胡洋[1]2003年在《h-CR1及m-CR1基因在E.coli和Pichia pastoris中的克隆表达及其抗体制备》文中研究表明h-CR1基因(Human Cell Regulatorl，细胞信号调节因子1，简称h-CR1，AC021016)为医科院医药生物技术研究所代谢工程室克隆发现的新基因，初步研究表明该基因与肌肉收缩调控以及细胞信息传导和凋亡过程相关，为一种膜蛋白。蛋白文库检索显示在小鼠、大鼠、牛、猪等动物中有与h-CR1保守序列，而在酵母和苍蝇中没有相似序列，表明CR1基因有可能局限于哺乳动物基因组中。 本研究通过生物信息学分析设计合成引物，分离C57BL／6J小鼠脾脏细胞、提取总RNA，采用RT-PCR技术克隆得到了450bp大小的目的条带，经测序证明包含一个与h-CR1基因高度同源的完整ORF，将此序列命名m-CR1。比较发现，m-CR1与h-CR1蛋白具有极高的保守性，均由142个氨基酸编码组成，两者间13处氨基酸差异有10处为同族氨基酸变异，同源性达到90.1％。 利用质粒pPIC9和pET24a(+)DNA构建了h-CR1基因毕赤酵母GS115表达载体及N端和／或C端带有融合蛋白的多种大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL表达载体。建立了h-CR1基因的甲醇酵母整合分泌型表达系统，以及N端融合有T7-Tag的大肠杆菌包涵体型高效表达系统。最终确定采用后者进行大量表达的蛋白制备抗体。用同样方法使m-CR1基因在大肠杆菌系统中获得成功表达。 根据CR1蛋白为膜蛋白的理化性质，采用了包涵体溶解液透析收集沉淀、制备电泳、电洗脱的方法进行融合蛋白的纯化，得到纯度约95％，浓度约2mg／ml的蛋白样品。利用纯化的Tag-hCR1和Tag-mCR1融合蛋白免疫兔子制备了兔抗二者的多克隆抗体。分别用免疫单扩、ELISA和Western等多种方法进行定性、定量分析，检测所制备抗体滴度达到1:1×10~5以上，特异性较好。本论文的工作为进一步在免疫学及细胞学方面研究CR1的生物学功能提供了可能。
汪婷婷[2]2011年在《刺参叁种免疫基因的克隆、表达及功能研究》文中研究说明刺参(Apostichopus japonicus)是我国北方重要的珍稀海洋养殖品种之一,对刺参的免疫系统缺乏了解成为制约对其营养和免疫机制进行深入研究的瓶颈。NF-kB是动物天然免疫系统中的关键因子,调控着包括细胞因子在内的多种免疫基因的表达,溶菌酶是水产动物最重要的体液免疫因子之一,在天然免疫防御中发挥着重要的作用。本研究对刺参NF-KB信号通路中的Aj-rel和Aj-p105基因以及体液免疫基因Aj-lysozyme进行了克隆鉴定,并进行了蛋白表达以及功能研究,这将为进一步了解刺参的免疫防御机制以及开发新型免疫增强剂提供依据,主要实验内容与结果如下：(1)通过RT-PCR技术扩增得到了刺参Aj-Rel和Aj-p105基因的部分片段,利用3'RACE和5'RACE技术获得了刺参核转录因子Aj-rel和Aj-p105的全长序列。Aj-rel具有NF-KB蛋白特征性的RHD结构域及以及DNA结合基序和核定位信号,Aj-p105除具有上述结构以外,还有p105蛋白特有的锚蛋白重复结构域和DEATH结构域,进化树分析表明Aj-rel和Aj-p105分别属于“Rel类”和“NF-KB类”核转录因子。根据Genebank上发表的刺参lysozyme序列,通过RT-PCR技术扩增得到刺参Aj-lysozyme基因的全长序列,经测序正确后进行后续试验。(2)构建了Aj-rel和Aj-p105的原核表达载体,进行了重组蛋白的表达,利用Ni-NTA螯合亲和层析纯化方法对表达产物分离纯化后免疫动物获得抗体。Western Blot表明所制备的抗体可用于刺参Aj-rel,Aj-p105及Aj-p50的检测。用免疫共沉淀和Western Blot技术进行了Aj-rel和Aj-p105的相互作用的研究,结果表明Aj-Rel经免疫共沉淀后,经Western Blot可检测到Aj-p105和Aj-p50,说明Aj-Rel可分别同Aj-p105和Aj-p50形成二聚体,Aj-p105和Aj-p50经免疫共沉淀后,经Western Blot可检测到Aj-Rel,进一步证明了它们之间存在相互作用。(3)构建了刺参溶菌酶基因的毕赤酵母表达载体pPIC9K-lys,转化入酵母菌株GS115中筛选His+Muts型高拷贝转化菌株用于表达。经过表达条件优化确定表达高峰在192h(第八天),最佳甲醇浓度为1%,最佳pH为5,优化后的表达量可达50μg／ml。根据所确定的最佳表达条件进行重组刺参溶菌酶的表达,应用Ni-NTA螯合亲和层析方法纯化重组刺参溶菌酶,并进行抗体的制备。管碟法和比浊法研究纯化后的Aj-lysozyme的抗菌活性,表明与蛋清溶菌酶相比,Aj-lysozyme对溶壁微球菌和灿烂弧菌都表现出更强的抑菌活性。(4) Real-time PCR技术研究了LPS刺激后Aj-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的mRNA表达规律。