大肠杆菌生产α-氨基己二酸的代谢工程研究

论文摘要

代谢工程使其有希望提高化学品,感兴趣的材料的生物基生产中的产量、得率和产率,并用于开发治疗疾病的药物的创新目标。α-氨基己二酸也称为高谷氨酸或2-氨基己二酸,是一种非天然氨基酸,是具有谷氨酸和天冬氨酸结构的六碳类似物。它是前列腺癌的有效预后因子,糖尿病的生物标志物,作为L-谷氨酸摄取的有效抑制剂的药理学工具,以及神经递质谷氨酸的再循环中的假设不稳定的步骤。它还在化妆品,医药等领域具有广泛的应用,并且在某些化学品的中间体的合成中起重要作用,例如甜味剂和螯合剂。目前,高谷氨酸可以通过化学途径合成,这些化学途径成本高,产率低,不适合工业用途,甚至是工艺中的污染问题。我们的工作实现了通过大肠杆菌平台菌株进行高谷氨酸的联合生物合成。首先,我们构建了一种大肠杆菌菌株,其含有将α-酮己二酸转化为高谷氨酸的途径。然后我们对谷氨酸脱氢酶GDH酶进行了分子对接研究,并通过对接模拟分析了它们的结合亲和力,结果表明α-酮基己二酸与GDH酶具有良好的相互作用。此外,α-酮己二酸配体显示出与底物结合口袋中的关键部分的重要相互作用。我们用101位精氨酸替换了蛋氨酸密码子用325位赖氨酸替换了 325位丙氨酸,用347位精氨酸代替了 347位天冬氨酸密码子。我们的研究表明,从周围的残基中观察到两个氢键,涉及Ser351（2.81A）和Asn326（2.44A）与α-酮己二酸。此外,已经报道了四种疏水性接触Met101,Arg324,Ala325和Asp347,其来自野生型GDH酶结合口袋,导致酶的高稳定性和增强的催化活性。与含有46.33mg/L的A235K相比,突变体M101R在2-酮己二酸转化为α-氨基己二酸的活性方面具更强的活性,为99.625mg/L.在第二个项目中,我们针对基于材料的混合物进行了抗菌分析,以开发降低对正常细胞毒性的方法,并且提高抗菌效力来解决医学治疗的难题。我们的研究小组展示了药用植物提取物还原剂平台,用于杀死氧化锌（ZnO）和氧化石墨烯（GO）纳米片上的MDR革兰氏阴性大肠杆菌。ZnO@GO介导的纳米复合材料协同增强其抗MDR革兰氏阴性细菌的效率。从TEM图像中,结果表明在GO纳米片表面成功合成了三角形小尺寸ZnO。然而,DLS和ζ电位研究表明,在水性介质中,ZnO@GO的植物提取物的平均ZnO尺寸和表面加帽电荷分别为30-40nm和+20mV。紫外-可见光和FTIR等光谱表征分析表明,在合成的ZnO@GO纳米复合材料中,ZnO成功地分散在GO纳米片表面。合成的ZnO@GO用于抗MDR革兰氏阴性发病机制（大肠杆菌）,并显示出优异的抗菌活性,并在5小时内杀死95%的有毒细菌。ZnO@GO具有非常的生物相容性并显示出显著的抗菌活性。且其高抗菌活性是由于合成的阳性ZnO@GO与大肠杆菌的细胞膜产生静电相互作用。因此,纳米复合材料随后通过破坏细菌的细胞膜进人细胞质,ROS进入细胞质导致细胞中的代谢失衡。此外,通过ζ电位和碘化丙啶（PI）研究验证了革兰氏阴性细菌的细胞膜损伤。从ζ电位测试可得,由于ZnO@GO的相互作用,细胞膜损失并干扰其负电荷。此外,PI分析还成功地显示了细菌细胞膜破坏剂。因此,深入了解所获得的结果将更利于解决和开发医学领域中现有世界挑战问题。

