溶藻弧菌定植因子AcfA的功能及其对SOD、Flg和Dct的调控

论文摘要

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种全球性分布的条件致病细菌,能致使鱼、虾、贝等各种海洋生物出现不同程度的发病,尤其近年来养殖水质环境频繁出现污染、水体富营养化的现象,由溶藻弧菌引起的弧菌病呈现流行范围广,暴发频繁的趋势,给水产养殖业造成巨大的损失并影响其健康发展。在宿主肠道上成功定植并进行繁殖是弧菌感染宿主和引起疾病的关键第一步。其中附属定植因子Acf A是弧菌重要毒力蛋白之一,Acf A可以使致病菌有效地与宿主黏膜粘附,而关于溶藻弧菌Acf A相关功能的研究较少。本研究以溶藻弧菌HY9901为野生株,利用同源重组技术构建溶藻弧菌acf A基因缺失株?acf A。利用16S r DNA高通量测序技术研究溶藻弧菌野生株WT和缺失株?acf A在石斑鱼肠道的定植情况。通过转录组测序研究Acf A对鞭毛组装、能量代谢等相关基因的调控。根据转录组测序和荧光定量PCR分析,敲除溶藻弧菌sod B基因,研究sod B基因的缺失是否影响溶藻弧菌的生物学特征和毒力。并利用β-半乳糖苷酶报告基因和细菌单杂交实验验证溶藻弧菌Acf A对SOD、Flg和Dct基因的调控作用。主要结果如下:1、溶藻弧菌缺失株?acf A的构建及其生物学特性研究以溶藻弧菌HY9901为野生株,利用同源重组技术构建溶藻弧菌缺失株?acf A。根据生物学特性分析,acf A基因的缺失会降低溶藻弧菌的泳动能力、粘附能力和毒力,但不影响细菌的遗传稳定性、外部形态、生长、胞外酶活力和生物膜形成能力。2、溶藻弧菌野生株WT和缺失株?acf A在石斑鱼肠道菌群分析珍珠龙胆石斑鱼肠粘膜菌群Alpha多样性指数结果表明,样本的测序深度均在0.99以上。acf A组和WT组的Chao1和ACE指数随时间的推移出现下降的趋势。并且acf A组在第1、2和3天的Chao1和ACE指数分别比WT组第1、2和3天的Chao1和ACE指数高,表明石斑鱼经野生株WT灌胃后降低了肠粘膜菌群的丰度。acf A组和WT组的Simpson和Shannon指数没有明显差异。WT组的弧菌丰度几乎维持不变,而acf A组的弧菌丰度从0.07%下降至0.01%。肠道定植实验也发现在细菌灌胃后48h,缺失株?acf A在石斑鱼肠道定植的数量仅为野生株WT在石斑鱼肠道定植的数量的8.40%。3、溶藻弧菌野生株WT与缺失株?acfA的转录组测序分析通过溶藻弧菌野生株WT与缺失株?acf A的转录组测序分析,共筛选得到329个差异表达基因,其中157个基因转录上调,172个基因转录下调。KEGG分析发现野生株WT与缺失株?acf A差异表达基因主要集中定位在双组分系统、微生物适应不同环境的代谢途径和碳代谢途径,其中鞭毛组装、能量代谢、硫胺代谢、碳水化合物与氨基酸代谢、信号转导相关20个基因显著下调,表明Acf A参与调控鞭毛组装、能量代谢等相关基因的表达。4、溶藻弧菌缺失株?sod B的构建及其生物学特性研究根据转录组测序和荧光定量PCR分析,以溶藻弧菌HY9901为野生株,利用同源重组技术构建溶藻弧菌缺失株?sod B。根据生物学特性分析,sod B基因的缺失会增强生物膜形成能力和胞外酶活力,降低溶藻弧菌的泳动能力、粘附能力、毒力、SOD酶活力和抗氧化能力,但不影响细菌的遗传稳定性、外部形态和生长。5、Acf A调控SOD、Flg和Dct基因的功能验证采用β-半乳糖苷酶报告基因和细菌单杂交实验来检测溶藻弧菌Acf A与sod B、flg F、flg G、flg I和dct Q基因启动子区的结合作用。结果发现,Acf A对sod B、flg G和dct Q具有正调控关系,对flg F和flg I具有负调控关系。Acf A可直接与flg F和flg I基因启动子区结合,但未与sod B、flg G和dct Q基因启动子区相结合,表明Acf A对其调控是间接的。

