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红树林放线菌的分离鉴定及其rpf基因复苏活性研究

2020-12-08阅读(919)

红树林放线菌的分离鉴定及其rpf基因复苏活性研究

论文摘要

自然界中当细菌面临胁迫环境时,进入一种称为非可培养状态（VBNC:viable but non-culturable）,这种状态导致我们在实验室中分离出来的菌株只占环境的0.01%-4%。复苏促进因子（Resuscitation-promoting factor,Rpf）是一种有促进细菌复苏作用的蛋白质,在很低的浓度可以促进非可培养状态的细菌复苏,对正常生长的细菌也具有促进生长的作用。编码复苏促进因子基因的片段广泛在放线菌中存在。在红树林中,有丰富的放线菌资源,并且具有酶活性、抗肿瘤活性、抗病毒活性以及对一些病原菌和线虫有拮抗作用等多种生物活性。为了发掘红树林中更多的放线菌资源,本文对放线菌的rpf基因进行了克隆、表达、及对表达蛋白进行活性检测。从红树林来源的根际土壤样品经过排重后,分离出42株放线菌,16S rRNA基因扩增及鉴定结果表明42株放线菌分别属于放线菌纲下的5个目6个科8个属。这五个目分别是微球菌亚目（Micrococcineae）、链霉菌亚目（Streptomycetales）、小单孢菌亚目（Micromonosporineae）、棒杆菌亚目（Corynebacterineae）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）。在本次研究中其中的链霉菌为优势的放线菌种群,占所有菌株数的52.38%,包含了2个属分别为Kitasatospora 1株和Streptomyces有22株。发现放线菌纲下潜在的3株的新种菌株,分别为GXN 032、GXN 112、GXN 114,其16S rRNA基因扩增及鉴分别与Streptomyces avermitilis、Streptomyces similanensis和Nocardia speluncae相似。使用淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶作为底物进行酶活性的筛选,共筛选出16株具有酶活性,产淀粉酶的活性菌株占产酶活性菌株的50%,产酶活性的菌株50%来自于链霉菌属,31.25%来自于小单胞菌属。从放线菌中共筛选出13株具有rpf基因的菌株,其中的Rpf-E和RhRpf放线菌均只有1株;Srpf-1、Srpf-7各筛选出3株放线菌的rpf基因,Srpf-3引物扩增出13株放线菌的rpf基因,占所有菌株的30.95%,占扩增rpf基因来的菌株的100%,其中有五株菌株能扩增出两种以上的rpf基因;能扩增出放线菌rpf基因的菌株主要为链霉菌属占筛选出来菌株的76.92%。对筛选出来的基因,通过在线软件预测其蛋白的生物信息,结果表明放线菌rpf蛋白是由20种氨基酸组成的一种稳定性的亲水性的蛋白。具有信号肽的解离位点,均有一个溶菌酶样结构域的可溶性溶转糖基酶样的结构域和LysM的结构域,同源性分析表明Rpf-3-GXN002在在同源性上与结核分枝杆菌的Rpf蛋白更为接近。对扩增出来的放线菌进行了克隆载体和表达载体的构建,将表达载体转化至宿主细胞中进行表达,分离纯化出一个约32KDa的蛋白。通过流式细胞仪的检测,证明表达的蛋白具有复苏处于VBNC状态的藤黄微球菌活性。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 前言
  •   1.1 红树林放线菌多样性
  •     1.1.1 红树林的分布
  •     1.1.2 红树林根际土壤的放线菌的多样性
  •     1.1.3 红树林放线菌的新类群
  •     1.1.4 来源于红树林的放线菌的生物活性
  •     1.1.5 红树林放线菌资源的利用
  •   1.2 非可培养状态的形成和复苏
  •     1.2.1 VBNC诱导因素和形态
  •     1.2.2 VBNC状态与其他一些细胞状态的区别
  •     1.2.3 VBNC状态的复苏
  •     1.2.4 VBNC状态的检测
  •   1.3 Rpf的研究进展
  •     1.3.1 Rpf的发现
  •       1.3.1.1 分枝杆菌的复苏促进因子
  •       1.3.1.2 红平红球菌的复苏促进因子
  •       1.3.1.3 放线菌的复苏促进因子
  •     1.3.2 Rpf的生物学特征
  •     1.3.3 Rpf的作用机制
  •     1.3.4 Rpf的应用
  •   1.4 课题研究的目的及意义
  • 第二章 红树林放线菌多样性及其酶活性检测
  •   2.1 引言
  •   2.2 主要材料
  •     2.2.1 土壤样品
  •     2.2.2 培养基
  •   2.3 主要试剂和仪器
  •     2.3.1 主要试剂
  •     2.3.2 缓冲溶液
  •     2.3.3 主要仪器
  •   2.4 实验方法
