李丁洋[1]2016年在《缺血预处理和远端缺血期处理对肝移植缺血再灌注损伤的保护作用》文中认为第一部分小鼠原位肝移植模型的建立和评价目的:建立成熟稳定的非动脉化的小鼠原位肝移植模型,并对肝移植模型进行评价,为后续相关实验奠定基础,亦为欲建立小鼠原位肝移植模型的研究者提供经验支持和技术参考,以快速、平稳、安全地渡过学习瓶颈期。方法:单人操作,采用双袖套法和支架法行非动脉化的小鼠同种异体原位肝移植术,详细记录供受体手术时间、无肝期、肝上下腔静脉吻合时间、存活时间等指标,并探查死亡原因。手术方法定型后选用80对B6小鼠进行模型评价,前6组(每组10例)分别于术后第1天、3天、5天、7天、1个月、2个月行组织病理学检查和肝功检测,第7组(共20例)进行远期存活率监测。结果:建立模型过程中共行小鼠原位肝移植手术1074例,其中前541例主要用于锻炼操作技能和积累围手术期管理经验,之后453例主要为熟练定型阶段。学习曲线表现为随着练习次数的增加,供受体手术时间、无肝期、肝上下腔静脉吻合时间均呈递减趋势,手术成功率和存活时间亦相应得到改善,但整体变化非常平缓。建模初期小鼠死亡原因多为无肝期过长、供体灌注不良、肝上下腔静脉和肝下下腔静脉吻合口出血,后期死亡原因主要为胆道并发症。模型评价阶段,无肝期为17.4±2.3min,SHVC吻合时间为11.0±1.3min,手术成功率为96.3%(77/80),术后第1天、第3天、第5天、第7天、1个月、2个月和3个月的存活率分别为95%(19/20),95%(19/20),90%(18/20),85%(17/20),75%(15/20),60%(12/20)和35%(7/20)。ALT和AST在术后第叁天达到峰值,肝脏病理学改变最为明显。结论:在大量的练习和不断的摸索、尝试后成功建立了小鼠原位肝移植模型,熟练的显微外科操作技术是首要条件,手术的难度在于操作的复杂性和手术步骤的严格时限,手术的关键在于麻醉、供肝的灌注和保存、套管技术和无肝期的精准把控。术后肝脏组织病理学和肝功变化规律为下一步研究缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠原位肝移植后缺血再灌注损伤的保护作用提供了实验依据。第二部分缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤的保护作用及其机制目的:观察远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤是否具有保护作用,比较缺血预处理和远端缺血期处理对小鼠肝移植缺血再灌注损伤保护作用的强度,并探究二者联合应用是否能产生迭加的保护作用及可能存在的作用机制。方法:160只健康成年雄性B6小鼠随机分成4组:假处理组(sham组,n=40):仅行小鼠原位肝移植术,无任何特殊处理;2缺血预处理组(IPC组,n=40):供体开腹后游离肝脏,用显微血管夹夹闭小鼠肝动脉和门静脉10分钟,开放15分钟后,进行供肝的获取;3远端缺血期处理组(RIPer组,n=40):受体麻醉后,在肝脏再灌注前用显微血管夹对小鼠两侧股血管束反复进行5分钟夹闭、5分钟开放,共3个循环;4联合应用缺血预处理和远端缺血期处理组(IPC+RIPer组,n=40):供体行缺血预处理,受体行远端缺血期处理。各组小鼠分别于再灌注后2小时、24小时和72小时切取肝脏行组织病理学检查、TUNEL染色、F4/80免疫组化染色、MDA水平检测、GSH-Px水平检测、ICAM-1 m RNA、Bcl-2 m RNA及Bax m RNA水平检测、NF-κB p65蛋白表达水平检测,并从下腔静脉取血检测血清ALT、AST、TNF-α、NOx水平,流式分析外周血白细胞表面抗原CD11b、CD16/32和F4/80的表达情况。结果:虽然各组间小鼠术后存活率无统计学差异,但是与sham组相比,叁个处理组小鼠术后的ALT、AST、MDA、TNF-α、ICAM-1 m RNA、NF-κB p65蛋白水平、Suzuki评分、凋亡指数、肝脏组织中F4/80阳性细胞比例、CD11b+和F4/80+细胞在白细胞中的比例、CD11b+CD16/32+细胞和CD11b+CD16/32high细胞在CD11b+细胞中的比例上升幅度均较小,而GSH-Px、NOx以及Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值则有所提升(P<0.05)。在移植术后早期(2h),IPC组和RIPer组在ALT、TNF-α、GSH-Px、NOx和肝脏组织F4/80阳性细胞比例等方面有统计学差异。除Suzuki评分、Bcl-2 m RNA/Bax m RNA比值、F4/80+细胞在白细胞中的比例外,其他指标均在不同的时间点显示IPC组和RIPer组均与IPC+RIPer组有显着性差异(P<0.05)。结论:本实验采用的远端缺血期处理策略可以对小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤发挥有效的保护作用。在移植术后早期(2h),远端缺血期处理对小鼠原位肝移植IRI的保护作用弱于IPC,然而后期两者的保护效力无明显区别。提示远端缺血期处理同缺血预处理一样,亦有两个保护时间窗,而在第一保护时间窗内抑制库弗细胞活化、调整微循环障碍及抗氧化作用较弱导致其保护效力较弱。联合应用缺血预处理和远端缺血期处理可以在抗氧化应激、抗凋亡、调整微循环障碍、抑制固有免疫反应方面产生迭加作用,从而进一步加强对小鼠原位肝移植缺血再灌注损伤的保护作用。