Western Blot研究了LPS刺激后AJ-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的蛋白表达规律,表明LPS可通过NF-KB介导的信号通路发挥作用,刺参中NF-KB信号通路相关因子能够对LPS刺激做出快速反应,这与哺乳动物和昆虫中经典的NF-KB信号通路在功能上非常相似,表明NF-KB信号通路在功能上从刺参到人都很保守,在其天然免疫反应中发挥着重要作用。综上所述,本研究克隆了刺参的两个细胞免疫基因Aj-rel、Aj-p105和体液免疫基因Aj-lysozyme,分别在大肠杆菌表达载体和毕赤酵母表达载体中进行了表达,制备了相应的抗体,并进行了Aj-rel和Aj-p105相互作用以及重组Aj-lysozyme抑菌作用的研究,为了解刺参免疫系统的组成及其功能奠定了基础。LPS对Aj-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的mRNA水平和蛋白水平的影响的研究,将有助于了解Aj-rel、Aj-p105和Aj-lysozyme的表达规律,从而为深入了解刺参NF-KB信号通路的免疫调控机制,进一步开发免疫增强剂及实现刺参健康养殖提供理论指导。
李铁军[3]2008年在《抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究》文中指出甲胺磷(O,S-二甲基硫代磷酰胺)是一种剧毒的有机磷类农药,由于较好的杀虫效果往往被违禁使用,危害严重,有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点,在农药残留检测中具有突出的优势。目前虽有制备甲胺磷多克隆抗体和单克隆抗体的报道,但其抗体制备需进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备,周期长,成本高。第叁代抗体—重组抗体的出现为快速、低成本制备小分子化学农药抗体提供了新的途径。为此,本论文开展了抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及抗甲胺磷单链抗体的表达与特性研究,主要研究内容及结果如下：1 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析利用活泼酯法将合成的甲胺磷半抗原β-(O,S-二甲基磷酰)氨基丙酸(HM3)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联分别制备免疫原HM3-BSA和包被原HM3-OVA。将HM3-BSA按高(H)、中(M)、低(L)3个不同剂量组分别免疫Balb/c小鼠。抗血清分析结果表明,经过8次近6个月时间的免疫在高(H)剂量组中获得了1只良好免疫效果的H3号Balb/c小鼠。2抗体可变区基因的获得及抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建取H3号Balb/c免疫小鼠的脾细胞提取信使RNA(mRNA),通过反转录PCR (RT-PCR)扩增出了大小约340bp和320bp的抗体重(VH)、轻链(VL)可变区基因片段。纯化回收的VH与VL基因在接近等摩尔浓度下,首先采用含有Linker接头片段的引物利用重迭延伸拼接法(SOE-PCR)将VH与VL基因片段组装成单链抗体(ScFv)基因片段,再用带有限制性内切酶位点的引物(5’端SfiⅠ,3’端NotⅠ)扩增含内切酶位点的ScFv基因,获得了大小约750bp的目的片段,纯化回收并分别用SfiⅠ和NotⅠ酶切消化后,与经SfiⅠ、NotⅠ双酶切过的噬菌粒载体pCANTAB5E连接,电转化大肠杆菌E.coli TG1,建成了库容约9.8×105的抗甲胺磷噬菌体单链抗体库。经对随机转化子质粒的PCR及HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定,该抗体库重组率高。BstNⅠ酶切图谱显示该噬菌体单链抗体库具有良好的多样性。3抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定借助辅助噬菌体M13K07的超感染,扩建了滴度约1.75×1013pfu/mL的抗甲胺磷噬菌体-ScFv表面展示文库。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法,以包被原HM3-OVA对展示库进行了五轮“吸附、洗脱、扩增”的富集筛选,结果显示,从第叁轮开始,噬菌体回收率、多克隆噬菌体ELISA的OD值及阳性率均呈现上升趋势。从第5轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量单克隆,经单克隆噬菌体ELISA及竞争ELISA进一步筛选鉴定,获得了6个特异性较强的抗甲胺磷噬菌体单链抗体阳性克隆,基因序列分析及Blast数据库检索表明所得6个阳性克隆的序列互不相同,均符合鼠源单链可变区抗体基因的结构和特征。4抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定将6个甲胺磷噬菌体阳性克隆提取噬菌粒分别转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌E.coli HB2151, IPTG诱导过夜小量制备各克隆的可溶性单链抗体。收集细菌沉淀及培养上清,采用渗透休克法提取菌体细胞周质中的可溶性单链抗体,并对培养上清进行超滤浓缩。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,周质腔提取物及浓缩上清在分子量约30KD处明显出现一增粗条带,与单链抗体的预期分子量相符,而阴性对照菌中没有该条带。间接ELISA结果显示,6个克隆的细菌培养上清和周质腔提取物中的抗体均能与包被抗原反应,说明分泌型单链抗体得到了正确的折迭和表达。间接竞争ELISA初步分析6个克隆新鲜制备的周质腔提取物对游离甲胺磷的竞争抑制性,结果显示,6个克隆的表达产物对游离甲胺磷均具有不同程度的抑制作用,其中克隆Met-93的周质腔提取物抑制中浓度I50值最高(887.66μg/mL),克隆Met-28D4的周质腔提取物I50值最低(146.74μg/mL)。以抗体表达的最优化条件对Met-28D4阳性克隆株进行摇瓶发酵(1L)大量制备纯化单链抗体,抗体产量约0.98 mg/L培养基。以纯化单链抗体为免疫试剂,初步建立了甲胺磷竞争ELISA分析法。该ELISA标准曲线的线性范围为1～500μg/mL, I50为118.69μg/mL,检出限120为3.36μg/mL;在该线性范围内,标准曲线的批内和批间变异系数分别为2.3%和4.8%,稻谷和小白菜样品中添加甲胺磷后的平均回收率分别为83.8%和87.0%。交叉反应结果显示,本研究制备的纯化Met-28D4单链抗体仅与乙酰甲胺磷有部分交叉反应(4.9%),而与供试的其它5种有机磷农药(敌敌畏、乐果、甲拌磷、甲基对硫磷和水胺硫磷)的交叉反应率均小于0.1%,表明所制备的纯化单链抗体对甲胺磷的识别是高度特异的。抗体稳定性试验结果表明,在蛋白保护剂存在条件下,4℃保存下的纯化单链抗体其结合活性可维持约6-7周的时间,基本能满足短期内单链抗体研究的需要,但在大规模生产、应用等方面,就显得稳定性不够。5抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定在巴斯德毕赤酵母P. pastoris (X-33)中分泌表达Met-28D4-ScFv。设计引物从Met-28D4-pCANTAB5E-ScFv上扩增Met-28D4-ScFv,亚克隆至P. pastoris表达载体pPICZαC,获得酵母表达质粒pPICZαC-ScFv。表达质粒pPICZαC-ScFv线形化后,电转化P.pastoris (X-33)。随机挑选转化子菌落进行PCR鉴定,结果显示,转化子的酵母染色体中均整合有外源ScFv基因。在抗性梯度筛选多拷贝整合菌株试验中,共获得5个在2000μg/mL ZeocinTM的YPDS选择平板上正常生长的菌落,表型鉴定结果均为甲醇利用快速型(Mut+)。对5个多拷贝Mut+型转化菌进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE结果显示,各菌株诱导48 h后在约30KD处均可见明显条带,72 h处表达量最大,各菌株表达量之间无明显差异；间接ELISA结果显示,各菌株诱导72h的表达产物具有较好的抗原结合活性。选其中一个稳定高表达的X-33-Pp-Met-28D4-1菌株进行优化诱导表达试验,优化后的条件为：本实验室30℃、250 rpm的振荡培养条件下,菌体接种量OD600nm =1.5,培养基pH值6.5,每24 h补加甲醇至终浓度1.00%,诱导时间72 h。经过优化条件下的诱导表达,单链抗体的表达量达25 mg/L,比Invitrogen公司推荐的诱导表达条件下的表达量高5 mg/L。对优化条件下的诱导表达产物进行纯化并进行竞争ELISA初步试验,结果表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体与游离甲胺磷具有较好的抗原结合特异性,其I50为93.52μg/mL,与大肠杆菌表达的单链抗体的性质基本接近；交叉反应结果显示,酵母表达纯化单链抗体与乙酰甲胺磷的交叉反应率为3.8%,与其它农药的交叉反应率均小于0.1%。稳定性试验表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体的稳定性比大肠杆菌表达的单链抗体的稳定性有了一定的提高。本论文研究结果为甲胺磷特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础,对开发其它小分子化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。
