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树鼩免疫球蛋白重链基因座位分析及体液免疫检测系统的建立

2020-12-08阅读(449)

树鼩免疫球蛋白重链基因座位分析及体液免疫检测系统的建立

论文摘要

树鼩属攀鼩目树鼩科,树鼩的亲缘关系和灵长类接近,在神经发育、病毒感染及生理解剖表现出和灵长类高度相似的特点;树鼩相较于灵长类动物具有体积小、易操作、繁殖周期短等优势,是临床前研究理想的实验动物,因此科学家将树鼩作为研究人类疾病的动物模型之一。随着树鼩动物模型的推广和应用,发现树鼩的免疫球蛋白的的基因座位及免疫球蛋白的多样性机制尚未研究清楚并且导致缺乏相应的体液免疫检测手段,动物实验局限在病理学特征的分析,缺乏对特定病理情况下树鼩体液免疫应答的研究;因此,针对树鼩体液免疫检测手段的缺乏,本研究通过比对二代测序和转录本测序及分析抗体特性,确定树鼩免疫球蛋白重链的基因序列及分布,克隆树鼩免疫球蛋白序列制备基因工程抗体。树鼩免疫球蛋白重链基因座位（IgHC Locus）113.489Kb的序列位于Scaffold1435961中,但存在20个缺口。因此,本研究首先完成树鼩IgHCLocus序列缺口的填补与树鼩血液转录本测序比对,结合抗体特性分析树鼩基因组序列中形成抗体结构域的位点及抗体结构域半胱氨酸间氨基酸序列同源性分析,通过RACE技术克隆树鼩重链全序列,确定免疫球蛋白重链基因座位排布及种类;根据λ链序列（Gene ID:102495356）和K链序列（Gene ID:102503246）克隆树鼩免疫球蛋白轻链全序列,构建重组质粒,采用哺乳动物CHO细胞表达系统表达并纯化重组树鼩免疫球蛋白;纯化后的蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠和山羊,制备小鼠抗树鼩IgG和山羊抗树鼩IgG抗体,检测树鼩体内IgG抗体浓度和树鼩与不同物种血清间的交叉反应;通过破伤风类毒素和C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖免疫小鼠和树鼩,HSV-1和HCV感染树鼩和小鼠,ELISA检测两个物种抗体水平的变化和差异。经上述实验,确定了树鼩免疫球蛋白重链基因座位,同时成功建立了树鼩体液免疫检测系统,填补了树鼩体液免疫检测手段缺乏的空白,为今后树鼩动物模型的建立奠定基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 绪论
  •   1.免疫球蛋白
  •     1.1 免疫球蛋白的基本结构和功能
  •       1.1.1 免疫球蛋白分子的结构
  •       1.1.2 免疫球蛋白的功能
  •     1.2 免疫球蛋白多样性的产生机制
  •       1.2.1 V（D）J重组
  •       1.2.2 体细胞高突变
  •       1.2.3 基因转换
  •       1.2.4 类别转换
  •     1.3 不同物种免疫球蛋白基因座位结构特点
  •       1.3.1 人免疫球蛋白重链基因的结构特点
  •       1.3.2 小鼠免疫球蛋白重链基因的结构特点
  •       1.3.3 其他物种免疫球蛋白重链基因的结构特点
  •   2.树鼩简介
  •   3.基因工程抗体
  •   4.本课题的研究意义、目的和基本策略
  • 第一部分 树鼩免疫球蛋白重链基因座位分析
  •   1 材料和方法
  •     1.1 材料
  •       1.1.1 实验动物
  •       1.1.2 菌种
  •       1.1.3 主要试剂
  •       1.1.4 主要仪器设备
  •       1.1.5 试剂配制
  •     1.2 方法
  •       1.2.1 树鼩肝脏基因组DNA提取
  •       1.2.2 引物设计
  •       1.2.3 树鼩IgHC Locus基因座序列缺口填补
  •       1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
  •       1.2.5 琼脂糖凝胶中回收DNA片段
  •       1.2.6 纯化产物连接pMD19-T载体
  •       1.2.7 DH5α感受态的制备
  •       1.2.8 转化感受态细胞DH5α
  •       1.2.9 质粒小提
  •   2.结果
  • 1 IgHC Locus基因组缺口填补'>    2.1 树鼩Scaffold1435961 IgHC Locus基因组缺口填补
  •   3.讨论及小结
  • 第二部分 树鼩抗体序列分析及克隆
  •   1 材料和方法
  •     1.1 材料
  •       1.1.1 实验动物
  •       1.1.2 菌种
  •       1.1.3 质粒
  •       1.1.4 主要试剂
  •       1.1.5 主要仪器设备
  •       1.1.6 试剂配制
  •     1.2 方法
  •       1.2.1 树鼩肝脏RNA提取
  •       1.2.2 树鼩肝脏总RNA逆转录
  •       1.2.3 引物设计
  •       1.2.4 树鼩各免疫球蛋白基因序列PCR扩增
  •       1.2.5 琼脂糖凝胶中回收DNA片段
  •       1.2.6 纯化产物连接载体
  •       1.2.7 抗体序列分析
  •       1.2.8 质粒小提
  •       1.2.9 质粒酶切鉴定
  •       1.2.10 质粒大提
  •   2 结果
  •     2.1 初步确定树鼩抗体位置
  •     2.2 3'/5'RACE PCR扩增树鼩抗体基因片段
  •     2.3 筛选完整编码树鼩抗体的氨基酸序列及其信号肽分析
