PRL1突变体抑制子IYO调控miRNA合成的分子机制研究

论文摘要

micro RNA（miRNA）是广泛存在于真核生物体内的一段长度在18-25nt的非编码RNA,能够在转录后水平调控基因表达,参与植物生长发育、生物和非生物逆境生理等过程。miRNA通过碱基互补配对与靶基因mRNA结合,降解靶标mRNA或抑制其翻译过程从而调控植物生理进程。PLEIOTROPIC REGULATORY LOCUS 1（PRL1）是具有保守WD40结构域的RNA结合蛋白,参与miRNA的合成加工过程。PRL1正向调控miRNA和siRNA在拟南芥中的积累,通过影响DICER-LIKE 1（DCL1）的活性来调控pri-miRNA和dsRNA的加工。prl1-2是PRL1 T-DNA插入突变体,其pri-miRNA表达水平与miRNA积累水平严重下降,表现出严重的发育缺陷。本研究以prl1-2突变体为材料,采用EMS诱变的方法正向筛选能够回复prl1-2突变体表型的双突变体植株,并进行基因克隆和功能研究,获得能够影响miRNA调控通路的新因子。通过一系列的遗传和生化研究,揭示PRL1与新因子之间的相互联系,进一步阐明PRL1调控miRNA合成代谢的分子机制。获得主要结果如下:（1）获得11个prl1-2突变体抑制子。EMS诱变prl1-2突变体种子,种植至M2代进行表型分析筛选能够回复prl1-2突变体表型的株系,获得11个prl1-2突变体抑制子植株。其中P27S1能够回复prl1-2突变体表型,P27S1双突植株长势和野生型Col相比没有明显差异,叶片发育正常,根系发育也完全回复prl1-2突变体短根的表型。Stem-loop RT-PCR检测P27S1中成熟miRNA表达水平发现miR156、miR167、miR171与miR173积累水平明显高于prl1-2,接近Col水平。qRT-PCR检测P27S1双突变体中miRNA初级转录本（pri-miRNA）和miRNA靶标基因表达水平显示主要pri-miRNA（pri-miR167、pri-miR171、pri-miR172）近乎完全回复PRL1突变造成的pri-miRNA水平下降和相关miRNA靶标基因表达水平升高的现象。（2）P27S1编码转录延伸因子IYO。P27S1双突变体与prl1突变体（Ler背景）杂交构建图位克隆群体,粗定位显示突变基因位于第一或第四染色体。P27S1双突变体与prl1-2回交构建回交分离群体,选取P27S1表型的植株98棵进行混池全基因组重测序,重测序结果分析获得4个候选突变基因,分别是At4g38440、At1g53360、At4g33210、At5g04590,通过测序与基因型鉴定等方式证实突变位点基因为At4g38440。At4g38440在拟南芥数据库中对应IYO基因,编码与分化起始相关的转录延伸因子,通过克隆全长基因组序列并转化P27S1,阳性植株均表现出近prl1-2表型,验证了基因克隆的结果。（3）IYO与PRL1、SE（SERRATE）相互作用影响pri-miRNA的加工。通过双分子荧光互补验证转录延伸因子IYO同PRL1之间的相互关系,结果表明IYO能够同PRL1互作。同时IYO与剪接复合体关键组分SERRATE互作,表明IYO影响miRNA的加工过程。

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中文摘要

Abstract

1 前言

1.1 miRNA的发现

1.2 植物miRNA的产生

1.2.1 参与MIR基因转录合成过程的关键蛋白因子

1.2.2 pri-miRNA的转录后水平调控

1.2.2.1 pri-miRNA的转录后修饰

1.2.2.2 pri-miRNA的加工过程

1.3 miRNA调控基因沉默

1.4 PRL1 研究进展

1.5 IYO研究进展

1.6 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物研究材料

2.1.2 酶与生物化学试剂

2.1.2.1 植物培养所需试剂

2.1.2.2 载体构建所需试剂

2.1.2.3 RNA提取与实时荧光定量PCR试剂

2.1.2.4 遗传转化所需试剂

2.1.2.5 其他生化试剂

2.1.3 生物数据库和分析软件

2.1.4 引物设计

2.2 主要培养基及试剂的配制

2.2.1 主要培养基配制

2.2.2 主要抗生素的配制

2.2.3 EMS诱变主要试剂的配制

2.2.4 核酸提取主要试剂的配制

2.2.4.1 植物基因组DNA精提试剂2×CTAB提取缓冲液配制

2.2.4.2 DNA粗提缓冲液配制

2.2.4.3 干种子RNA提取Elution Buffer配制

2.2.5 核酸电泳缓冲液配制

2.3 实验技术及方法

2.3.1 EMS突变及表型观察

2.3.2 拟南芥种植

2.3.2.1 营养土中拟南芥的培养

2.3.2.2 1/2MS培养基中培养拟南芥

2.3.3 转录水平检测方法

2.3.3.1 拟南芥RNA提取

2.3.3.2 拟南芥干种子和角果RNA提取

2.3.3.3 RNA浓度与质量监测

2.3.3.4 植物总RNA反转录

2.3.3.5 miRNA反转录

2.3.3.6 荧光实时定量PCR

2.3.3.7 Stem-loop qRT-PCR

2.3.4 拟南芥图位克隆粗定位与全基因组重测序

2.3.4.1 拟南芥有性杂交

2.3.4.2 图位克隆群体构建与突变基因粗定位

2.3.4.3 拟南芥全基因组重测序克隆群体的建立

2.3.4.4 CTAB法提取植物DNA（精提）

2.3.4.5 全基因组重测序文库的建立

2.3.4.6 拟南芥重测序结果分析

2.3.5 载体构建

2.3.5.1 PCR扩增目的序列

2.3.5.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳及纯化

2.3.5.3 酶切与连接

2.3.5.4 大肠杆菌热激转化法

2.3.5.5 碱裂解法小提质粒

2.3.5.6 入门载体构建

2.3.5.8 LR反应

2.3.6 回补系和过表达系的建立

2.3.6.1 冻融法转化农杆菌

2.3.6.2 农杆菌浸染拟南芥花序

3 实验结果

3.1 prl1-2 EMS诱变群体建立及prl1-2 抑制子筛选

3.2 P27S1 可以回补prl1-2 的发育表型

3.3 P27S1 中主要miRNA、pri-miRNA及 miRNA靶标基因表达水平检测

3.3.1 P27S1 中主要miRNA表达水平

3.3.2 P27S1 中主要靶标基因mRNA表达水平

3.3.3 P27S1 中主要pri-miRNA表达水平

3.4 miRNA调控途径关键蛋白因子表达水平

3.5 P27S1 双突变体中突变基因的确定

3.5.1 图位克隆初步定位突变基因

3.5.2 拟南芥基因组重测序确定突变基因

3.5.3 P27S1 突变体基因型鉴定

3.6 抑制子的转基因互补

3.6.1 构建IYO回复突变载体

3.6.2 IYO互补表达载体转化农杆菌并侵染P27S

3.7 IYO过表达影响植物生长发育

3.8 双分子荧光互补验证蛋白间相互作用与IYO亚细胞定位

3.9 IYO是核定位蛋白

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文及成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郭徐雷

导师: 张数鑫

关键词: 突变

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山东农业大学

分类号: Q943.2

总页数: 65

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