宋蔚[1]2004年在《人呼吸道合胞病毒G蛋白多肽重组腺病毒的构建、表达与鉴定》文中研究表明人呼吸道合胞病毒G蛋白多肽重组腺病毒的构建、表达与鉴定 目的 人工合成的人呼吸道合胞病毒(hRSV)G蛋白多肽,含有两个二硫键和多个保护性B细胞表位,免疫动物后,能产生高水平的保护性抗体,可作为一种新型RSV疫苗抗原。本文采用非复制型脓病毒载体,利用同源重组方法,获得表达G蛋白多肽的非复制型重组腺病毒。 方法 本文根据G蛋白多肽碱基序列的需要,设计并合成了带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物,以G基因RT-PCR产物为模板,采用高保真DNA聚合酶,PCR突变扩增,得到G蛋白多肽编码序列。利用普通Taq DNA聚合酶PCR产物3′末端加“A”特性,将G蛋白多肽编码序列3′平末端加“A”,并与T载体连接。并将外源性基因亚克隆于穿梭载体pShuttle—CMV。PmeⅠ线性化重组穿梭载体,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在E.coli BJ5183细胞内同源重组得到重组腺病毒DNA质粒。以Pac Ⅰ酶切获得的重组腺病毒DNA分子,脂质体法转染293细胞,产生基因组结构均一的重组腺病毒。PCR方法检测G蛋白多肽在重组腺病毒中的稳定整合。 结果 利用带有突变核苷酸序列的寡核苷酸引物,用PCR突变法成功合成了G蛋白多肽编码序列。在E.coli BJ5183细胞内进行腺病毒骨架质粒与克隆带有外源基因的穿梭载体同源重组,获得了重组腺病毒质粒DNA分子。将获得重组腺病毒质粒DNA分子转染293细胞,可观察到293细胞出现肿胀,圆缩等典型的细胞病变(CPE)。 结论 获得的G蛋白多肽编码序列及其重组腺病毒,为研究免疫效果和研制新型呼吸道合胞病毒基因工程疫苗奠定了基础。
焦月盈[2]2017年在《人呼吸道合胞病毒样颗粒单次滴鼻途径免疫小鼠诱导的免疫保护作用研究》文中研究表明人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿、老年人和免疫力低下人群下呼吸道感染最重要的病毒病原,尚无有效的防治方法。自20世纪60年代开展福尔马林灭活病毒(Formalin-inactivated RSV,FI-RSV)疫苗研究以来,RSV疫苗一直面临或安全性不足、或免疫原性弱的巨大挑战。近年来,包括病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)疫苗、减毒活疫苗和病毒载体疫苗等在内的RSV新型疫苗研究,为成功研制RSV疫苗带来了新的希望。VLPs疫苗是利用病毒蛋白的自组装能力形成的一种具有病毒形态结构特征的颗粒状物质,不含病毒核酸,在形态结构上与病毒类似的颗粒状物质。作为一种新型疫苗,VLPs不仅有很好的安全性,而且由于VLPs保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位,能迅速、有效地诱导机体产生强大的体液和细胞免疫应答。因此,VLPs成为一种极具发展潜力的新型候选疫苗。人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)和乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)等病毒VLPs疫苗已成功用于临床。与HPV、HBV和流感病毒(influenzavirus)只需要表达一种衣壳或包膜蛋白就可形成VLPs的模式不同,RSVVLP需要基质蛋白(Matrix protein,M)和包膜融合糖蛋白(Fusion glycoprotein,F)或黏附糖蛋白(Attachment glycoprotein,G)的相互作用才能产生VLPs。目前在研的RSVVLP候选疫苗,多以其他病毒来源的M蛋白做骨架(如:新城疫病毒的M蛋白或流感病毒的M1蛋白),在昆虫细胞等非哺乳动物细胞表达系统中制备,并经肌肉注射途径免疫小鼠开展免疫保护作用的研究。