何勇[1]2004年在《反义PG基因植物表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化》文中提出本实验用设计好的两条75bp的长引物进行PCR反应，扩增出甜瓜PG1基因的128bp 的片段 ,将其克隆到pMD18-T载体中,筛选反向克隆, 然后将其反向构建到植物表达载体pBINYXW的CaMV35S启动子和TMV增强子“Ω”的下游，构建成反义表达载体pUC38-PG。用PCR鉴定重组子,并经序列分析证明获得含有反向插入PG基因片段的植物表达载体。通过花粉管通道法转化河套蜜瓜，共获204颗瓜，柱头涂抹、子房注射和柱头切割叁种转化方法的结实率分别为39.92%、34.48%和28.70%，其中柱头涂抹和柱头切割在α=0.05水平下有显着差异。
郝金凤[2]2010年在《无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育》文中研究表明甜瓜是世界上十大水果之一,河套蜜瓜是内蒙古西部河套地区特产的地方优良甜瓜品种,是本地区主要的经济作物之一。其果实是典型的呼吸跃变型果实,成熟后迅速软化腐烂,严重制约河套蜜瓜生产的发展。本论文以河套蜜瓜成熟果实的RNA为模板,应用RT-PCR技术分别克隆得到ACC合成酶1(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase, ACS1)、ACC氧化酶1(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO1)、乙烯受体ETR2和3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)基因的全长cDNA序列,序列分析表明,各基因cDNA长分别为：ACS1 1531bp,编码493个氨基酸；ACO1 1035bp,编码318个氨基酸；ETR2 2304bp,编码767个氨基酸；HMGR 1939bp,编码588个氨基酸。与已报道的甜瓜各基因cDNA的序列同源性很高,所编码的蛋白质序列完全一致。应用实时荧光定量RT-PCR技术对不同发育阶段的甜瓜果实中各基因的表达特性进行了分析。结果表明,ACS1和ACO1基因的表达从授粉后第30天(day after pollination, DAP)起表达量开始增加,40DAP表达量迅速跃变达到最大,之后下降,与15DAP相比,两者分别增加了60倍和30万倍的表达量。ETR2基因在15DAP至30DAP表达没有变化,35DAP表达量开始上升,上升趋势一直持续至45DAP,最高表达量为15DAP的9倍。HMGR基因的表达在25DAP有一个峰值,表达量为15DAP的3倍,之后下降,在35DAP表达量又开始回升,到40DAP达到最大值后开始下降,最高表达量为15DAP的16倍。以植物双元表达载体pPZP221(GenBank中登录号：U10491)为构建的初始载体,用限制性内切酶Pmel和Asel双酶切去除植物抗性选择标记庆大霉素乙酰转移酶基因aacC1(Gentamycin acetyltransferase gene),并在该位点重新插入CaMV35S启动子和nos终止子序列,获得载体pPZP201(35S-nos)。分别将ACS1基因cDNA编码区的588bp和ACO1基因cDNA编码区的710bp片段反向构建到pPZP201 (35S-nos)载体,命名为pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1。用限制性内切酶PsyⅠ和PaeⅠ双酶切载体pPZP201-ACS1和pPZP201-ACO1,获得无载体骨架序列无选择标记基因的长约2.3kb的RB-35S-反向目的片段-nos-LB线性表达盒。采用花粉管通道法将构建好的各基因的线性表达盒导入河套蜜瓜,获得大量转化种子。PCR检测证明外源基因已经整合到受体植物的基因组中,经表型筛选证实,已经获得了耐贮性强的T2代转反义ACS1和反义AC01基因株系。经RT-PCR检测证明反义AC01基因已经在转基因果实中表达。T2代转反义ACS1和反义AC01基因果实的乙烯含量分别为对照果实乙烯合成量的7%和5%左右,转基因果实在常温下贮藏30天时,果实硬度基本保持不变,果实不过熟、不霉变。而非转基因对照果实在12天内已经软化腐烂。对T：代转反义AC01基因甜瓜花特性的研究表明,转基因甜瓜与非转基因对照甜瓜在花粉形态、花粉萌发特性上无明显差异。转基因甜瓜两性花着生节位(第11节)高于非转基因对照甜瓜两性花着生节位(第8节)。转基因甜瓜花梗在离体条件下表现出延迟脱落的现象,与非转基因对照甜瓜相比,花梗脱落延迟约9.6小时。