王雷雷[4]2013年在《扇贝补体相关分子的结构及功能研究》文中研究指明补体系统是多细胞有机体内重要的免疫效应系统，在固有免疫防御中发挥重要作用。补体相关分子存在于多个无脊椎动物门类中，并参与了宿主的免疫防御。目前，软体动物补体相关分子以及补体激活途径的研究刚刚起步，亟待深入。本论文采用分子生物学、生物信息学和免疫学等多种技术，对栉孔扇贝（Chlamysfarreri）和海湾扇贝（Argopecten irradians）中的含C1q结构域蛋白（AiC1qDC-2，CfC1qDC-1和CfC1qDC-2）、含硫酯蛋白（CfTEP）、C型凝集素（AiCTL-9）以及纤维蛋白原相关蛋白（CfFREP）等补体相关分子进行了结构和功能的研究，探讨了它们在扇贝免疫系统中的作用。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子开放阅读框编码的蛋白序列中含有一个gC1q结构域，具有C1qDC蛋白家族典型的由十个β折叠片形成的球形结构以及特征氨基酸残基。RT-PCR检测结果显示AiC1qDC-2的mRNA主要在肝胰腺和性腺中表达，并且在扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显着上升。重组的AiC1qDC-2可结合LPS、PGN、Yeast-glucan和polyI：C等多种PAMPs，并可凝集Escherichia coli、Vibro anguillarum、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等微生物。利用RT-PCR技术检测了栉孔扇贝CfC1qDC-1mRNA的表达模式，发现LPS，PGN或β-glucan可显着上调血细胞中该分子的表达水平；在扇贝早期胚胎发育过程中该分子的表达量在D型幼虫期开始迅速上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光检测显示，CfC1qDC-1蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺、鳃、肾和性腺组织中。重组的CfC1qDC-1能够结合LPS、PGN、β-glucan、polyI:C以及人热聚集的IgG分子，并且与IgG的结合能力可以被LPS所阻断。此外，rCfC1qDC-1还能显着增强血细胞对E.coli的吞噬作用。高级结构分析表明CfC1qDC-1gC1q结构域表面带正电荷氨基酸残基的分布模式与人补体C1q ghB相似。利用RACE技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfC1qDC-2基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含叁个典型的gC1q结构域，能够形成与人补体C1q相似的钟型叁聚体高级结构。RT-PCR检测显示，CfC1qDC-2的mRNA在肝胰腺中表达量最高，在扇贝早期胚胎发育到D型幼虫时表达量开始显着上升，在眼点幼虫期达到最高表达水平；当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子mRNA的表达水平显着上升。重组的CfC1qDC-2具有广谱的配体结合谱，可结合6种不同类型PAMPs、8种微生物、扇贝凋亡细胞以及人热聚集IgG和IgM分子，并能抑制兔血清C1q依赖的溶血活性。利用RACE技术从海湾扇贝中克隆获得了AiCTL-9基因的cDNA序列全长，该分子所编码的氨基酸序列包含四个CTLD结构域，具有C型凝集素家族典型的结构和特征基序。RT-PCR检测显示，AiCTL-9的mRNA在肝胰腺和性腺中表达量较高，并且当扇贝受到不同微生物刺激后，血细胞中的表达量均显着上升。重组的AiCTL-9可结合LPS、β-glucan、MAN等多种PAMPs，凝集E. coli、V.angulillarum、B. subtili和Micrococcus buteus等微生物，还能显着增强血细胞的包囊化作用。利用同源克隆技术从栉孔扇贝中克隆获得了CfFREP基因的cDNA序列全长，该分子的氨基酸序列包含一个FBG结构域，具有FREP家族典型的结构和特征序列。RT-PCR检测结果显示，当扇贝受到LPS或PGN刺激后，血细胞中CfFREPmRNA的表达量均显着上升。免疫荧光显示CfFREP蛋白主要存在于扇贝的肝胰腺，鳃，肾以及血细胞周围。重组的CfFREP可结合LPS、PGN、β-glucan和polyI:C，但无凝菌活性。利用RT-PCR技术对栉孔扇贝CfTEP mRNA的检测结果显示，当扇贝受到LPS、PGN或β-glucan刺激后，血细胞中该分子的表达量均显着上升；在扇贝早期胚胎发育过程中，该分子的表达量从D型幼虫期开始显着上升，在眼点幼虫期达到最高。