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寨卡病毒突变株的构建和减毒株的初步筛选

2020-12-08阅读(270)

寨卡病毒突变株的构建和减毒株的初步筛选

论文摘要

[目的]本研究首先分析寨卡病毒亚洲型和非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、prM核苷酸和氨基酸序列差异,以登革的毒力位点作为寨卡的参考,探究Ⅲ型登革病毒在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响,在病毒毒力与位点突变有相关性的基础上,利用反向遗传学技术构建寨卡病毒突变株并进行寨卡减毒株的初步筛选。[方法]分别选择五个不同的寨卡病毒亚洲型和非洲型全长基因组序列,并获得它们相应的氨基酸序列,采用BIOEDIT软件进行比对,分析相似度,统计不同型别间结构蛋白C、prM的核苷酸突变和氨基酸替代位点;将两株Ⅲ型登革病毒在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种到Vero细胞上连续传代培养,用Ⅲ型登革标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,并通过RCR扩增全长获得全长序列,与原代病毒序列比对;将寨卡全长克隆质粒进行分析,并结合登革的毒力位点,确定寨卡基因组上可操作的毒力位点,利用定点突变的方式将寨卡全长克隆质粒上的毒力位点突变,得到突变质粒,将改造后的骨架进行体外转录,转染到Vero细胞拯救病毒,拯救出来的病毒利用RT-PCR、免疫荧光鉴定、拯救病毒增殖特性分析、蚀斑实验、成鼠乳鼠接种实验鉴定其生物学特征。[结果]寨卡病毒亚洲型和非洲型的核酸相似性在88.00%-89.00%之间,不同型别的结构蛋白C和prM碱基的突变比较显示C基因一共有19个碱基突变,prM基因一共有48个碱基突变,氨基酸翻译比对显示这67个碱基突变均为有效突变。优选出一株Ⅲ型登革病毒在C6/36上毒力增强（P17-C6/36）,后在Vero细胞上毒力减弱（P10-Vero）,全基因分析PO、P17-C6/36、P10-Vero发现全长碱基共有16处发生突变,导致了 12个氨基酸的非同义突变。其中,碱基第5826位点、第6251位点、第7907位点均表现为P0和P10-Vero碱基相同,而P17-C6/36碱基发生突变,且对应的氨基酸位点第1942位点、第2084位点、第2636位点均发生非同义突变,寨卡毒力位点分析显示可进行一个减毒位点的突变和四个增毒位点的突变,成功构建并拯救寨卡突变病毒 Pzika-FL-G53D、Pzika-FL-T47S、Pzika-FL-S64T、Pzika-FL-V255A、Pzika-FL-S260T,并初步表明 Pzikv-FL-G53D 较 Pzikv-FL 在细胞水平上有一定的减毒效果,通过两日龄乳鼠寨卡注射实验显示Pzikv-FL-G53D较Pzikv-FL具有更低的神经毒力。[结论]单位点的突变可能对病毒株的致病性、感染性等造成影响,传代细胞更换对登革病毒的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为研究寨卡病毒生物学和致病性差异提供参考,为后续寨卡病毒减毒策略的研究提供了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  •   1. 寨卡病毒的介绍
  •     1.1 寨卡病毒
  •     1.2 寨卡病毒的发现和流行
  •     1.3 寨卡病毒的蛋白功能
  •     1.4 寨卡感染机制
  •   2. 寨卡研究动物模型及疫苗研究进展
  •     2.1 寨卡研究动物模型
  •     2.2 寨卡疫苗研究的迫切性
  •     2.3 寨卡疫苗的研究进展
  •     2.4 反向遗传学技术
  •   3. 登革病毒介绍
  •   4. 本研究的目的和意义
  • 第一部分 寨卡病毒和登革病毒毒力位点研究
  •   1 实验材料
  •     1.1 质粒、细胞与毒种
  •     1.2 主要试剂与耗材
  •     1.3 主要仪器与设备
  •     1.4 主要溶液配方
  •     1.5 实验所用引物
  •   2 实验方法
  •     2.1 寨卡病毒亚洲型与非洲型基因同源性及突变分析
  •     2.2 Ⅲ型登革病毒在C6/36和Vero细胞中复制毒力改变
  •   3 结果与分析
  •     3.1 寨卡病毒亚洲型与非洲型基因同源性及突变分析
  •     3.2 Ⅲ型登革病毒在C6/36和Vero细胞中复制毒力改变
  •   4 讨论
  • 第二部分 寨卡病毒毒力位点突变株的构建
  •   1 实验材料
  •     1.1 主要试剂
  •     1.2 工程菌与质粒
  •     1.3 实验引物
  •   2 实验方法
  •     2.1 寨卡病毒毒力位点的寻找
  •     2.2 寨卡突变株的构建
  •     2.3 质粒鉴定
  •     2.4 菌液扩大培养和质粒提取
  •   3 结果与分析
  •     3.1 寨卡病毒毒力位点的确定
  •     3.2 寨卡病毒突变株的构建
  •     3.3 质粒鉴定
  •     3.4 菌液扩大培养和质粒提取
  •   4 讨论
  • 第三部分 寨卡突变株的拯救
  •   1 实验材料
  •     1.1 主要试剂与耗材
  •     1.2 主要仪器
  •   2 实验方法
  •     2.1 线性化突变病毒株
  •     2.2 回收线性化病毒株
  •     2.3 体外转录线性化病毒
  •     2.4 RNA转染
  •     2.5 病毒的收获及鉴定
  •   3 结果与分析
  •     3.1 线性化突变病毒株
  •     3.2 回收线性化病毒株
  •     3.3 体外转录线性化病毒
  •     3.4 RNA转染
  •     3.5 拯救病毒的收获与鉴定
  •   4 讨论
  • 第四部分 寨卡突变株G53D生物学特性和神经毒力检测分析
  •   1 实验材料
  •     1.1 主要试剂与耗材
  •     1.2 细胞系
  •     1.3 实验用动物
  •   2 实验方法
  •     2.1 增殖动力学测定
  •     2.2 蚀斑形态分析
  •     2.3 成鼠神经毒力检测
  •     2.4 乳鼠神经毒力检测
  •   3 结果与分析
  •     3.1 增殖动力学测定
  •     3.2 蚀斑形态分析
  •     3.3 成鼠神经毒力检测
  •     3.4 乳鼠神经毒力检测
  •   4 讨论
  • 结论与展望
  •   1. 结论
  •   2. 创新点
  •   3. 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 研究生简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 林垚

    导师: 孙强明

    关键词: 寨卡病毒,定点突变,登革病毒,减毒

    来源: 北京协和医学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 北京协和医学院

    分类号: R373

    DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000491

    总页数: 76

    文件大小: 4561K

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