SrtR的鉴定及其在猪链球菌中抗氧化应激及毒力的作用研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人畜共患病原,能引起人脑膜炎、中毒性休克综合征等临床症状,威胁公共卫生安全;也能引起猪脑膜炎、关节炎等疾病,对养猪业造成较大的经济损失。S.suis逃避宿主免疫防御机制是其致病的关键环节之一。为研究猪链球菌的小鼠感染模型,本实验室此前将一株9型S.suis DN13在小鼠体内连续传代,获得了对小鼠毒力极大增强的菌株。在本研究中以传代获得的强毒菌株在小鼠中研究S.suis的致病机理。从DN13传代后细菌第10代、20代和30代中各随机挑选一个单菌落（分别命名为SS9-P10、SS9-P20和SS9-P30）,并测定了对ICR小鼠中LD50数值。结果发现这3个传代菌株毒力比较接近,LD50均在104CFU数量级,而亲本株DN13 107CFU攻毒对小鼠不致死。为了阐明传代菌株毒力增强的分子机理:（1）我们对3个不同代次的传代菌株SS9-P10、SS9-P20、SS9-P30和亲本菌株DN13进行了生物学表型比较研究,结果显示3个传代菌株比亲本菌株DN13抗氧化和高温应激能力、生物被膜形成能力均显著增高（P<0.05）,但3个传代菌株间无明显差异;（2）对SS9-P10、SS9-P20和SS9-P30进行全基因组重测序发现相对于DN13的突变位点分别为150、155和153个,其中138个突变位点存在于在3个不同代次的传代菌株,表明在3个传代菌株中基因突变情况高度相似（89%,138/155）。考虑到3个传代菌株生物学表型和基因突变均高度相似,我们推测传代菌株生物学表型改变与传代菌株中共有的138个突变位点有关。进一步对138个突变位点分析显示,编码区和非编码区分别有58个和1个非沉默突变,假基因中5个突变导致阅读框功能恢复。在编码区的58个突变中,DNA连接酶编码基因中36 bp重复序列的删除,Methyl methane sulfonate敏感性试验显示突变前后DNA连接酶活性无明显差异。而非编码区中假定蛋白（A6M16＿09815）启动子-10区域的突变,CAT assay表面启动子在突变后活性增强。DN13中假基因XRE家族转录调节因子（srtR）的突变,导致阅读框延迟终止,恢复完整的阅读框。文献报道XRE家族转录调节因子可能与抗应激相关,在DN13中通过质粒互补功能型srtR后,发现重组菌株对H2O2敏感性降低,提示srtR参与抗氧化应激。为进一步研究srtR是否与抗应激有关,我们分别在DN13和SS9-P10中构建srt R基因缺失和互补菌株。与预期一致,含功能型的srtR的菌株对H2O2和高温应激（42℃）耐受性性显著高于srtR缺失菌株。在小鼠感染模型中,含功能型的SrtR的菌株致病力强于相同背景的SrtR缺失菌株。上述结果表明,SrtR参与S.suis抗氧化和高温应激,也在S.suis致病过程发挥作用。为研究SrtR感应氧化应激的机制,常见于感受氧化应激的半胱氨酸Cys（SrtR中唯一一个Cys位于功能未知的DUF3955结构域）分别突变为丙氨酸Ala（SrtRC105A）和丝氨酸Ser（SrtRC105S,即-SH变为-OH）,结果SrtRC105A抗氧化应激调节能力完全丧失而SrtRC105S抗氧化调节活性与野生型SrtR相当,表明SrtR可能不是通过Cys的巯基的氧化和还原感受氧化压力。另外,DUF3955结构域中最保守的区域位于第120-132位氨基酸处,对其中8个保守位点分别进行点突变,发现SrtRN125A和SrtRP130A无抗氧化应激调节活性,而SrtRG132A抗氧化应激调节活性增强,但这些关键氨基酸位点如何影响SrtR功能仍待进一步研究。为探究SrtR调节哪些基因参与抗氧化应激应答,我们通过qRT-PCR分析了H2O2处理后直接抗氧化应激的基因的转录水平。我们发现Fe2+结合蛋白基因编码基因dpr、超氧化物歧化酶编码基因sodA、和巯基过氧化物酶编码基因tpx,在SS9-P10背景的srt R缺失菌株中转录下调,而在互补菌株中部分或完全恢复至SS9-P10表达水平,说明它们可能受SrtR调节。转录调节因子编码基因srtR在传代过程中突变导致功能恢复,使传代菌株对H2O2和高温的耐受能力增强,进而导致传代菌株对小鼠的致病力增强。SrtR感受氧化压力不依赖于巯基,在氧化应激情况下Srt R直接或间接调控铁结合蛋白编码基因dpr、超氧化物歧化酶编码基因sodA、和巯基过氧化酶编码基因tpx以应对氧化应激。但是,SrtR感受氧化应激压力和直接调控哪些基因参与抗氧化和高温应激及对小鼠的致病,需要进一步研究。SrtR是XRE家族首个被证实与细菌抗应激应答相关的转录调节因子。SrtR同源蛋白也在其他病原菌如Enterococcus faecium和Clostridium difficile中存在,可能在这些菌中SrtR具有相似的功能。

