论文摘要
2015年以来,由Ⅰ群禽腺病毒（group Ⅰ Fowl Adenovirus,FAdV-Ⅰ）引起的家禽心包积液综合征（Hydropericardium syndrome,HPS）以及包涵体肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）给我国的养殖业造成巨大损失,其中以血清4型禽腺病毒（FAdV-4）为我国主要流行血清型。该病发病急、病程短、死亡率高,给家禽养殖带来了严重危害。Hexon和Fiber-2是血清4型禽腺病毒的两个主要结构蛋白,Hexon上分布着不同的特异性抗原表位,这其中就有病毒中和抗体的区域;Fiber-2含有与病毒毒力以及细胞表面受体相关的表位。为了能及时快速对鸡群感染状况进行监测,减少经济损失,本研究以实验室分离保存的一株Ⅰ群血清4型禽腺病毒为研究对象,建立Hexon和Fiber-2的间接ELISA检测方法,以期用于临床诊断监测及该病的预防。1、Hexon单克隆抗体抗原表位鉴定及检测方法建立基于本实验室已经制备的一株针对Hexon截短体（命名为Hexon879bp）的单抗1B4,为了确定该单抗的抗原表位,本研究将该截短体根据疏水区和亲水区分析出可能的抗原位点区域,分别设计引物,扩增每个小片段,亚克隆入原核表达载体中,诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果显示:单抗1B4针对的抗原位点在210～219aa之间（即对应在hexon基因的630bp～657bp之间）。为了建立基于Hexon为包被抗原的ELISA检测方法,本研究利用两种包被抗原进行检测方法的建立:1)合成该抗原表位多肽,利用钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联。以耦合的多肽片段作为包被抗原,建立ELISA检测方法。结果显示,当多肽包被浓度为5μg/100μL时,检测结果最佳;2)通过蛋白纯化原核表达在包涵体中的Hexon879抗原,利用矩阵法确定最佳蛋白包被浓度为0.1μg/100μL,单抗最佳稀释倍数为1:2000。结果显示,蛋白包被浓度为0.1μg/100μL时,检测免疫禽腺病毒灭活苗的鸡血清抗体,与禽腺病毒抗体检测试剂盒相比,检出阳性率为100%。该方法为血清4型禽腺病毒的实验室和临床诊断提供了重要的参考。2、血清4型禽腺病毒Fiber-2抗体检测方法建立基于FAdV-4 AQ株（登录号:KY436520）的Fiber-2基因5’端111bp的高亲水区域影响该蛋白在pET32a（+）载体中的表达效率,本实验从Fiber-2 5’端112bp处开始设计一对特异性引物,PCR扩增Fiber-2△N序列,即112-1440bp片段,与pET32a（+）载体连接,测序正确的阳性质粒命名为pET-32a-Fiber2AN,将阳性质粒转入表达菌BL21（DE3）,表达的Fiber-2△N蛋白经SDS-PAGE验证大小正确,纯化表达在包涵体中的蛋白,纯化后作为检测抗原包被,建立间接ELISA方法,并对试验条件进行优化。结果显示,Fiber-2△N蛋白最佳包被浓度为0.1μg/100μL,特异性和重复性良好。与琼扩实验相比,该方法对免疫血清4型禽腺病毒灭活苗的鸡血清抗体检测率符合率为100%。3、血清4型禽腺病毒灭活疫苗血清抗体检测方法比较将本实验室制备的FAdV-4AQ株病毒经灭活、乳化,制备获得灭活疫苗,免疫7日龄的SPF鸡,一周后颈静脉采血,连续采集八周。分别用Hexon879 ELISA检测法、多肽ELISA检测法、Fiber-2 ELISA检测法以及Ⅰ群禽腺病毒检测试剂盒检测血清中抗体水平,比较几种检测方法的检测效果。结果显示,建立的Hexon879 ELISA检测法及多肽ELISA检测法都有较好的检出率。取ELISA检测阳性的血清10份进行琼脂扩散实验。结果显示,琼脂扩散试验结果与本实验建立的Hexon879 ELISA检测法、Hexon 210-219aa多肽ELISA检测法、Fiber-2 ELISA检测法以及Ⅰ群禽腺病毒检测试剂盒检测结果完全相符。这表明这些方法对禽腺病毒的临床检测以及疫苗效价评估提供了可行方法。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 梅楠
导师: 王桂军,陈鸿军
关键词: 血清型禽腺病毒,抗原表位,多肽,灭活苗
来源: 安徽农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 安徽农业大学
分类号: S852.65
DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000263
总页数: 52
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