陈能志[2]2003年在《缺血预处理对鼠肝缺血再灌注损伤的保护机制的研究》文中研究说明肝脏手术中，临时性肝门阻断或肝移植的供肝都不可避免地造成肝脏缺血再灌注损伤，尽管这种损伤的病理生理机制目前尚未完全阐明，但细胞凋亡作为缺血再灌注的损伤机制之一已被越来越多的研究证实。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Cysteine-dependent aspartate-specific Protease,Caspase)是一种和人类白介素1-β转换酶(Interleukin-1β Convert enzyme,ICE)及线虫细胞死亡基因CED3相似的蛋白水解酶，在细胞凋亡的信号传导中起着十分重要的作用，处于信号传导通路的中心位置。研究发现，细胞凋亡在肝脏缺血再灌注损伤中起重要作用，如何减少肝细胞凋亡，较好的保护肝功能，有重要的临床意义。Caspase-3是Caspase家族成员之一，是凋亡途径下游导致底物酶解的关键蛋白酶，Caspase-3被激活后，将会引起细胞凋亡。缺血预处理，对缺血再灌注损伤有很好的保护作用，其机制仍未完全探明，本研究设想缺血预处理抑制肝细胞凋亡可能与Caspase活性下调有关。Caspase活性的下调可以抑制细胞凋亡。Caspase抑制剂可有效的抑制Caspase活性而减少细胞凋亡，从而保护肝脏缺血再灌注损伤，这在临床工作中有一定的应用价值，其保护效果与缺血预处理的作用是否不同也是本研究的目的之一。实验共分二章： 第一章 大鼠肝缺血再灌注损伤对CaspaseS活性的 影响及缺血预处理的保护机制 目的 探讨大冬氨酸特异性半腕氨酸蛋白酶在鼠肝缺血再灌注Oschemic Reperfusion，IR）损伤中的变化以及缺血预处理口schemicPreconditioning，IP）对IR损伤保护作用的机制。方法30只大鼠随机分为 IR组、IP组及假手术组u组人检测缺血 120min再灌注 3h血清AST、Au水平，肝组织caspase－3活性，肝细胞凋亡指数（ApoptosiIndex，AnD电镜下肝细胞超微结构改变。结果 口）血清 AST、ALT改变：IP组和IR组较S组显着升高0刃刀1人 其中IR组升高最明显，与 IP组比较差异有显着性0＜0刀 1人p）肝组织 Caspase刁活性，IR组和 IP组较 S组明显升高T功．01），IR组最明显，与 IP组比较差异显着o＜0刀1人m肝细胞川：S组未见明显调亡细胞，IR组细胞凋亡明显，与m组比较川差异有显着性0＜0．of人K）电镜＊组肝细胞超微结构破坏明显，IP组相对较轻，S组基本正常。结论IR损伤可激活Caspase上活性，促进肝细胞凋亡，从而加重肝脏损害，IP可明显减轻肝脏IR损伤，可能的机制之一是下调Caspase上的活性来抑制肝细胞调亡。
刘志刚[3]2007年在《缺血预处理对大鼠合并缺血再灌注损伤时肝大部切除术后残肝再生功能的影响》文中提出目的探讨缺血再灌注损伤对残肝再生功能的影响及其作用机制;研究缺血预处理在大鼠肝大部切除术中对残肝再生功能的影响,并验证其对残肝缺血再灌注损伤是否具有保护作用。方法健康的雌性Sprague-Dawley (S-D)大鼠随机分为叁组:①肝切除组(Partial Hepatectomy, PH),即不做肝门阻断,单纯行肝大部(2/3)切除术。②缺血再灌注损伤状态下肝叶切除组(Ischemia Reperfusion, IR),即予以第一肝门阻断30min,期间行肝大部(2/3)切除术。③缺血预处理组(Ischemic Preconditioning, IP)。即在肝门阻断前先进行5min的肝脏缺血及10min的再灌注,再重复IR组操作。分别在术前( Preoperative, Preo )以及术后0.5、6、12、24、48h等时间点对各组实验大鼠进行取材和指标检测,应用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST含量,采用放免法检测血清中透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)和TNF-α/IL-6含量,检测再生肝重量(Regenerated Liver Weight, RLW),并通过免疫组化法测定残肝组织中Ki-67和Cyclin D1表达变化。结果①ALT、AST:术前各组大鼠血清AST和ALT含量无显着差别(P > 0.05)。术后叁组大鼠血清AST和ALT值均迅速升高。术后24h内各检测点,IR组大鼠的ALT和AST值明显高于PH组(P < 0.05),但明显低于IP组大鼠(P < 0.05)。②HA:术前各组大鼠血清HA含量无显着差别(P > 0.05)。术后各组大鼠HA值均逐渐升高并在术后12h时达到峰值。在术后早期(12h内)各检测点,IR组大鼠HA值均明显高于PH组(P < 0.05);但明显低于IP组大鼠术后HA的表达量(P < 0.05)。③RLW:术前各组RLW值无显着差别(P > 0.05)。术后叁组大鼠RLW值逐渐增加。在术后12h及24h检测点,IR组大鼠RLW值明显低于PH组(P < 0.05),在术后12h检测点,IP组大鼠RLW值明显低于IR组和PH组(P < 0.05)。④Cyclin D1、Ki-67:术前各组大鼠残肝组织中Cyclin D1和Ki-67表达量均较低,它们的表达量无明显差别(P > 0.05)。术后叁组大鼠残肝组织中Cyclin D1和Ki-67表达逐渐升高。