研究

2.1 材料与仪器

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 试剂、培养基和常用仪器

2.2 方法

2.2.1 赤红球菌SD3 的复苏

2.2.2 甲苯和苯酚胁迫下赤红球菌SD3 的生长曲线测定

2.2.3 菌体生长与总蛋白提取

2.2.4 蛋白质样品还原烷基化和酶解

2.2.5 iTRAQ试剂标记

2.2.6 高pH反相液相色谱第一维分离

2.2.7 LC-MS/MS分析蛋白质表达水平

2.2.8 蛋白质组数据搜索和数据分析

2.2.9 实时荧光定量PCR

2.3 结果与讨论

2.3.1 甲苯和苯酚胁迫下赤红球菌SD3 的生长曲线

2.3.2 赤红球菌SD3 总蛋白提取

2.3.3 蛋白质组主要数据分析结果

2.3.4 甲苯处理组差异表达的蛋白

2.3.5 甲苯处理下的常见应激蛋白

2.3.6 甲苯处理下的膜蛋白表达情况

2.3.7 甲苯胁迫相关的代谢途径

2.3.8 苯酚处理组差异表达的蛋白

2.3.9 苯酚处理下的膜蛋白表达情况

2.3.10 苯酚胁迫下的细胞膜修饰

2.3.11 苯酚胁迫相关的调控系统

2.3.12 苯酚胁迫相关的代谢途径

2.3.13 实时荧光定量PCR结果分析

第3章 Dgc基因的生物信息学分析

3.1 材料与仪器

3.1.1 菌株和质粒

3.1.2 试剂和培养基

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 菌株培育和基因组提取

3.2.2 Rhodococcus ruber SD3中dgc基因的克隆

3.2.3 基本序列信息分析

3.2.4 DGC与底物GTP的分子对接

3.3 结果与讨论

3.3.1 Dgc基因的克隆

3.3.2 DGC蛋白的基本理化性质分析

3.3.3 DGC蛋白的同源序列比对和进化树分析

3.3.4 R.ruber SD3中DGC蛋白结构分析

3.3.5 分子对接结果分析

第4章 DGC蛋白的表达、纯化和酶学性质分析

4.1 材料与仪器

4.1.1 菌株和质粒

4.1.2 试剂和培养基

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 大肠杆菌感受态制备和热激转化法

4.2.2 Dgc基因密码子优化和基因合成

4.2.3 pET-28a（+）-Dgcs和 pPGH-Dgcs重组质粒的的构建

4.2.4 重组质粒在BL21（DE3）中的表达和条件优化

4.2.5 GST-DGC蛋白的大量纯化

4.2.6 Blue native电泳

4.2.7 考马斯亮蓝G-250 法（Bradford）测定蛋白质浓度

4.2.8 LC-MS/MS分析GST-DGC蛋白

4.2.9 磷酸-香草醛显色法鉴定GST-DGC蛋白

4.2.10 酶切去除GST标签

4.2.11 酶活测定

4.2.12 GST-DGC融合蛋白的表征

4.2.13 GST-DGC蛋白圆二色谱分析

4.2.14 GST-DGC蛋白的活性位点预测

4.3 结果与讨论

4.3.1 表达质粒的构建

4.3.2 DGC膜蛋白的异源表达条件的优化

4.3.3 亲和层析纯化DGC膜蛋白

4.3.4 蛋白质浓度测定标准曲线绘制

4.3.5 GST-DGC蛋白的blue native电泳分析

4.3.6 GST-DGC蛋白的LC-MS/MS分析

4.3.7 GST-DGC蛋白的磷酸-香草醛显色反应

4.3.8 酶活测定标准曲线的绘制

4.3.9 GST-DGC融合蛋白酶学性质分析

4.3.10 金属离子和有机溶剂对GST-DGC融合蛋白酶活性的影响

4.3.11 GST-DGC融合蛋白的酶促反应动力学分析

4.3.12 GST-DGC融合蛋白的结构预测和分析

4.3.13 GST-DGC融合蛋白的金属离子和有机溶剂结合位点预测

第5章结论

5.1 工作结论

5.2 本研究创新点

5.3 问题与展望

参考文献

附录

致谢

在读期间公开发表论文（著）及科研情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 匡素芳

导师: 彭仁

关键词: 赤红球菌,同位素标记相对和绝对定量,实时荧光定量,二鸟苷酸环化酶,表达与纯化

来源: 江西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江西师范大学

分类号: Q93

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赤红球菌定量蛋白质组学及其二鸟苷酸环化酶的融合表达和催化特性研究

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