免疫荧光表明CfTEP蛋白主要分布于扇贝肝胰腺、鳃、肾、性腺和外套膜中，并且在D型幼虫、面盘幼虫和眼点幼虫外围也均有分布。Westernblotting显示CfTEP蛋白在扇贝血清中以断裂的片段形式存在，并且当注射甲胺使体内TEP失活后，扇贝在V. angulillarum侵染后的存活率明显下降。对以上六个扇贝补体相关分子的研究表明，它们与高等动物补体分子C1q、C3、ficolin或MBL在结构上存在相似，并具有高等动物补体分子类似的功能，可作为模式识别受体参与免疫识别，抑或作为效应分子参与病原清除，同时，具有结合高等动物免疫球蛋白和扇贝凋亡细胞的能力。该研究结果表明补体相关分子可能作为原始补体系统的组分参与扇贝的固有免疫防御，为阐明补体相关分子的进化脉络以及丰富和发展海洋无脊椎动物免疫学内容提供了分子生物学证据。
李洪波[5]2008年在《昆虫神经毒素的表达、抗体制备、活性分析及应用研究》文中进行了进一步梳理昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值,但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难。目前,已开发多种外源基因表达系统,如大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统,为大量获取这类神经毒素提供了有效的表达系统。大肠杆菌表达系统是使用最为广泛的一种原核表达系统,毕赤酵母表达系统是一种高效的真核表达系统,许多基因实现了在大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中的高效表达。在不改变3种蝎神经毒素AaIT、BjαIT、LqhIT2和1种蜘蛛神经毒素TX(46-1)的蛋白质一级结构的基础上,按照毕赤酵母的密码子偏好性,设计合成了上述四种昆虫神经毒素,并分别克隆至大肠杆菌融合表达载体pET30a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。通过转化大肠杆菌,筛选到了四种昆虫神经毒素的大肠杆菌转化子;其中,叁种蝎神经毒素实现了在大肠杆菌中的融合表达,表达产物经镍亲和层析柱纯化,并得到了高纯度融合蛋白;纯化蛋白经免疫注射BALB/c小鼠,制备了叁种蝎昆虫神毒素的较高效价的抗血清;其中,AaIT的抗血清最高效价达1:128,000,BjαIT的抗血清最高效价达到1:512,000,LqhI2的抗血清最高效价超过1:128,000,所制备的抗血清均具有较高的特异性。通过提取免疫BjαIT融合蛋白小鼠的脾细胞总RNA,经RT-PCR,在连接肽的连接下,构建了包含抗昆虫神经毒素BjαIT的scFv全长DNA片段库。利用电转化法,四种毒素基因分别成功转化毕赤酵母KM71菌株。利用制备的抗血清,采用斑点杂交的方法,筛选到了较高水平表达的叁种蝎昆虫神经毒素的酵母转化子。在甲醇诱导下,实现了AaIT、BjαIT和LqhIT2的分泌表达。表达产物经脱盐、浓缩,以东亚飞蝗和德国小蠊为供试昆虫,对表达产物的生物活性进行了测定。结果表明:叁种重组蝎昆虫神经毒素具有体内注射活性。通过引入信号肽,成功将BjαIT基因、BjαIT自身信号肽基因及绿僵菌表达载体连接,构建了超表达载体。超表达载体经基因枪转化绿僵菌分生孢子,筛选到能在除草剂平板上生长的转化子。通过提取转化子基因组DNA,经PCR验证,BjαIT基因成功转化绿僵菌。
余慧峰[6]2002年在《ALR在毕赤酵母中表达及生物活性研究》文中研究指明目的：构建人肝再生增强因子（hALR）毕赤酵母（pichia pastoris）重组表达质粒，并在酵母菌GS115中表达它。表达的hALR纯化后用于体外活性鉴定和免疫新西兰白兔以制备抗人ALR多克隆抗体，为进一步研究hALR的生物学功能奠定基础。 方法：用PCR方法和基因重组技术，从重组质粒pcDNA3(1-hALR中扩增出hALR 的基因片段，将其克隆入质粒pPIC9中，构建重组质粒pPIC9-hALR，再将pPIC9-hALR中含hALR的cDNA片段亚克隆入pPIC9K中构建重组质粒pPIC9K-hALR。经PCR和双酶切鉴定的重组质粒pPIC9-hALR和pPIC9K-hALR酶切线性化后转入宿主菌GS115中,在甲醇诱导下进行表达。表达产物 hALR经超滤方法纯化，纯化产物经12% SDS-PAGE鉴定。运用3H-TdR掺入法，观察hALR在体外对人肝癌细胞株HepG2和QGY的促增殖作用。用纯化的人ALR对新西兰白兔作初次免疫,四周后加强免疫一次，一周后取血进行ELISA检测。 结果：成功构建了hALR的酵母表达重组质粒pPIC9-hALR和pPIC9K-hALR；目的蛋白以外分泌方式在宿主菌中获得高效表达，其分<WP=7>子量约为15KD，与预计理论值相符合，超滤纯化得到的目的蛋白经SDS-PAGE鉴定为单一条带；在体外人ALR确能刺激QGY 和 HepG2 增殖，而且这种刺激作用存在着量效关系；我们获得的免疫血清经ELISA证实除能与人ALR反应外还能与大鼠ALR反应，提示人和大鼠的ALR在免疫原性上存在着交叉，抗人ALR多克隆抗体可用于大鼠ALR检测。结论：hALR在毕赤酵母菌中被高效表达和成功纯化；在体外hALR确能以剂量依赖关系刺激人肝癌细胞株QGY 和 HepG2 增殖，但两株肝癌细胞对hALR的反应性存在差异；抗hALR多克隆抗体被成功制备，它可用于人和大鼠ALR的检测