在术后24 h时,PH组大鼠肝细胞Cyclin D1和Ki-67表达达到高峰(分别为5.92±0.54、6.13±1.33),其表达量明显高于IR组和IP组大鼠(P < 0.05)。IP和IR组大鼠肝细胞Cyclin D1和Ki-67表达高峰延后至术后48 h;并且在术后24h和48h时,IP组大鼠肝细胞Cyclin D1和Ki-67表达较IR组大鼠有显着地降低(P < 0.05)。⑤TNF-α:术前各组TNF-α的表达量无显著差别(P > 0.05)。术后各组大鼠TNF-α的表达量迅速升高并达到峰值。PH组大鼠TNF-α的表达量在术后12h时明显升高并达到峰值,而IP组和IR组大鼠TNF-α的表达量达到峰值时间提前至术后6 h。其中术后0.5h和6h两个时间点,IR组大鼠血清TNF-α的表达量明显高于PH组(P < 0.05),而IP组和IR组大鼠术后血清中TNF-α表达量无明显差异(P > 0.05)。⑥IL-6:术前各组IL-6的表达量无显着差别(P > 0.05)。PH组大鼠术后IL-6值迅速升高并在术后12h时达到峰值。而IP组和IR组大鼠IL-6表达在术后早期呈现异常高值表达,后逐渐降低;术后24h和48h时,PH组大鼠血清IL-6表达量则明显高于IR组(P < 0.05);而IP组大鼠血清IL-6表达量与IR组比较未见明显差异(P > 0.05)。结论①缺血再灌注损伤会损害大鼠肝大部切除术后残肝再生功能,其作用机制可能与其诱导术后早期TNF-α过量表达以及抑制IL-6表达有关。②缺血预处理(5min缺血/10min再灌注)加重了大鼠合并缺血再灌注损伤状态时大部(2/3)切除后残肝再生功能的损害,其涉及的分子生物学机制可能与TNF-α/IL-6表达无关。③在大鼠入肝血流阻断状态下肝大部切除术中,缺血预处理(5min缺血/10min再灌注)对残留肝组织的缺血再灌注损伤保护效应将消失。
佘兴国[4]2007年在《部分预植肝缺血预处理对肝再生影响的实验研究》文中研究指明第一章动物模型的建立及缺血预处理对大鼠肝大部切除后余肝缺血再灌注损伤保护作用的研究目的:建立大鼠肝大部切除(70%)模型,肝大部切除后余肝缺血再灌注及缺血预处理模型,观察缺血预处理对大鼠肝大部切除后余肝缺血再灌注损伤的影响,为以后的研究提供基础。方法:采用预先保留门静脉转流肝叶(约占全肝70%),阻断部分肝叶(约占全肝30%)血供,到预定观察终点后重新开放血供灌注缺血肝叶,同时切除门静脉转流肝叶(70%肝叶切除)模型。144只SD(Sprague Daweley)雄性大鼠随机分为单纯肝叶切除组(PH),缺血再灌注组(IR),缺血预处理组(IP),各组分别于肝叶切除后0、1、3、6、12、24、48、72h取材,应用生化分析仪检测各组血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的变化,并观察肝组织病理改变。结果:(1)在IR组与IP组,随着缺血后再灌注时间的延长,大鼠血清ALT,AST明显升高。约在24h时达最高峰,而后渐下降。(2)与单纯肝叶切除组比较,给予缺血再灌注损伤后血清ALT,AST明显升高,在1～72h组差异显着(p＜0.05)。(3)给予缺血预处理后,与缺血再灌注组比较,复灌后血清ALT,AST明显下降,在1～72h组差异显着(p＜0.05)。(4)病理检查:光镜下缺血再灌注组随着再灌注时间延长,肝细胞坏死加剧,炎症细胞浸润更明显,约在48h达高峰。与缺血再灌注组比较,缺血预处理组的肝细胞坏死范围变小,损伤减轻。而单纯肝切除组损伤更轻。结论:肝大部切除后余肝缺血再灌注对肝细胞具有损伤作用,而缺血预处理可减轻这种损伤。第二章缺血预处理对存在缺血再灌注损伤大鼠肝再生的影响目的:观察缺血再灌注和缺血预处理对大鼠肝大部切除后余肝肝再生的影响,探讨缺血预处理对存在缺血再灌注损伤肝肝再生的促进作用。方法:144只SD雄性大鼠随机分为单纯肝叶切除组(PH),缺血再灌注组(IR),缺血预处理组(IP),利用肝大部切除(70%)余肝缺血再灌注模型。各组分别于肝叶切除后0、1、3、6、12、24、48、72h取材,应用免疫组织化学的方法对肝组织PCNA进行免疫组化检测并作半定量分析,观察其在缺血再灌注损伤和缺血预处理中的变化,同时称切取肝湿重计算肝再生度并观察肝组织病理改变,计算肝细胞核分裂指数。结果:(1)PCNA在肝叶切除后余肝肝组织中的表达逐渐升高,约在24～48h时达最高峰,而后渐下降。与PH组比较,给予缺血再灌注损伤后PCNA的表达在6～72h组明显减低(p＜0.05)。与IR组相比,给予缺血预处理后PCNA的表达在6～72h组明显增高(p＜0.05)。(2)各组肝再生度在肝叶切除术后24h逐渐升高。与PH组比较,IR组在肝叶切除术后24h、48h、72h肝再生度明显降低(p＜0.05);与IR组相比,IP组在肝叶切除术后24h、48h、72h肝再生度明显升高(p＜0.05)。(3)各组肝细胞核分裂在肝叶切除术后24h开始逐渐增多,在48h达高峰,而后渐下降。与PH组比较,IR组在肝叶切除术后24h、48h、72h肝细胞核分裂指数明显降低(p＜0.05)。与IR组相比,IP组在肝叶切除术后24h、48h、72h肝细胞核分裂指数明显升高(p＜0.05)。结论:肝大部切除后余肝缺血再灌注对肝再生有明显抑制作用,而缺血预处理可减轻这种损伤,促进肝细胞再生。第叁章缺血预处理对大鼠肝再生TNF-α/IL-6/STAT3通路的影响目的:探讨大鼠肝大部切除术后余肝缺血再灌注和缺血预处理对肝细胞再生TNF-α/IL-6/STAT3通路和肝细胞周期的影响。