LRH-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇激素分泌的调控

论文摘要

LRH-1（肝脏受体同源物-1）又名NR5A2,是核受体家族的成员之一,作为转录激活子调控类固醇基因的表达,对类固醇激素的分泌及癌症因子的调控有重要作用。雌性哺乳动物的大多数卵泡都会发生闭锁,激素的调控也是卵泡闭锁的因素之一,而颗粒细胞的凋亡被认为是卵泡闭锁的主要机制,但LRH-1是否参与牛卵巢颗粒细胞的增殖凋亡调控仍需证实。越来越多研究表明孕酮受体PGR介导细胞的抗凋亡信号通路,孕酮（P4）对雌性动物生殖组织的作用也是由PGR介导的。孕酮受体信号途径参与了卵巢发情周期和黄体化,并调控机体的卵巢发育、妊娠等重要活动。同时也与一些疾病,包括阿尔茨海默症、帕金森等密切相关。但目前未见有关LRH-1介导牛卵巢颗粒细胞的凋亡的相关报道,其调控机制也是未知的。通过特异性的小分子激活剂（DLPC（Dilauroyl Phosphatidylcholine）和P4）激活LRH-1的表达和孕酮受体信号通路相关受体的表达,利用免疫组织化学、RT-qPCR、Western blot、ELISA、免疫荧光细胞法、Annexin V-FITC/PI及CCK-8等多种技术和方法,研究LRH-1对牛卵巢颗粒细胞类固醇激素合成途径及其对牛卵巢颗粒细胞的生理调控。试图阐明LRH-1调节卵泡发育的新机制,为后续研究卵巢功能提供科学依据,试验主要获得以下结果。1.本试验采用牛卵巢颗粒细胞体外无血清培养体系。分离培养的牛卵巢颗粒细胞纯度较高,分离率达到95.5%,免疫组织化学发现LRH-1在牛卵巢颗粒细胞中高表达。2.不同浓度的DLPC（50μM、100μM、125μM、150μM）处理牛颗粒细胞24h,ELISA检测颗粒细胞分泌孕酮、雌二醇及睾酮的含量。结果显示,不同浓度的DLPC均抑制孕酮（P4）、雌二醇（E2）的分泌,50μM和100μM DLPC抑制作用较为明显,有趣的是,150μM DLPC可以诱导睾酮（T）的分泌。这表明LRH-1激活会抑制牛卵巢颗粒细胞P4、E2激素的分泌。3.添加50μM DLPC显著促进LRH-1基因及蛋白的表达（P<0.05）;添加50μM DLPC上调AR、StAR的表达,100μM DLPC促进CYP19、HSD3β1、HSD17β1、ESR1、ESR2基因的表达,下调CYP17、CYP11的表达。这表明,LRH-1表达的上调,会调控类固醇合成途径相关基因（StAR、CYP11、CYP19、HSD3β1、HSD17β1、CYP17）及受体（AR、ESR1、ESR2）的表达。4.通过Western blot检测PPARγ蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡。试验结果揭示,不同浓度的DLPC抑制LRH-1的下游PPARγ蛋白的表达（P<0.05）。不同浓度的DLPC抑制牛卵巢颗粒细胞的增殖,50μM DLPC显著促进牛卵巢颗粒细胞的凋亡（P<0.05）。这表明LRH-1的上调,会抑制下游蛋白PPARγ的表达,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。5.LRH-1表达上调会显著抑制孕酮受体的表达（P<0.05）。免疫细胞荧光显示,50μM DLPC+10μM P4显著提高PGR基因的表达（P<0.05）,但对孕酮受体膜蛋白（PGRMC1）表达无显著作用。CCK-8显示,50μM DLPC+（5μM P4或10μM P4）会显著提高牛颗粒细胞的细胞增殖（P<0.05）。Annexin V-FITC/PI表明,50μM DLPC+（5μM P4或10μM P4）会显著抑制牛卵巢颗粒细胞的凋亡（P<0.05）。利用Western blot检测凋亡蛋白的表达,50μM DLPC+（5μM P4、10μM P4或100μM P4）显著抑制Cleaved-Capase3蛋白的表达（P<0.05）;50μM DLPC+（10μM P4或100μM P4）显著促进Bcl-2蛋白的表达（P<0.05）。试验结果表明,孕酮受体激活剂逆转了LRH-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的促进和细胞增殖的抑制作用。综上所述,LRH-1通过调节类固醇激素合成途径,抑制P4的生物合成。此外,LRH-1通过抑制P4/PGR信号,促进了卵巢颗粒细胞的凋亡,从而介导卵泡的闭锁。本试验的研究结果为后续卵泡发育机制研究提供了新的理论依据。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 哺乳动物卵泡发育机制