孔蕴[7]2010年在《人N-乙酰半乳糖胺转移酶Ⅲ（huGALNT3）的异源表达及抗体制备》文中进行了进一步梳理糖链及其缀合物具有重要的生理作用和病理意义。肿瘤细胞中的糖链与正常细胞相比有明显变化。糖链的合成没有模板,而是通过一系列定位有序的糖基转移酶完成的,糖基转移酶表达差异将直接导致糖链结构的变化。因此,从糖基转移酶入手可以从本质上阐明糖链在肿瘤发生和发展过程中的变化规律及调控作用。N-乙酰半乳糖胺转移酶3(UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3, ppGalNAc-T3, GALNT3)是GalNAc转移酶家族成员之一。该家族催化O-糖链形成过程中的第一步反应,即将GalNAc转移到多肽链的Ser/Thr残基上。家族成员之间在活性高低和底物选择性上有所不同。其中,GALNT3的活性与富含O-糖链的粘蛋白的形成关系密切,后者的异常是发生于多种上皮来源肿瘤的普遍现象。本论文首先从人胃癌细胞MKN45扩增出GALNT3的cDNA,构建了大肠杆菌表达载体,并进行了表达。在大肠杆菌中使用可溶性和包涵体两种形式,成功实现了GALNT3可溶性区域(GALNT3-sol)的高效表达,并进行了纯化。经过活性测定发现,两种形式表达得到的GALNT3均无活性,原因可能是大肠杆菌缺少真核生物的蛋白合成后的修饰机制,而GALNT3是来源于人的一个复杂糖蛋白,异源表达产物未能形成有活性的天然构象。另外,本实验还使用大肠杆菌表达的GALNT3-sol作为免疫原制备了抗GALNT3的抗体。将包涵体变性复性并纯化后SDS-PAGE分离,切胶免疫BALB/C小鼠,分别取第二次和第四次免疫后的血清,采用酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测抗体效价,二免的抗血清终点滴度为1：3200,而四免的抗血清终点滴度为1：25600。然后使用Western Blot方法鉴定所获抗体,阳性抗血清能够结合GALNT3-sol,使其显色,而阴性对照不能结合显色。以上结果显示,本实验所做的抗GALNT3-sol抗体具有较高的效价并能用于Western Blot检测,为进一步开发抗GALNT3的单克隆抗体,并进行临床材料的研究奠定了基础。为了获得有活性的GALNT3蛋白,本论文又尝试了在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达GALNT3。将GALNT3可溶性蛋白部分的基因(GALNT3-sol)克隆到pPIC9k质粒上,电转化进入Pichia pastoris GS115菌株。经过缺陷培养基,酵母菌体PCR和梯度抗生素(G418)等方法筛选获得高拷贝重组菌株。经过甲醇诱导GALNT3的表达,Western Blot结果证明GALNT3在毕赤酵母中成功表达,最佳表达条件为20℃,诱导72小时。对获得的GALNT3-sol进行活性检测,断定毕赤酵母表达的GALNT3-sol具有转糖基活性,这为进一步研究GALNT3对糖核苷酸或受体多肽的选择性奠定了基础。总之,本论文在两种微生物体系中成功地表达了huGALNT3-sol,并首次使用大肠杆菌表达的GALNT3-sol制备了高效的抗体,同时首次在微生物中表达出了有活性的GALNT3,为在酵母真核表达体系中生产人类其他N-乙酰半乳糖胺转移酶,甚至其他类型糖基转移酶提出了可能。GALNTs活性蛋白的表达将为体外起始O-糖基化提供新的手段,为在药物蛋白上添加具有特殊生物学功能或活性的化合物提供框架。
时纪元[8]2007年在《人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达及其多克隆抗体制备》文中进行了进一步梳理目的:人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达,制备多克隆抗体。方法:构建人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达载体,获得酵母表达株,甲醇诱导表达目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,免疫印迹鉴定。结果:构建人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达载体,获得该基因酵母表达株,甲醇诱导表达目的蛋白,免疫动物制备出高效价的SHH多克隆抗体。结论:获得SHH-N重组蛋白和SHH-N多克隆抗体制备的基因工程方法。为进一步研究Hedgehog信号通路在胰腺癌中的发病机制提供了有效工具。