方法:144只SD雄性大鼠随机分为单纯肝叶切除组(PH),缺血再灌注组(IR),缺血预处理组(IP),利用肝大部切除(70%)后余肝缺血再灌注和缺血预处理模型。各组分别于肝叶切除后0、1、3、6、12、24、48、72h取材,应用ELISA法检测各组肝组织中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)—α、白细胞介素—6(Interlukin-6,IL-6)水平,应用RT-PCR法检测各组NF-kB、STAT3、Cyclin D_1 mRNA的表达。结果:(1)在PH组,TNF—α水平在肝叶切除后急剧升高,1小时达高峰,而后渐下降。与PH组相比,IR组即予缺血再灌注损伤后,肝组织中TNF-a的表达水平在再灌注后1～6小时明显升高(P＜0.05),而在再灌注损伤后24～72小时其表达水平明显降低(P＜0.05)。予缺血预处理后,肝组织中TNF-a的表达水平在再灌注后1～6小时较IR组降低(P＜0.05),而在再灌注损伤后24～72小时其表达水平较IR组无明显变化。(2)在PH组,IL-6水平在肝叶切除术后持续升高,6小时达高峰,而后缓慢下降。与PH组相比,IR组即予缺血再灌注损伤后,肝组织中IL-6的表达水平明显降低(P＜0.05)。予缺血预处理后,肝组织中IL-6的表达水平较IR组明显升高(P＜0.05)。(3)在PH组,NF-KB、STAT3 mRNA表达在肝叶切除后均增高,约1～3h达高峰;Cyclin D_1mRNA表达在肝叶切除后12～72h均增高,24h达高峰。与PH组比较,给予缺血再灌注损伤后NF-kB、STAT3、Cyclin D_1 mRNA的表达在肝叶切除后明显降低(p＜0.05)。与IR组相比,给予缺血预处理后NF-kB、STAT3、Cyclin D_1mRNA的表达在肝叶切除后明显升高(p＜0.05),并促进STAT3、CyclinD_1mRNA提前表达。结论:(1)缺血预处理可降低缺血再灌注损伤后早期细胞因子TNF—α水平的过高表达,减轻缺血再灌注损伤。(2)缺血预处理促进缺血再灌注损伤后肝再生,可能与升高肝再生启动子IL-6水平有关。(3)缺血预处理可升高肝大部切除合并缺血再灌注损伤后肝组织中NF-kB、STAT3、Cyclin D_1mRNA的表达,促进缺血再灌注损伤后余肝肝再生,其机制可能与激活肝细胞再生TNF-α/IL-6/STAT3通路有关。(4)缺血预处理促进缺血再灌注损伤后肝再生的机制复杂,可能与多种信号通路有关,有待进一步研究发现。第四章缺血再灌注和缺血预处理对大鼠肝大部切除后肝细胞凋亡、增殖的影响目的:探讨缺血再灌注和缺血预处理对大鼠肝大部切除后余肝肝细胞凋亡、增殖的影响。方法:144只SD雄性大鼠随机分为单纯肝叶切除组(PH),缺血再灌注组(IR),缺血预处理组(IP),利用肝大部切除(70%)余肝缺血再灌注模型。各组分别于肝叶切除后0、1、3、6、12、24、48、72h取材,应用流式细胞仪检测肝细胞的凋亡指数,并以Ki-67抗原检测肝细胞增殖,观察其在缺血再灌注损伤和缺血预处理中的变化。结果:(1)在IR组,复灌后肝细胞凋亡指数逐渐升高,约在12h时达最高峰,而后渐下降。与IR组相比,给予缺血预处理后肝细胞凋亡指数明显降低(p＜0.05)。(2)各组Ki-67表达率在肝叶切除后均明显升高,约在24h时达最高峰,而后渐下降。与PH组比较,给予缺血再灌注损伤后Ki-67表达率明显减低(p＜0.05)。与IR组相比,给予缺血预处理后Ki-67表达率明显增高(p＜0.05)。结论:缺血预处理可减轻缺血再灌注损伤后的肝细胞凋亡,促进肝细胞增殖,可能是其促进肝再生的机制之一。
夏宗江[5]2006年在《银杏叶提取物对大鼠肝移植缺血/再灌注损伤凋亡及其调控基因的影响》文中提出第一章 大鼠原位肝移植模型(OLT)的建立 目的：探讨大鼠原位肝脏移植(Orthotopic Liver Transplantation，OLT)模型的建立方法，为临床肝脏移植的相关实验研究提供理想的动物模型。 方法：采用Kamada's二袖套法，并在此基础上加以改良，共施行了150例大鼠原位肝脏移植手术。 结果：在90例定型手术中，供肝热缺血时间0～1min，冷缺血时间90min，无肝期平均为18～22min(19.7±1.6min)。手术成功率91.1％(82／90)。 结论：该动物模型稳定可靠，可为肝脏移植的基础及临床相关研究提供较为理想的研究手段和方法。 第二章 银杏叶提取物对大鼠肝移植缺血／再灌注损伤凋亡及其调控基因的影响
王瑜[6]2002年在《PKC介导P44/42MAPKs信号转导通路在肝脏缺血预处理保护效应中作用的研究》文中研究指明研究背景： 组织、器官经受一次或数次短暂的缺血再灌注后，能够提高对随后较长时间缺血再灌注损伤耐受能力，这种现象称为缺血预处理(Ischemic preconditioning，IP)。自从1986年Murry首次提出缺血预处理的概念以来，一些研究者用不同的预处理方法在不同种属动物的不同组织、器官上进行研究，均证实存在缺血预处理细胞保护作用的普遍性。缺血预处理保护机制的资料多来自心肌的研究，普遍认为缺血预处理的保护机制是多种因素综合作用结果，其中PKC(protein kinsse C，PKC)和MAPKs(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路的激活在缺血预处理细胞保护中起到重要的作用。