处于起步阶段的RSVVLP研究,仍有许多问题有待探讨及解决,如与哺乳动物细胞相比,非哺乳动物细胞表达的蛋白常缺乏翻译后修饰或翻译后修饰不足,这些差异会影响VLPs的空间构象、颗粒大小和免疫原性,以及所诱导的免疫应答的效力,同时这些表达系统与人类的种属关系较远,因基质M蛋白穿越细胞膜、驱动F蛋白芽生VLP过程携带的异种蛋白,也存在易引起过敏反应等安全问题。因而,为提高RSV VLP疫苗的效力和安全性,进一步探讨利用哺乳动物表达系统制备RSVVLP、并评价其经黏膜途径单次免疫的黏膜免疫效果及保护作用,对深入开展RSV VLP研究具有重要意义。与此同时,非复制型第一代腺病毒载体(First generation replication deficient recombinant adenoviral vector,FGAd)具有复制滴度高、安全性好、能在哺乳动物细胞高效表达外源蛋白等特点,因此,本论文拟以FGAd和可用于人用疫苗生产的哺乳动物细胞系Vero细胞为基础,探讨以FGAd和Vero细胞为基础构建的哺乳动物表达系统制备VLP的可行性;同时,以RSVM蛋白作为核心制备RSVVLP,经滴鼻途径单次免疫小鼠,开展RSV VLP黏膜途径免疫效果及免疫保护作用的深入研究,并与经肌肉注射途径免疫的RSVVLP和自然感染的RSV等进行全面、系统的比较分析。本文的创新性成果及主要工作内容如下:1.成功制备了基于RSVM蛋白的RSVVLP。RSVM蛋白不仅是RSV包装和出芽的主要成分,而且能诱导机体产生CTLs介导的免疫应答,并参与对病毒感染细胞的清除。本研究发现,以RSVVLP免疫CB6F1小鼠,可诱导小鼠产生RSVM特异性的血清抗体,显示RSVVLP中的M蛋白具有良好的免疫原性。2.成功建立了可制备RSVVLP的、基于重组腺病毒-Vero细胞的新型哺乳细胞表达系统。FGAd在包装细胞系HEK293细胞中,可实现很高的复制滴度,在非许可的、可用于生产人用疫苗的细胞系Vero细胞,难以进行复制。因此,我们利用HEK293细胞制备高滴度的、可分别编码F蛋白和M基因的重组腺病毒FGAd-F和FGAd-M,并共感染Vero细胞,实现F和M蛋白的高效表达,以及组装和释放RSV VLP至细胞上清中。通过分子生物学和电镜分析等方法,我们发现制备的RSVVLP与RSV病毒颗粒具有类似的结构和免疫学特征。3.全面系统的比较了 RSVVLP经滴鼻和肌注两种不同的途径免疫BALB/c小鼠诱导产生的免疫效果和免疫保护作用。研究发现,RSV VLP经两种途径免疫BALB/c小鼠,均可以诱导小鼠产生相似程度和长期持续的、Th1偏向的保护性免疫应答。此外,经滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,除了诱导系统和肺脏局部的免疫应答外,还可以诱导小鼠产生RSV特异性分泌型IgA(secretary IgA,SIgA),以及肺泡灌洗液(BALF)或黏膜RSV特异性的CD8+ CTLs应答。4.全面系统的比较了 RSVVL与RSV两种不同的免疫原诱导小鼠产生的免疫效果和免疫保护作用。结果显示,RSVVLP经单次滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,能取得与RSV自然感染几乎相同的系统及黏膜免疫应答及免疫保护作用,而且还能诱导小鼠产生长达15个月的、更强的RSV特异性血清中和抗体应答,血清中和抗体滴度的差异存在统计学意义(P<0.05)。本论文的研究表明,基于FGAd-Vero细胞的哺乳动物细胞表达系统是可用于制备RSVVLP的有效平台,获得的RSV VLP经单次滴鼻途径免疫BALB/c小鼠,能产生比RSVVL经肌注途径免疫更好的黏膜免疫应答,能产生比RSV天然感染更强、更持久的血清中和抗体,该平台的建立及其制备的RSV VLP对预防RSV及其它RNA病毒感染研究具有重要价值。
参考文献：
[1]. 人呼吸道合胞病毒G蛋白多肽重组腺病毒的构建、表达与鉴定[D]. 宋蔚. 安徽医科大学. 2004
[2]. 人呼吸道合胞病毒样颗粒单次滴鼻途径免疫小鼠诱导的免疫保护作用研究[D]. 焦月盈. 北京交通大学. 2017