李建国[3]2006年在《转ACC合成酶反义基因河套蜜瓜的遗传稳定性及生理生化特性研究》文中研究指明河套蜜瓜(Cucumis melo L．cv Hetao)是内蒙古西部河套地区特产的地方优良甜瓜品种，该甜瓜果实浓香甘甜，营养价值高，但是保鲜期短，在贮运过程中极易腐烂，造成巨大的经济损失，因此急需解决保鲜问题。本实验室通过反义RNA技术，将ACC合成酶反义基因导入到河套蜜瓜中，并已获得转ACC合成酶反义基因的耐贮藏河套蜜瓜，本文将对转基因河套蜜瓜进行遗传稳定性及生理生化特性的研究，研究结果如下： 1、通过对T_6代转基因河套蜜瓜植株进行PCR检测和表型鉴定，结果表明，ACC合成酶反义基因稳定整合在植物基因组中。 2、农艺性状的调查结果表明，L8-9和L16-9品系转基因河套蜜瓜植株与普通河套蜜瓜植株没有显着性差异。 3、在采后贮藏过程中，转基因河套蜜瓜果实失重率小，重量变化缓慢，硬度下降非常缓慢，可溶性固形物含量比普通河套蜜瓜高，贮藏二十七天时，仍维持在11％左右。在果形指数方面，转基因河套蜜瓜与普通河套蜜瓜没有显着差异，都为近圆形。 4、转基因河套蜜瓜不但贮藏期长，而且果实品质优良，采后第六天对果实品质的测定表明，转基因果实与普通河套蜜瓜品质差别不大，贮藏二十七天后，转基因果实品质仍维持较高水平。 5、通过对河套蜜瓜ACC含量和乙烯含量的测定，结果表明，转基因河套蜜瓜ACC含量比普通河套蜜瓜低，乙烯含量也大大低于普通河套蜜瓜，在第六天乙烯含量仅为对照的11％。
巴德仁贵[4]2012年在《甜瓜α-甘露糖苷酶基因cDNA片段的克隆、RNAi载体构建及转化》文中指出α-甘露糖苷酶(α-mannosidase, α-man)是植物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶,在植物果实发育成熟过程中起着重要的作用。本研究以呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜为研究对象,利用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到甜瓜α-甘露糖苷酶基因cDNA片段,并构建了RNAi表达载体pART27-α-man,通过花粉管通道法转化甜瓜,获得了大量T0转化种子。从每份T0转化种子中随机选取12粒种子,播种于育苗盘内,进行PCR检测,选取阳性率高的T0转化种子,播种于大田,经果实耐贮藏表型筛选,获得了耐贮性强的T。代转pART27-α-man果实24个,采集T1转化种子。从每个株系中随机选取12粒T1种子,播种于育苗盘,进行PCR检测,获得PCR检测阳性株系10个。选取2个株系,将T,种子种植于日光温室,获得T,果实及T2种子。结果表明转α-man RNAi载体的甜瓜果实耐贮藏性和货架期明显延长,初步表明α-man基因在甜瓜果实成熟衰老过程中发挥重要作用。
参考文献：
[1]. 反义PG基因植物表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化[D]. 何勇. 内蒙古农业大学. 2004
[2]. 无载体无选择标记转基因耐贮藏甜瓜的培育[D]. 郝金凤. 内蒙古大学. 2010
[3]. 转ACC合成酶反义基因河套蜜瓜的遗传稳定性及生理生化特性研究[D]. 李建国. 内蒙古大学. 2006
[4]. 甜瓜α-甘露糖苷酶基因cDNA片段的克隆、RNAi载体构建及转化[D]. 巴德仁贵. 内蒙古大学. 2012