推测缺血预处理细胞保护作用机制是：缺血预处理引起内源性保护物质释放，作用于细胞膜上的相应受体，通过百日咳病毒敏感性G蛋白的介导而激活磷脂酶，磷脂酶水解膜磷脂，产生二酰基甘油(diacylglyccerol，DAG)，DAG和Ca2+协同作用于PKC，使其从胞浆转位到细胞膜并且被活化，PKC在膜上使底物蛋白磷酸化，引发一系列相关信号转导通路的激活，调控保护性基因的表达，从而提高细胞对缺血再灌注损伤的耐受性。PKC可能参与激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路，进而调控保护性蛋白的基因表达，产生保护效应。目前已经证实缺血预处理对肝脏细胞的保护作用，但在细胞内源性保护机制方面的研究报导较少，在体内和体外由PKC介导激活的P44/42MAPKs信号通路是否参与保护作用有待于进一步验证，PKC和P44／42MAPKs信号通路是否参与和如何参与对保护性蛋白如热休克蛋白(heat shock protein，HSP)的调控尚未见报导，其机制值得探讨。 目的：建立体外肝细胞和大鼠体内肝脏缺血预处理模型，研究PKC和P44／42 MAPKs信号通路在肝脏缺血预处理细胞保护效应中的作用。 方法：建立体外肝细胞缺氧预处理模型，应用PKC抑制剂、激动剂和丝分裂原激活的蛋白激酶激酶（mitogen－activated protein inase klnase，MEK）抑制剂，通过检测PKC和P44／42 MAPKS磷酸化水平，HSP70的表达量，细胞活力，以及电镜下观察细胞形态结构的损伤较轻。同时，建立大鼠肝脏缺血预处理模型，各工具药干预处理后，观察PKC和P44／42 MAPKS磷酸化水平，HSP70表达量，血清AST、ALT的活性变化，同时观察光镜和电镜下细胞形态学损害。对相关数据进行统计学处理。 结果：体内和体外的缺血预处理两部分实验都观察到相似的变化结果。和缺血再灌注组比较，预处理组的 PKC和 P44／42 MAPKS磷酸化水平显着增高，HSP70表达量明显增加，肝细胞结构改变较小；PKC激动剂组的P44／42 MAPKS磷酸化水平、HSP70表达量、肝细胞形态学改变有类似的变化。和缺血预处理组相比，PKC抑制剂组相应的观察指标呈相反的变化；MEK抑制剂组的P44／42 MAPKS磷酸化激活显着减少，HSP70表达量降低，肝组织细胞结构出现较明显的改变。 结论：体外和体内缺血预处理保护作用中，PKC信号通路的激活起到关键的作用，PKC激活对 P44／42 MAPKs通路激活起到至关重要的作用，PKC介导 P44／42 MAPKS信号通路参与了肝细胞保护；同时 PKC和P44叶2 MAPKS信号通路对 HSP70表达起到调控作用。
李新辉, 王淑敏[7]2012年在《缺血预处理对鼠肝细胞缺血再灌注损伤的影响》文中进行了进一步梳理目的探讨缺血预处理对肝组织的保护作用及肝组织耐受缺血的安全时限。方法将42只SD大鼠分为实验组、对照组和假手术组(SO组),实验组和对照组再依3个不同时限(40、50、60min)各分IR40、IR50、IR60及IPC+IR40、IPC+IR50、IPC+IR60亚组。检测各组大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、丙二醛、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的含量,并行肝组织光镜、电镜观察。结果对照组SOD水平低于SO组,TNF-α、ALT及MDA水平高于SO组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组ALT、MDA水平和IPC+IR60亚组TNF-α水平均高于SO组,差异均有统计学意义(P<0.05);除IPC+IR60亚组TNF-α、MDA水平与IR60亚组比较差异无统计学意义(P>0.05);IPC+IR组其余亚组SOD、TNF-α、ALT及MD水平与IR组各相应亚组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论缺血预处理可明显减轻肝组织缺血再灌注所致肝损伤;预处理后肝门阻断50min可能是SD大鼠肝组织能耐受缺血的较安全时限。
申东方[8]2014年在《脾脏缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用》文中指出背景和目的肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）：是指肝脏缺血后，在恢复其血液灌注时导致组织损伤进一步加重的现象，常见于肝移植手术后、肝脏切除术后、肝脏广泛创伤及脓毒血症晚期等；动物实验和临床研究结果表明，适当的缺血预处理可能是预防HIRI的有效保护措施；近期发现，远程缺血预处理作为一种简单的手术干预手段，在HIRI的保护中显示出良好的应用前景。但脾脏缺血预处理对HIRI的影响及其作用机制尚无文献报道，本实验拟通过将大鼠的脾脏进行缺血的预处理后研究其对HIRI的影响，并加以分析，对其作用机制进行探讨。材料和方法实验选用Sprague-Dawley大鼠，共36只，性别均为雄性，体重在225-250g，随机分3组，分别为：缺血再灌注组（I/R组）、缺血预处理组（RIPC组）和假手术组（Sham组）。