论文目录

摘要

abstract

缩略词表

1 文献综述

1.1 溶藻弧菌病研究概况

1.1.1 弧菌病

1.1.2 弧菌的致病机理及毒力因子

1.1.3 溶藻弧菌的致病性

1.1.4 溶藻弧菌的生理学特征

1.2 弧菌的粘附定植作用

1.2.1 弧菌的粘附作用

1.2.2 影响弧菌粘附的因素

1.2.3 弧菌的定植过程

1.2.4 附属定植因子AcfA

1.3 验证DNA与蛋白质之间相互作用的常用方法

1.4 研究目的及意义

2 溶藻弧菌?acfA缺失株的构建及生物学特性研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株、质粒、引物和实验用鱼

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 溶藻弧菌acfA的基因克隆

2.2.2 溶藻弧菌缺失突变株?acfA的构建

2.2.3 缺失株?acfA生物学特性的研究

2.3 结果与分析

2.3.1 acfA的基因克隆

2.3.2 缺失株?acfA的构建

2.3.3 缺失株?acfA生物学特性的研究

2.4 讨论

3 溶藻弧菌野生株WT和缺失株?acfA在石斑鱼肠道菌群分析

3.1 实验材料

3.1.1 细菌

3.1.2 实验用鱼

3.1.3 实验培养基与用具

3.2 实验方法

3.2.1石斑鱼肠道定植实验

3.2.2 石斑鱼肠道的16S rDNA高通量测序

3.3 结果与分析

3.3.1 Alpha多样性分析

3.3.2 稀释曲线与等级聚类曲线

3.3.3 基于OTU的 venn图

3.3.4 珍珠龙胆石斑鱼肠粘膜菌群多样性

3.3.5 物种丰度聚类热图

3.3.6 PCoA分析和PCA分析

3.3.7 肠道定植实验

3.4 讨论

4 溶藻弧菌野生株WT与缺失株?acfA的转录组测序分析

4.1 材料与试剂

4.1.1 菌株

4.1.2 引物

4.1.3 主要试剂

4.1.4 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 细菌的培养及采样

4.2.2 溶藻弧菌野生株HY9901的acfA基因表达

4.2.3 野生株WT与缺失株?acfA的转录组测定

4.3 结果与分析

4.3.1 采样点的确定

4.3.2 转录组数据质量评估

4.3.3 WT和acfa差异基因分析

4.3.4 WT和 acfa的 GO与 KEGG富集分析

4.3.5 RT-PCR检验转录组数据

4.4 讨论

4.4.1 溶藻弧菌acfA基因转录组分析

5 溶藻弧菌?sodB缺失株的构建及生物学特性研究

5.1 实验材料

5.1.1 菌株、质粒、引物和实验用鱼

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器

5.2 实验方法

5.2.1 溶藻弧菌野生株WT、缺失株?sodB的 sodB基因时序表达

5.2.2 溶藻弧菌sodB的基因克隆

5.2.3 溶藻弧菌缺失突变株?sodB的构建

5.2.4 缺失株?sodB生物学特性的研究

5.3 结果与分析

5.3.1 sodB基因的时序表达

5.3.2 sodB的基因克隆

5.3.3 缺失株?sodB的构建

5.3.4 缺失株?sodB生物学特性的研究

5.4 讨论

6 溶藻弧菌AcfA调控SOD、Flg和 Dct基因的功能验证

6.1 实验材料

6.1.1 菌株、质粒和引物

6.1.2 主要试剂

6.1.3 主要仪器

6.2 实验方法

6.2.1 荧光定量PCR

6.2.2 β-半乳糖苷酶报告基因实验

6.2.3 细菌单杂交

6.3 结果与分析

6.3.1 检验sodB、flgF、flgG、flgI和 dctQ基因表达水平

6.3.2 启动子的扩增

6.3.3 重组质粒pME6522-启动子的构建及转化

6.3.4 β-半乳糖苷酶报告基因验证Acf A与5 个基因启动子的互作

6.3.5 细菌单杂交诱饵载体pB1H2-AcfA构建

6.3.6 重组质粒pH3U3-启动子构建及鉴定

6.3.7 Omega-AcfA蛋白表达

6.3.8 细菌单杂交验证AcfA与5 个基因启动子的互作

6.4 讨论

7 全文总结

参考文献

附录

致谢

作者简介

导师简介

文章来源

类型: 博士论文

作者: 陈妍妍

导师: 简纪常,蔡双虎

关键词: 溶藻弧菌,定植因子,高通量测序,细菌单杂交

来源: 广东海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,水产和渔业

单位: 广东海洋大学

分类号: S941.4;Q78

DOI: 10.27788/d.cnki.ggdhy.2019.000002

总页数: 122

文件大小: 5662K

下载量: 151

溶藻弧菌定植因子AcfA的功能及其对SOD、Flg和Dct的调控

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