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Abbreviations

中文摘要

Abstract

Chapter 01

Introduction

1.1 Motivation

1.2 Objectives

1.3 Metabolic Engineering

1.4 Introduction to α-Aminoadipic acid

1.5 Glutamate dehydrogenase enzyme

Project 2:Green synthesis of metal based nanomaterials through Nanotechnology

2.1 Nanotechnology

2.2 Brief introduction to Nanoparticles

2.3 Zinc Oxide Nanoparticles

2.4 Graphene Oxide

2.5 Biological applications

Chapter 02

Materials and Methods of Metabolic Engineering of E.Coli for the production of Alpha AminoadipicAcid

2.1 Media Used

2.1.1 LB（Luria-Bertani） liquid medium

2.1.2 LB（Luria-Bertani） solid medium

2.1.3 M9 minimal medium

2.2 Bacterial strains and plasmid

2.3 Materials

2.4 Extraction of plasmids and genomes

2.4.1 Extraction of plasmid

2.4.2 Extraction of genomic DNA

2.5 PCR amplification

2.5.1 PCR System

2.5.2 Setting PCR Machine Programme

2.6 Purification and recovery of the target gene

2.7 Enzyme digestion

2.7.1 Plasmid Digestion

2.7.2 DNA Digestion

2.8 Agarose Gel electrophoresis

2.9 Ligation System

2.10 Transformation

2.11 Expression and purification of the target protein

2.11.1 Protein Extraction and Purification

2.11.2 Polyacrylamide gel electrophoresis

2.11.3 Stock Solutions

2.11.4 Separating and stacking gel making method

2.11.5 12% SDS PAGE gel

2.11.6 Staining and De staining

2.12 Methodology of Molecular docking studies

2.13 Enzyme Assay

2.14 Feeding Experiment

2.15 HPLC

Material and methods of Green synthesis of metal based nanomaterials through Nanotechnology

2.1 Preparation of aqueous plant extract and Zinc Oxide nanoparticles

2.2 Graphene Oxide loaded trigonal ZnO nanoparticles

2.3 Anti-bacterial Activity

2.4 Intracellular reactive oxygen species analysis ROS

2.5 Propidium Iodide assay

2.6 Bacterial ultra-structure

Chapter 03 Result and Discussion of Metabolic Engineering of E.Coli for the production of Alpha AminoadipicAcid

3.1 Establishment of the recombinant strains

3.1.1 Construction of pET-BS rocG and E.Coli K12 alaA recombinant strains

3.2 Digestion and verification of the BS rocG and E.Coli K12 alaA

3.3 Ligation and Transformation

3.4 Enzyme digestion verification

3.5 In-vitro determination of Glutamate dehydrogenase enzyme

3.6 Results and discussion of site directed mutagenesis

3.7 Mutagenesis and overlap extension PCR

3.7.1 Mutagenesis

3.7.2 Overlap extension PCR

3.8 Substrate specificity

3.9 Conversion of 2-ketoadipic acid to Homoglutamate

Chapter 04 Result and Discussion of Green synthesis of metal based nanomaterials through Nanotechnology

3.1 TEM,DLS and EDS analyses

3.2 UV-Visible Spectroscopy

3.3 XRD study

3.4 FTIR analysis

3.5 Antibacterial study

3.6 Propidium iodide assay

3.7 Determination of intracellular reactive oxygen species ROS

3.8 Morphological analysis of Bacteria

Chapter 05 Conclusion

References

List of Tables

Acknowledgements

Advisor's Profile

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: Muhammad Tariq

导师: 袁其朋,王佳

关键词: 代谢工程,谷氨酸脱氢酶,氨基己二酸,氧化锌,氧化石墨烯,表征,细菌疗法

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 北京化工大学

基金: International Science & Technology Cooperation Program of China (Grant No. 2013DFR90290)

分类号: Q93;O622.6

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.001370

总页数: 101

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大肠杆菌生产α-氨基己二酸的代谢工程研究

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