Sham组：仅行开腹和肝门游离术；I/R组：采用Pringle’s方法，制作肝脏组织缺血再灌注损伤模型，首先阻断肝门供血15分钟，然后灌注2小时；RIPC组首先阻断脾动脉15分钟，然后放开15分钟，然后其它操作同I/R组。各组试验大鼠，在再灌注2小时时后，分别取门静脉血清，测定肝功能生化指标ALT和AST水平高低；与此同时，取肝组织作病理学检查，免疫组化法对肿瘤坏死因子-α和P-选择素在肝脏中的表达水平进行测定。结果1、大鼠血液肝脏功能生化水平测定结果RIPC组血清ALT水平(231.87±50.80) U/L和I/R组血清ALT水平(466.75±89.45)U/L较sham组的(54.05±16.05)U/L明显升高(P<0.05)；RIPC组血清AST水平(326.75±19.12)U/L和I/R组血清AST水平(782.25±87.71)U/L较Sham组(76.50±12.38)U/L明显升高(P<0.05)；上述测量指标RIPC组明显降低，且与I/R组相比较均其差异有统计学意义(P<0.05)。2、大鼠光镜下肝组织病理改变及损伤评分结果RIPC组肝组织病理评分(0.93±0.13)和I/R组肝组织病理评分(2.10±0.15)分别比Sham组(0.15±0.12)高(P<0.05)，而RIPC组较I/R组肝组织病理评分明显降低(P<0.05)。3、大鼠肝组织TNF-α和P-选择素表达RIPC组肝组织TNF-α表达的平均阳性灰度值(122.08±4.84)较I/R组(140.50±12.11)明显降低(P<0.05)；RIPC组肝组织P-选择素表达的平均阳性灰度值(132.14±3.60)较I/R组(141.91±2.36)明显降低(P<0.05)，上述两指标在RIPC组中表达水平较I/R组均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论脾脏缺血预处理在以大鼠为对象的实验中显示了对HIRI的远端保护作用，该保护作用也表现出一定的安全性和有效性；脾脏缺血预处理可能是通过释放一些生物性保护因子或激活相关的神经通路，引起TNF-α和P-选择素表达下降，从而减少炎性损伤而发挥作用。
向阳[9]2005年在《不同预处理对大鼠肝移植供肝保护作用的探讨》文中提出背景：缺血预处理是短期缺血应激使机体组织对随后更长时间缺血再灌注损伤产生明显保护作用的一种适应性机制，缺血预处理的保护作用具有呈初始阶段、延迟阶段双峰表现的特点。热休克预处理同样可以为组织提供保护作用，但仅具有延迟阶段的保护作用。研究预处理的机制是为了给肝移植、肝脏手术等提供更好的肝脏保护方法。目前预处理的机制尚未彻底阐明，争论较多。目的：本研究通过应用缺血、加热等多种手段对大鼠供肝进行移植术前的预处理，比较各种预处理方法对大鼠肝移植供肝缺血再灌注损伤的保护作用，并在不同预处理方法中的应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-亚硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，从而探讨预处理对肝脏的保护机制。第一部分不同干预手段对大鼠供肝缺血损伤的保护作用目的：建立多种对大鼠肝脏的预处理模型，比较各种预处理方法对大鼠肝脏的保护效果。方法：将SD大鼠48只，随机分为六组：全肝缺血预处理组、半肝缺血预处理组、肝外脏器(脾脏)缺血预处理组、热休克预处理组、热休克+半肝缺血预处理组及假手术对照组，对大鼠肝脏进行处理，肝脏离体保存，再检测离体肝脏灌洗液的ALT水平及肝脏的形态学变化。结果：半肝缺血预处理组、热休克预处理组的供肝灌洗液中的ALT水平明显低于对照组(P＜0.05)；热休克+半肝缺血预处理组供肝灌洗液中的ALT水平也低于对照组，却明显高于前面两组(P＜0.05)。全肝缺血预处理组、脾脏缺血预处理组的供肝灌洗液中的ALT水平也低于对照组(P＜0.05)。肝脏的形态学变化提示类似的结果。结论：各种预处理均起到了保护大鼠肝脏的作用；半肝缺血预处理和热休克预处理对大鼠肝脏的保护作用最明显；将肝脏缺血及热休克预处理联合处理大鼠，其保护作用明显弱于单独缺血或单独热休克的预处理第二部分大鼠模拟肝移植模型的制备及其价值的研究目的：制备大鼠原位肝移植和模拟原位肝移植的方法；对两种方法进行比较。方法：建立大鼠原位肝移植模型(改良双套管法)；建立大鼠模拟肝移植模型(钳夹法)；比较两种模型在制备、术后肝功能和存活率之间的差异。结果：改良双套管法的大鼠原位肝移植模型的建立需要大量的训练；大鼠模拟原位肝移植模型的方法比较简单；后者在操作掌握度和术后肝功能和存活率等方面优于前者。结论：大鼠模拟肝移植模型的方法操作简单，干扰因素少，可以在一些研究中替代原位肝移植模型。第叁部分不同肝脏预处理对大鼠肝移植中供肝保护作用的比较目的：通过大鼠模拟肝移植的模型，比较各种预处理对移植肝的保护作用。方法：将SD大鼠50只，随机分为五组：肝脏缺血预处理组、脾脏缺血预处理组、热休克预处理组、热休克+缺血预处理组及手术对照组，分别进行肝脏预处理后进行模拟原位肝移植术，术后检测胆汁流量，术后24小时检测血清ALT、AST、ALP和肝脏形态学变化。结果：肝脏缺血预处理组、热休克预处理组的移植后胆汁分泌量多于对照组，血清ALT、AST水平明显低于对照组(P＜0.05)；热休克+缺血预处理组的血清ALT水平低于对照组(P＜0.05)，胆汁分泌量及血清AST与对照组没有显着差异；脾脏缺血的胆汁分泌量多于对照组，血清ALT水平低于对照组(P＜0.05)。结论：肝脏缺血预处理初始阶段保护作用最明显，将缺血及热休克预处理两种方法联合处理大鼠时，其保护作用弱于单独缺血或单独热休克的预处理方法；脾脏缺血预处理也具有保护肝脏的作用。