周康平[9]2017年在《纤溶酶QK在毕赤酵母内的表达和发酵研究以及针对重组QK夹心酶联免疫吸附法的研发与运用》文中研究指明在生活水平日益提高的现在,血栓类疾病已经成为对人类生命健康威胁最严重的疾病之一。血栓类疾病具有极高的致死致残率,且发生形式多样,对血栓类疾病的预防和治疗越来越引起人们的关注。目前针对血栓类疾病的治疗主要主要有手术和药物治疗两种。本文主要研究一种具有良好应用前景的高纤溶活性的溶栓酶。纤溶酶QK是一种来从天然菌株Bacillus subtilis QK02发酵产物中分离得到的丝氨酸蛋白酶。其与纳豆激酶高度同源,在体内和体外都具有高纤溶活性,并且能抵抗胰蛋白酶分解,可以通过口服发挥抗血栓作用,同时其副作用小,安全性高,使其具有良好的潜力应用于血栓类疾病的预防和治疗。本文通过毕赤酵母表达系统成功表达重组QK,并对其大规模发酵、纯化和冻干体系进行了研究,研发了针对重组QK的双抗夹心ELISA检测方法并对其药代动力学进行了初步研究,研究结果分为以下叁个部分:1、针对毕赤酵母偏爱密码子对QK基因序列进行了优化,并将优化后的基因序列连接到穿梭质粒pPPICZαA上,转化入GS115中,成功获得了重组表达菌株GS115/pPPICZαA-QK。构建的菌株能高效分泌表达具有良好纤溶活性的重组QK蛋白。2、在摇瓶发酵的基础上确立了 GS115/pPPICZαA-QK重组菌株大规模发酵条件。甘油诱导菌体扩张和甘油补料阶段,控制温度在28℃,控制pH在5.0左右,溶氧不低于20%。在甘油补料阶段,控制甘油补料时间,使细胞湿重达到190-200g/L。甲醇诱导表达阶段开始后,发酵温度下降到26℃,继续控制pH在5.0左右,整个诱导过程控制发酵中溶氧不低于20%。在甲醇诱导发酵92h后,重组QK酶活最高可达到112,000IU/mL,发酵液中总蛋白浓度可达7.63 g/L。发酵液经过疏水层析(HIC)和凝胶过滤层析(GFC),后,91.73%的酶活性得到回收,同时重组QK蛋白纯度达到95%以上。此外对多种冻干保护剂在重组QK冻干过程中的保护效果进行了研究,5%的海藻糖和1%的脱脂奶粉的保护效果最好,可保持重组QK经过冻干后依然有94.2%和96.2%的活性,而在保存过程中海藻糖可以使重组QK冻干粉末在室温下一周活性基本无变化。3、通过对兔和小鼠使用纯化的重组QK蛋白进行免疫,获取了特异性针对重组QK蛋白的多克隆抗体和4株单克隆抗体,并在此基础上对抗体配对筛选,构建了以单抗为包被抗体,多抗为检测抗体的双抗夹心ELISA检测方法。通过对ELISA方法进行优化,成功建立了具有较高的灵敏度,高度的准确度、精密度,良好的重复性的针对重组QK蛋白的双抗夹心ELISA方法,检测灵敏度可达1.207ng/mL,组间和组内变异系数小于5%,回收率在95%-105%之间。成功运用ELISA方法初步分析了重组QK在大鼠中静脉注射药代动力学,确定其为二室房室模型,并获得了其主要动力学参数,T为后续更进一步的研究打下了基础。本论文中利用毕赤酵母表达系统表达分泌表达了具有纤溶活性的重组QK,并为其工业化大规模生产提供了参考方法。同时其检测方法和药代动力学的研究,也为溶栓酶QK的进一步推广和应用,以及其代谢机理的阐明打下乐基础。
刘聪辉[10]2016年在《长牡蛎免疫球蛋白超家族（IgSF）成员结构与功能的研究》文中研究说明免疫球蛋白超家族(IgSF)是所有含有免球蛋白样叁维拓扑结构的蛋白分子的群体集合。脊椎动物中含有基于免疫球蛋白的适应性免疫,无脊椎动物虽然缺乏高度可变的免疫球蛋白,但已有研究表明无脊椎动物中具有类似适应性免疫的“选择适应性免疫”(alternative adaptive immunity),无脊椎动物中的免疫球蛋白超家族(IgSF)成员分子可能在无脊椎动物的“选择适应性免疫”应答中发挥重要作用。目前对于软体动物IgSF成员结构和免疫功能的了解非常有限。本文采用生物信息学、分子生物学、免疫学等手段,鉴定并分析了长牡蛎Ig SF分子的结构和进化特征,探讨了IgSF分子在长牡蛎个体发育和免疫微生物(河口弧菌、溶藻弧菌、塔氏弧菌、灿烂弧菌和鳗弧菌)和PAMPs(LPS、PGN、GLU和poly(I:C))刺激的表达模式,查明了几种IgSF成员分子(CgJAM-A-L、CgSiglec-1和CgNCAM)的结构与免疫学功能。通过结构域分析,从长牡蛎中共鉴定得到了268个IgSF成员分子,分别含有1-36个Ig结构域,其中162个基因由Ig结构域串联重复而成,而其余106个基因(39.6%)则由Ig结构域与其它结构域重组而成。注释分析提示长牡蛎IgSF主要具有识别和粘附的功能,其中共有217个IgSF成员分子被预测具有识别和结合的功能。HMM-3D功能聚类的分子结果对GO注释的结果做了进一步的补充,将部分在Blast2GO软件中未能成功注释基因与其他明确注释基因聚类到了一起。根据已报道海洋动物基因组中IgSF的进化分析发现,IgSF家族体现出以海绵动物、棘皮动物和半索动物为节点的阶段性扩张趋势。