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摘要

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第一章文献综述

1 猪链球菌概述

1.1 猪链球菌的血清型

1.2 猪链球菌的危害

1.3 猪链球菌的致病机理

2 活性氧分子的概述

2.1 活性氧分子的产生

2.2 活性氧分子的杀菌机制

3 细菌抗氧化的一般机制

3.1 改变细胞膜通透性减少活性氧分子进入细菌胞质

2-和H₂O₂转化为低毒性分子'> 3.2 酶类将活性氧分子O₂-和H₂O₂转化为低毒性分子

3.3 阻断自由基的生成

3.4 氧化损伤修复

3.4.1 DNA

3.4.2 蛋白质

3.4.3 脂质

4 细菌抗氧化调节机制

5 抗氧化与毒力共调节

6 展望及本研究的目的

第二章 9型猪链球菌DN13与传代菌株的生物学表型比较研究

1 材料与方法

1.1 实验动物、菌株、试剂和仪器

1.2 猪链球菌DN13及其传代菌株生长曲线测定

1.3 SS9-P10、SS9-20和SS9-P30 LD50 测定

1.4 DN13及其传代菌株体外应激试验

2O₂氧化应激试验'> 1.4.1 H₂O₂氧化应激试验

1.4.2 高温应激试验

1.5 小鼠全血对DN13及其传代菌株非特异性杀菌试验

1.6 DN13及其传代菌株生物被膜形成试验

1.7 DN13及其传代菌株对兽医临床常见抗生素药物敏感性试验

1.7.1 Kirby–Bauer测试猪链球菌对抗菌药物的敏感性

1.7.2 最小抑菌浓度的测定

1.8 统计分析

2 结果与分析

2.1 DN13与传代菌株生长速度无明显差异

2.2 SS9-P10、SS9-20和SS9-P30 LD50 数值仅为DN13的1/140 或以下

2.3 传代菌株抗氧化和高温能力相比DN13显著增强

2.4 传代菌株对小鼠全血的敏感性与DN13无显著差异

2.5 传代菌株形成生物被膜能力相比DN13显著增强

2.6 传代菌株对药物敏感性与DN13无显著差异

3 讨论

第三章 9型猪链球菌DN13与传代菌株比较基因组学研究

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.2 猪链球菌培养及基因组DNA提取及全基因组重测序

1.3 突变位点PCR扩增及测序验证

1.4 比较基因组分析

2 结果与分析

2.1 传代菌株全基因组重测序结果统计

2.2 三个传代菌株共有变异位点分析

3 讨论

第四章突变位点对对生物学表型影响的验证

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和试剂

1.2 DNA克隆

1.3 重组猪链球菌的构建

1.3.1 猪链球菌感受态制备及电转化

1.3.2 重组猪链球菌的鉴定

09815 启动子突变前后的活性'> 1.4 CAT assay比较假定蛋白A6M16₀9815 启动子突变前后的活性

1.5 猪链球菌对Methyl methane sulfonate敏感性试验

2O₂氧化应激试验'> 1.6 H₂O₂氧化应激试验

1.7 统计分析

2 结果与分析及讨论

09815）启动子活性在SS9-P10 中增强'> 2.1 CAT assay证实假定蛋白（A6M16₀9815）启动子活性在SS9-P10 中增强

2.2 DNA ligase活性在SS9-P10与DN13 中无明显差异

2.3 DN13 互补srt R后对H2O2耐受能力增强

第五章 SrtR调节抗氧化和对小鼠毒力的研究

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

1.2 srtR基因转录单元分析及验证

1.2.1 猪链球菌RNA提取

1.2.2 RT-PCR

1.3 Western blot分析猪链球菌中Srt R的表达

1.4 猪链球菌srtR非极化缺失及互补菌株的构建及鉴定

1.4.1 重组质粒构建

1.4.2 srtR缺失菌株筛选及鉴定

1.4.3 srtR敲除互补菌株构建及鉴定

1.5 srtR敲除、敲除互补菌株生物学表型比较研究

1.5.1 应激试验

1.5.2 生物被膜形成试验

1.5.3 攻毒试验

2 结果与分析

2.1 srtR单独转录

2.2 Western blot检测Srt R表达

2.3 srtR基因敲除菌株、互补菌株的鉴定

2.4 SrtR参与抗氧化及高温应激

2.4.1 SrtR参与抗氧化应激应答

2.4.2 SrtR参与抗高温应激应答

2.5 Srt R影响DN13 及其传代菌株SS9-P10 对小鼠的毒力

3 讨论

第六章 SrtR调节下游基因机制研究

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.2 Srt R DUF3955 结构域关键氨基酸位点的研究

1.2.1 Srt R及其同源序列比对分析DUF3955 保守氨基酸位点

1.2.2 SrtR定点突变的重组猪链球菌的构建

1.2.3 重组猪链球菌抗氧化应激试验

1.3 氧化应激下受SrtR调节的基因的鉴定

2 结果与分析

2.1 Srt R DUF3955 结构域保守氨基酸位点分析

2.2 Srt R DUF3955 结构域抗氧化调节关键氨基酸位点分析

2.3 Srt R缺失菌株在H2O2压力转录差异基因分析

3 讨论

全文总结及创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 胡玉立

导师: 余兴龙

关键词: 比较基因组,抗氧化,毒力,表型,应激

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 湖南农业大学

基金: 十三五国家重点研发计划“畜禽重要疫病病原学与流行病学研究”项目子课题“猪链球菌的鉴定和分子致病机理研究”(2017YFD0500102)

分类号: S852.61

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000457

总页数: 104

文件大小: 3073k

SrtR的鉴定及其在猪链球菌中抗氧化应激及毒力的作用研究

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