第四部分一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-亚硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)对不同预处理在大鼠肝移植供肝保护作用中的影响目的：进行各种预处理前应用一氧化氮合酶(NOS)抑制剂N-亚硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，观测其对肝移植供肝的影响。方法：将SD大鼠30只，随机分为叁组：肝脏缺血预处理组、热休克预处理组及热休克+缺血预处理组，分别在术前注射L-NAME，进行相应肝脏预处理后行模拟肝移植术，术后检测胆汁流量，术后24小时检测血清ALT、AST、ALP和肝脏形态学变化。结果：注射L-NAME后，肝脏缺血预处理组和原肝脏缺血预处理组相比，胆汁分泌量明显降低，血清ALT、AST水平明显升高(P＜0.05)，肝脏病理显示肝脏受损严重；热休克预处理组的胆汁分泌量、血清ALT、AST、ALP和肝脏形态学变化变化很小；热休克+缺血预处理组与热休克预处理组相比，术后胆汁量明显下降，血清ALT、AST水平明显升高。结论：L-NAME可以明显抑制了缺血预处理对肝脏产生的即时保护作用，而对热休克预处理的肝脏保护作用影响较小。
郝伟[10]2017年在《丙泊酚通过miR-133a-5p/MAPK6对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是肝脏手术常见的生理变化,大量研究证实,肝脏I/R损伤是肝脏手术后肝脏功能低下、肝淤血、进行性血栓形成及移植物无功能等并发症的主要原因。同时,由于缺氧/复氧过程中,细胞内活性氧的形成、淋巴细胞和中性粒细胞的活化等严重损害肝细胞,继而导致炎症的发生乃至细胞的凋亡。新近研究发现,在肝脏手术后,由肝脏I/R造成的死亡率明显上升,然而由于其复杂的生理生化过程,目前尚无统一有效的预防和治疗方法。因此,寻找合适的药物,有效控制肝脏I/R损伤是当今医学界的一大热点和难点。丙泊酚(Propofol)是一种新型快速短效的静脉麻醉药,其临床特点是起效快、持续时间短、苏醒迅速而平稳,不良反应少,现已广泛应用于临床各科手术麻醉。近年来,越来越多的研究证明丙泊酚在肝脏I/R损伤中起到保护作用,然而其具体保护机制尚未阐明。有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族,其级联反应是通过改变蛋白质的磷酸化水平将信号从细胞外转到细胞内,并向下游传递。MAPKs参与机体内氧化应激反应,其通过将受体接受的胞外信号转入细胞核,参与调控基因的表达、细胞的生长、发育、分化和凋亡等一系列生理过程。近年来,越来越多的证据表明,MAPK信号通路参与机体内一系列I/R过程,并且可能引起组织器官结构和功能的改变。有丝分裂原激活蛋白激酶 6(mitogen-activated protein kinase 6,MAPK6)是 MAPK 家族的重要成员之一,其表达上调显着增加细胞的凋亡,参与肝癌的发生和发展过程。然而,MAPK6在肝脏I/R中的作用待进一步研究。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA,长度大约为22个核苷酸。MiRNA在生物进化中比较保守,从低等生物如细菌,病毒等到动植物的基因组中均有存在。研究证实,miRNA广泛参与基因的表达调节,及细胞生长、分化、凋亡等重要的生命活动,是生物体内一种重要的调节手段。已有研究发现多种miRNA参与肝脏I/R损伤,其中miR-133a被证实是一个与I/R损伤密切相关的miRNA。MiR-133a可以通过靶向调控死亡相关蛋白激酶2(death associated protein kinase 2,DAPK2)进而抑制心肌细胞的凋亡,发挥对I/R心肌的保护作用。同时,miR-133a-5p也被证实可通过靶向调控DAPK2蛋白抑制I/R引起的心肌细胞凋亡。此外,miR-133a-5p还可通过靶向FSCN1抑制肝癌细胞增殖和迁移,增加肝癌细胞凋亡。然而,miR-133a-5p在肝脏I/R损伤中的作用尚未阐明。本文通过通过生物学软件预测发现,miR-133a-5p与MAPK6 3'UTR区存在结合位点,表明MAPK6可能是miR-133a-5p的下游调控靶分子之一。基于以上背景,本研究首先丙泊酚预处理待建模型大鼠,然后建立肝脏I/R大鼠模型,利用全自动生化分析仪检测肝脏损伤标记物水平,同时利用qRT-PCR和western blot进一步检测病大鼠肝脏组织中MAPK6和miR-133a-5P的表达;其次建立肝细胞缺氧/复氧模型,进一步探讨丙泊酚在肝脏细胞H/R损伤保护中的分子机制;最后通过大鼠肝脏I/R在体实验进一步验证丙泊酚在肝脏I/R损伤的保护作用及潜在机制。本文旨在进一步阐释丙泊酚对肝脏I/R损伤的保护作用机制,为丙泊酚的临床应用提供实验基础和理论指导。研究内容分为3部分:第一部分:丙泊酚在大鼠肝脏I/R损伤中的保护作用及其对miR-133a-5p和MAPK6表达的影响目的:观察丙泊酚对大鼠肝脏I/R损伤的保护效应及其对miR-133a-5p和MAPK6表达的调控。方法:1.丙泊酚预处理大鼠,构建大鼠肝脏I/R损伤模型,收集假手术组、I/R组和丙泊酚干预组大鼠血清,全自动生化分析仪直接检测血清中AST和ALT的水平。2.