转录组分析发现PAMPs和弧菌刺激后表达量显着升高的IgSF分子数量分别达到116和166个,提示长牡蛎IgSF可能在免疫应答反应中发挥重要功能。发现大量的IgSF在免疫响应中具有高度的特异性,且含较少Ig结构域的IgSF分子功能多样性更为丰富,表明长牡蛎IgSF在进化扩张过程中存在结构和功能的分化。在灿烂弧菌刺激的转录组分析中筛选获得大量的IgSF单碱基突变和可变剪接,并且有大量突变位点具备对灿烂弧菌二次刺激的特异性,暗示长牡蛎IgSF可能通过点突变和可变剪接产生多样性,且点突变形成的新个体变异型可能参与“选择适应性免疫”应答。另外通过分析长牡蛎不同时期的转录组数据发现,部分长牡蛎igsf能够在特定发育时期上调表达,可能参与母源免疫和卵裂期、胚胎期、幼虫期和稚贝型的发育调控。非跨膜型的cgjam-a-l是在长牡蛎中发现的一个jam家族分子同源基因,含有叁个串联的i-set型ig结构域。它能够识别并结合多种pamps(lps、pgn、man、lta、poly(i:c)和glu)和微生物(灿烂弧菌、鳗弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、耶罗维亚酵母和毕赤酵母),并在长牡蛎的固有免疫应答中发挥调理作用。同时cgjam-a-l的结构进化信息表明了jam家族分子与抗体分子可能具有一个多功能的“祖先基因”,并在进化中实现了功能的特异性分化,从而分别形成jam和抗体分子。跨膜型的cgsiglec-1基因包含两个ig结构域和两个胞内的受体酪氨酸抑制基序(itim),并在长牡蛎的免疫识别和诱导下游级联反应中发挥连接作用。它在各组织中广泛分布,并且血淋巴细胞中的转录本能够在灿烂弧菌刺激后显着地上调。cgsiglec-1能够结合多种pamps(psias、lps和pgn),并且通过抑制下游信号通路,在血淋巴细胞的凋亡、吞噬和细胞因子的释放中发挥调节作用。跨膜型的cgncam包含五个ig结构域、两个fniii结构域和一个跨膜区,并可能在长牡蛎的固有免疫中发挥模式识别作用。它与一种植物的凝集素具有较高的相似性,并且在微生物刺激后,血淋巴细胞中的mrna能够显着上调。重组的rcgncam蛋白具有对多种pamps(lps、glu和man)和微生物(灿烂弧菌、鳗弧菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、耶罗维亚酵母和毕赤酵母)的广谱识别能力。同时cgncam还可能在长牡蛎extracellulartraps的形成中发挥重要的作用。叁中不同类型的igsf共同说明长牡蛎igsf的主要功能是识别和粘附,游离型的igsf可能发挥调理分子的作用,而跨膜型igsf能够作为抗原分子的表面受体并调节下游的免疫通路。综上所述,长牡蛎中的igsf数目众多,种类丰富,并能够在免疫应答中发挥重要作用。长牡蛎igsf可能通过点突变和可变剪接产生基因的多样性,且新形成的个体变异型可能参与“选择适应性免疫”应答。igsf成员分子cgjam-a-l、cgsiglec-1和cgncam能识别结合多种外源微生物,并分别发挥调理分子、免疫调节分子和表面受体的作用。该结果探索了无脊椎动物中igsf分子与高等动物的异质性,初步揭示无脊椎动物IgSF分子在“选择适应性免疫”中的作用,为进一步研究IgSF分子的进化提供了分子生物学证据,丰富和发展了海洋无脊椎动物免疫学内容。
参考文献：
[1]. h-CR1及m-CR1基因在E.coli和Pichia pastoris中的克隆表达及其抗体制备[D]. 胡洋. 沈阳药科大学. 2003
[2]. 刺参叁种免疫基因的克隆、表达及功能研究[D]. 汪婷婷. 大连理工大学. 2011
[3]. 抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及单链抗体的表达与特性研究[D]. 李铁军. 南京农业大学. 2008
[4]. 扇贝补体相关分子的结构及功能研究[D]. 王雷雷. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2013
[5]. 昆虫神经毒素的表达、抗体制备、活性分析及应用研究[D]. 李洪波. 重庆大学. 2008
[6]. ALR在毕赤酵母中表达及生物活性研究[D]. 余慧峰. 重庆医科大学. 2002
[7]. 人N-乙酰半乳糖胺转移酶Ⅲ（huGALNT3）的异源表达及抗体制备[D]. 孔蕴. 山东大学. 2010
[8]. 人工合成SHH蛋白N末端基因的Pichia酵母表达及其多克隆抗体制备[D]. 时纪元. 第二军医大学. 2007
[9]. 纤溶酶QK在毕赤酵母内的表达和发酵研究以及针对重组QK夹心酶联免疫吸附法的研发与运用[D]. 周康平. 武汉大学. 2017
[10]. 长牡蛎免疫球蛋白超家族（IgSF）成员结构与功能的研究[D]. 刘聪辉. 中国科学院研究生院(海洋研究所). 2016
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