1.1.1 卵子的发生与卵泡发育

1.1.2 卵泡的发育调控机制

1.1.3 卵泡的闭锁研究进展

1.2 LRH-1 与类固醇激素分泌

1.2.1 LRH-1 与类固醇激素的作用及机理

1.2.2 卵泡类固醇合成机制

1.3 孕酮受体信号通路对凋亡的影响

第二章颗粒细胞培养鉴定及LRH-1 在卵巢组织中的表达定位

2.1 试验材料

2.1.1 牛卵巢的采集

2.1.2 主要试剂与仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 免疫组织化学

2.2.2 牛卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

2.3 试验结果与分析

2.3.1 LRH-1 在牛卵巢组织中的定位

2.3.2 牛卵巢颗粒细胞鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 LRH-1 的小分子激活剂DLPC对牛卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌的作用

3.1 试验材料

3.1.1 牛卵巢的采集

3.1.2 主要试剂与仪器

3.2 试验方法

3.2.1 牛卵巢的采集

3.2.2 小分子激活剂DLPC处理牛卵巢颗粒细胞

3.2.3 牛卵巢颗粒细胞总RNA提取及RT-qPCR

3.2.4 牛卵巢颗粒细胞蛋白的提取及Western-bolt检测方法

3.2.5 ELISA检测牛颗粒细胞类固醇的激素分泌

3.3 试验结果与分析

3.3.1 DLPC对牛颗粒细胞LRH-1 基因及蛋白表达的影响

3.3.2 激活剂DLPC对牛颗粒细胞类固醇激素分泌的影响

3.3.3 激活剂DLPC对牛卵巢颗粒细胞类固醇受体基因表达的影响

3.3.4 激活剂DLPC对牛卵巢颗粒细胞类固醇合成途径相关基因表达的影响

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 LRH-1 的激活剂DLPC对牛卵巢颗粒细胞增殖及凋亡的影响

4.1 试验材料与方法

4.1.1 主要仪器设备

4.1.2 主要试剂

4.1.3 牛卵巢的采集

4.1.4 小分子激活剂DLPC处理牛卵巢颗粒细胞

4.1.5 体外培养牛卵巢颗粒细胞

4.1.6 牛卵巢颗粒细胞蛋白的提取及Western-bolt检测方法

4.1.7 牛卵巢颗粒细胞增殖活力检测

4.1.8 Annexin V-FITC/PI检测牛卵巢颗粒细胞凋亡

4.1.9 统计学分析

4.2 试验结果与分析

4.2.1 LRH-1 对牛卵巢颗粒细胞PPARγ蛋白表达的影响

4.2.2 不同浓度的DLPC对牛卵巢颗粒细胞增殖的影响

4.2.3 LRH-1 对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 LRH-1 通过孕酮受体信号通路调节牛卵巢颗粒细胞凋亡

5.1 材料与方法

5.1.1 主要试剂与仪器设备

5.1.2 牛卵巢的采集与分离培养

4 处理牛卵巢颗粒细胞'> 5.1.3 DLPC和 P₄处理牛卵巢颗粒细胞

5.1.4 牛卵巢颗粒细胞增殖活力检测

5.1.5 免疫荧光检测牛卵巢颗粒细胞孕酮相关受体的表达

5.1.6 Annexin V-FITC/PI检测牛卵巢颗粒细胞凋亡

5.1.7 牛卵巢颗粒细胞总蛋白的提取与Western blot

5.1.8 统计学分析

5.2 试验结果与分析

5.2.1 LRH-1 对牛卵巢颗粒细胞PGR基因表达的影响

5.2.2 LRH-1 对牛卵巢颗粒细胞孕酮受体信号途径相关蛋白的影响

4对牛卵巢颗粒细胞增殖的作用'> 5.2.3 DLPC与P₄对牛卵巢颗粒细胞增殖的作用

5.2.4 LRH-1 通过孕酮受体信号途径调节牛卵巢颗粒细胞凋亡

4对牛卵巢颗粒细胞凋亡蛋白表达的作用'> 5.2.5 LRH-1与P₄对牛卵巢颗粒细胞凋亡蛋白表达的作用

5.3 讨论

5.4 小结

结论

创新点

附录

参考文献

主要符号对照表

致谢

个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蒋小涵

导师: 李青旺

关键词: 类固醇激素,颗粒细胞,凋亡

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家科技支撑计划课题(编号:2015BAD03B00)

分类号: Q492.5

总页数: 76

文件大小: 9077K

下载量: 173

LRH-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡及类固醇激素分泌的调控

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