处死所有实验大鼠,取肝脏组织后,qRT-PCR检测组织中miR-133a-5p和MAPK6 mRNA的表达水平;western blot检测肝脏组织中MAPK6蛋白表达水平。3.人正常肝细胞QSG-7701培养于含有10%FBS和1%双抗的RPMI-1640培养基中,缺氧/复氧组先后给予缺氧和复氧处理。4.细胞处理完成后,qRT-PCR检测细胞中miR-133a-5p和MAPK6mRNA的表达水平;western blot检测肝细胞中MAPK6蛋白表达水平。结果:1.与假手术组大鼠相比,肝脏I/R损伤模型大鼠AST和ALT的血清水平显着升高;而丙泊酚干预组模型大鼠血清中AST和ALT的水平显着低于肝脏I/R损伤模型大鼠。2.肝脏I/R可显着抑制大鼠肝组织中miR-133a-5p表达,而丙泊酚预处理可显着上调其表达;MAPK6在I/R损伤的肝脏组织中表达显着升高,而丙泊酚预处理显着抑制MAPK6在I/R模型肝脏组织中的表达;3.缺氧/复氧处理导致肝细胞中miR-133a-5p表达显着降低,但MAPK6的mRNA和蛋白表达水平显着升高。与缺氧/复氧处理组相比,缺氧/复氧和丙泊酚预处理显着上调miR-133a-5p表达并抑制MAPK6的mRNA和蛋白表达。结论:1.丙泊酚预处理可显着降低肝脏I/R模型大鼠AST和ALT的血清水平,进而保护肝脏I/R损伤。2.肝脏I/R模型大鼠肝脏组织中miR-133a-5p表达降低而MAPK6表达显着升高;丙泊酚预处理上调了模型大鼠肝脏组织中miR-133a-5p表达同时下调了MAPK6表达。3.建立正常肝细胞QSG-7701病理模型,缺氧/复氧处理引起细胞中miR-133a-5p表达降低而MAPK6表达升高;丙泊酚预处理细胞逆转了缺氧/复氧对肝细胞的作用,同时伴随着miR-133a-5p表达升高,MAPK6表达降低。第二部分:丙泊酚在缺氧/复氧诱导肝细胞凋亡中的作用及其调控miR-133a-5p/MAPK6表达的机制研究目的:细胞水平探讨丙泊酚对肝脏I/R损伤保护作用的分子机制。方法:1.生物信息学软件分析miR-133a-5p与MAPK的序列关系;取MAPK6 3'UTR部分构建荧光载体,转入肝细胞,双荧光素酶报告基因法鉴定miR-133a-5p与MAPK的调控关系。2.分别构建miR-133a-5p过表达载体和抑制表达载体,并转染肝细胞,real-time PCR和western blot检测细胞中MAPK6 的表达。3.建立肝细胞缺氧/复氧模型,并转染miR-133a-5p过表达载体,qRT-PCR和western blot检测MAPK6 的表达。4.建立肝细胞缺氧/复氧模型,在缺氧/复氧处理前进行丙泊酚预处理,同时构建miR-133a-5p抑制表达载体并转染细胞,qRT-PCR和western blot检测MAPK6的表达。5.建立肝细胞缺氧/复氧模型,在缺氧/复氧处理前利用丙泊酚处理,同时构建MAPK过表达表达载体并转染细胞,TUNEL检测细胞凋亡水平。结果:1.MiR-133a-5p负调控MAPK6的表达,过表达miR-133a-5p显着下调MAPK6的mRNA和蛋白水平的表达,干扰miR-133a-5p显着上调MAPK6的mRNA和蛋白水平的表达。2.肝细胞缺氧/复氧处理显着上调MAPK6的表达,而过表达miR-133a-5p显着逆转了该结果。3.丙泊酚预处理显着抑制了缺氧/复氧引起的肝细胞中MAPK6表达的上调,而干扰miR-133a-5p消除了丙泊酚对MAPK6表达的影响;4.缺氧/复氧显着增加了肝细胞的凋亡,丙泊酚预处理抑制了缺氧/复氧诱发的肝细胞凋亡,而过表达MAPK6消除了丙泊酚对肝细胞的保护作用。结论:丙泊酚预处理通过上调miR-133a-5p抑制MAPK6表达进而抑制了缺氧/复氧诱发的肝细胞凋亡。第叁部分:抑制miR-133a-5p对丙泊酚缓解大鼠肝脏I/R损伤影响的观察目的:体内实验验证丙泊酚在肝脏I/R损伤中的保护作用机制。方法:1.实验分组为肝脏I/R组(HI/R)、肝脏I/R+丙泊酚组(HI/R+propofol)、肝脏 I/R+ 丙泊酚 +NC 组(HI/R+propofol+NC)、肝脏 I/R+ 丙泊酚 +miR-133a-5p inhibitor组,全自动生化分析仪直接检测不同处理组大鼠AST和ALT的血清水平;2.取上述实验中所有大鼠的肝脏组织,qRT-PCR和western blot检测肝脏组织中MAPK6 mRNA和蛋白的表达水平。结果:1.肝脏I/R大鼠血清中ALT和AST的水平显着上调,丙泊酚预处理下调了ALT和AST水平,而miR-133a-5p inhibitor取消了丙泊酚对肝脏损伤的保护作用。2.大鼠肝脏缺血再灌组大鼠MAPK6的表达水平显着上调,丙泊酚预处理下调了 MAPK6的表达水平,而miR-133a-5p inhibitor取消了丙泊酚对损伤肝组织中MAPK6表达的影响。结论:体内实验证实丙泊酚通过miR-133a-5p调节MAPK6进而在大鼠肝脏I/R损伤中发挥保护作用。综上所述,本研究深入探讨了丙泊酸在肝脏I/R损伤中的保护作用及相关分子机制,在明确肝脏I/R中miR-133a-5p表达下调,MAPK6表达上调的基础上,揭示了 miR-133a-5p与MAPK6参与丙泊酚在肝脏I/R损伤中的保护作用机制。另外本实验从体内和体外两部分实验证实了丙泊酚的保护机制,该研究为今后肝脏I/R的预防及治疗起到重要的指导作用。
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