  •     2.4 树鼩抗体结构域形成位点及氨基酸数目分析
  •     2.5 树鼩免疫球蛋白重链基因座位排布和兔型相似
  •   3.讨论与小结
  • 第三部分 树鼩抗体的重组表达及纯化
  •   1 材料和方法
  •     1.1 材料
  •       1.1.1 细胞
  •       1.1.2 质粒
  •       1.1.3 主要试剂
  •       1.1.4 主要仪器设备
  •       1.1.5 试剂配制
  •     1.2 方法
  •       1.2.1 ExpiCHO-S细胞的复苏
  •       1.2.2 ExpiCHO-S细胞的培养
  •       1.2.3 ExpiCHO-S细胞的冻存
  •       1.2.4 ExpiCHO-S细胞表达树鼩抗体
  •       1.2.5 树鼩重组抗体及血清纯化
  •       1.2.6 蛋白含量测定
  •       1.2.7 Western Blot检测IgA-V5、IgM-V5、IgE-V5抗体的表达
  •   2.结果
  •     2.1 双质粒转染ExpiCHO细胞抗体表达量比单质粒转染效果更优
  •     2.2 Western Blot验证IgA-V5、IgM-V5、IgE-V5的表达
  •     2.3 ExpiCHO细胞表达树鼩重组抗体浓度测定
  •   3.讨论与小结
  • 第四部分 树鼩IgG二抗的制备与检测
  •   1 材料和方法
  •     1.1 材料
  •       1.1.1 实验动物
  •       1.1.2 主要试剂
  •       1.1.3 主要仪器设备
  •       1.1.4 试剂配制
  •     1.2 方法
  •       1.2.1 免疫程序
  •       1.2.2 血清纯化
  •       1.2.3 小鼠抗树鼩IgG抗体标记
  •       1.2.4 山羊抗树鼩IgG抗体标记
  •       1.2.5 间接ELISA法检测抗体效价及特异性
  •       1.2.6 Western Blot检测HRP标记小鼠抗树鼩IgG抗体特异性
  •       1.2.7 流式检测FITC标记的小鼠抗树鼩IgG特异性
  •       1.2.8 IFA检测ExpiCHO细胞表达树鼩IgG特异性
  •       1.2.9 ELISA定量检测树鼩血清IgG含量
  •   2.结果
  •     2.1 ELISA检测重组抗体树鼩IgG免疫小鼠后抗体效价
  •     2.2 HRP标记的小鼠抗树鼩IgG有较强的种属特异性
  •     2.3 山羊抗树鼩IgG效价及HRP标记的山羊抗树鼩IgG种属特异性检测
  •     2.4 FITC标记的小鼠抗树鼩IgG抗体可用于流式检测
  •     2.5 小鼠抗树鼩IgG可用于IFA检测
  •     2.6 树鼩血清IgG含量定量检测
  •   3.讨论与小结
  • 第五部分 疫苗免疫及病毒感染树鼩后的免疫学分析
  •   1 材料和方法
  •     1.1 材料
  •       1.1.1 实验动物
  •       1.1.2 病毒
  •       1.1.3 动物免疫所用疫苗及蛋白
  •       1.1.4 主要试剂和耗材
  •       1.1.5 主要仪器设备
  •       1.1.6 引物
  •       1.1.7 试剂配制
  •     1.2 方法
  •       1.2.1 树鼩病毒感染实验
  •       1.2.3 小鼠病毒感染实验
  •       1.2.4 树鼩和小鼠免疫疫苗实验
  •       1.2.5 C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖免疫树鼩和小鼠
  •       1.2.6 小鼠血清IgG纯化
  •       1.2.7 HSV-1感染树鼩、小鼠后的体液免疫检测
  •       1.2.8 HCVcc感染树鼩、小鼠后的体液免疫检测
  •       1.2.9 破伤风类毒素免疫小鼠和树鼩后的体液免疫检测
  •       1.2.10 树鼩和小鼠血清总RNA提取
  •       1.2.11 实时荧光定量检测
  •       1.2.12 杀菌力实验检测
  •   2.结果
  •     2.1 树鼩感染HSV-1后可高效快速产生体液免疫反应
  •     2.2 HCVcc感染树鼩不引发显著体液免疫反应
  •     2.3 免疫破伤风类毒素后树鼩的特异性抗体含量较小鼠低
  •     2.4 树鼩免疫C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖后血清对C群脑膜炎奈瑟菌有杀菌效果
  •   3.讨论及小结
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 附录 缩略词
  • 致谢
  • 研究生简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张晶晶

    导师: 寸韡

    关键词: 树鼩,免疫球蛋白,重链基因座位,体液免疫

    来源: 北京协和医学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 北京协和医学院

    分类号: Q78

    DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000390

    总页数: 111

    文件大小: 8011K

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