  •     2.4.1 土壤样品的处理
  •     2.4.2 放线菌的分离纯化、保藏
  •     2.4.3 放线菌DNA的提取
  •       2.4.3.1 chelex法提取细菌DNA
  •       2.4.3.2 酶解法小量提取放线菌DNA
  •     2.4.4 16S rRNA基因扩增及鉴定
  •     2.4.5 序列分析及系统发育树的构建
  •     2.4.6 放线菌酶活性检测
  •   2.5 实验结果
  •     2.5.1 放线菌的多样性
  •     2.5.2 潜在新种
  •     2.5.3 放线菌的活性多样性
  •   2.6 讨论
  • 第三章 放线菌Rpf生物信息分析及其克隆表达载体的构建
  •   3.1 主要材料和仪器
  •     3.1.1 实验菌株和质粒
  •     3.1.2 培养基及其他试剂
  •       3.1.2.1 培养基
  •       3.1.2.2 主要试剂
  •       3.1.2.3 缓冲溶液
  •     3.1.3 主要仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 引物的设计与合成
  •     3.3.2 rpf基因的筛选
  •     3.3.3 生物信息学分析
  •     3.3.4 放线菌rpf-3 基因克隆载体的构建与重组质粒的转化
  • easy-T1-rpf-3克隆载体的构建'>      3.3.4.1 Peasy-T1-rpf-3克隆载体的构建
  •       3.3.4.2 感受态细胞的制备
  •       3.3.4.3 重组质粒的转化
  •     3.3.5 pET28a-rpf-3表达载体的构建
  •       3.3.5.1 质粒的提取
  •       3.3.5.2 pET28a+的双酶切
  •       3.3.5.3 pET28a-rpf-3表达载体的构建
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 基因筛选结果
  •     3.4.2 生物信息分析
  •       3.4.2.1 放线菌Rpf理化性质及疏水性分析
  •       3.4.2.2 放线菌Rpf蛋白的信号肽与磷酸位点的分析
  •       3.4.2.3 放线菌Rpf蛋白二级结构及结构域分析
  •       3.4.2.4 放线菌Rpf物种间同源性分析和蛋白系统发育树
  •       3.4.2.5 放线菌Rpf蛋白的三级结构预测
  • easy-T1-rpfs克隆载体的构建'>    3.4.3 Peasy-T1-rpfs克隆载体的构建
  •     3.4.4 pET28a-rpf-3 重组原核表达载体的鉴定
  •   3.5 讨论
  • 第四章 放线菌Rpf重组蛋白的表达与纯化及活性检测
  •   4.1 主要材料和试剂
  •     4.1.1 培养基
  •     4.1.2 主要试剂
  •     4.1.3 缓冲溶液
  •     4.1.4 主要仪器
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 重组基因在大肠杆菌中的蛋白表达与纯化
  •       4.3.1.1 重组基因在大肠杆菌中的蛋白表达
  •       4.3.1.2 SDS-PAGE的制备
  •       4.3.1.3 蛋白的SDS-PAGE检测
  •       4.3.1.4 镍柱的装填
  •       4.3.1.5 蛋白的纯化
  •     4.3.2 重组蛋白对藤黄微球菌的复苏促进作用
  •       4.3.2.1 藤黄微球菌VBNC状态诱导
  •       4.3.2.2 Rpf蛋白对VBNC状态菌体的复苏作用
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 重组蛋白的表达
  •     4.4.2 蛋白纯化结果
  •     4.4.3 重组蛋白对藤黄微球菌的复苏促进作用
  •   4.5 讨论
  • 第五章 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读学期期间发表的学术论文目录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 赵雅慧

    导师: 姜明国

    关键词: 红树林放线菌,基因克隆,蛋白表达,生物学活性

    来源: 广西民族大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 广西民族大学

    分类号: Q93

    DOI: 10.27035/d.cnki.ggxmc.2019.000321

    总页数: 73

    文件大小: 2541K

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