羊口疮病毒六安株遗传进化分析及诱导宿主天然免疫基因表达的影响

论文摘要

羊口疮是由属于痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）的羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）引起的接触性的人畜共患传染病。该病传染性强,流行迅速呈群发性。目前,该病在世界范围内的不同养殖地区均有感染的报道。但是,ORFV分子遗传进化特征信息依然较少。此外,宿主对感染ORFV后的天然免疫反应研究很大程度上仍然尚不清楚。因此,本研究为了丰富安徽地区ORFV的分子遗传特征以及感染宿主后的天然免疫反应,进行一系列研究。本研究首先利用PCR、细胞培养技术、电镜及免疫组化等技术证实了 2018年安徽省六安市某养羊场发生的一起疑似Orf感染的疫情是由ORFV引起的,对分离获得的毒株进行鉴定后命名为AH/LA/2018株。通过对B2L和F1L基因扩增及测序,构建遗传进化树并进行遗传进化分析。同时,将ORFV分离株通过TCID50测定后,进行人工感染动物试验。利用实时荧光定量PCR技术,系统分析ORFV感染山羊后外周血中单个核细胞（PBMC）在不同时间段天然免疫相关基因的表达变化情况。结果发现,ORFVAH/LA/2018的B2L基因的核苷酸（nt）和氨基酸（aa）与其他ORFV株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.1%-99.8%和96.4%-99.7%,遗传进化树显示ORFV AH/LA/18株与Nantou株亲缘性较近。F1L基因的核苷酸和氨基酸序列分析显示ORFV AH/LA/2018株与其他ORFV毒株的同源性分别为96.3%-99.6%和95.6%-100%,遗传进化树显示,与SDLC和SDTA株亲缘性最近。此外,ORFV感染宿主后能显著诱导外周血单个核细胞（PBMC）中IFN-α和IFN-β mRNA的表达以及增强炎性细胞因子的产生,包括白介素IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α。同时也可诱发JAK/STAT信号通路中关键细胞因子STAT3的激活以及一些抗病毒蛋白基因的表达增加,如IFITM 1、ISG15和ISG20。值得注意的是,ORFV感染可上调Toll样受体TLR2,TLR4,TLR8,TLR9以及STING通路中关键分子cGAS,DDX41、STING基因的表达。综上所述,本研究较为系统地对ORFV安徽六安分离株进行了遗传进化分析,研究结果将有助于更好地了解ORFV的分子遗传特性,为防控ORFV的传播丰富了实验数据。同时,本研究发现ORFV感染早期阶段可能通过依赖TLR2/4/8/9以及STING通路在宿主体内激活先天免疫应答,从而诱导多种细胞因子的产生和下游关键抗病毒蛋白的表达进行防御。研究结果为进一步ORFV与宿主间的相互作用以及致病机制提供了新的见解。

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致谢

摘要

Abstract

缩写与符号清单

文献综述

引言

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

1.1.2 载体、材料及试验动物

1.1.3 主要试剂

1.1.4 主要仪器

1.1.5 缓冲液及培养基的配置

1.2 方法

1.2.1 羊口疮病毒的分离鉴定

1.2.2 羊口疮病毒的遗传进化树构建及序列分析

1.2.3 ORFV诱导宿主天然免疫基因mRNA表达的动态变化

2 结果与分析

2.1 羊口疮病毒的分离鉴定结果

2.1.1 山羊原代胚胎鼻甲骨细胞的培养和形态学观察结果

2.1.2 山羊原代胚胎鼻甲骨细胞生长曲线的测定结果

2.1.3 细胞病变结果

2.1.4 PCR鉴定结果

2.1.5 电镜观察结果

50测定结果'> 2.1.6 TCID₅₀测定结果

2.1.7 临床症状及组织病理学观察结果

2.1.8 免疫组织化学观察结果

2.2 羊口疮病毒的遗传进化树构建及序列分析结果

2.3 ORFV诱导宿主天然免疫基因mRNA表达的动态变化结果

2.3.1 目的基因的扩增结果

2.3.2 标准重组质粒的测序结果

2.3.3 标准曲线的构建结果

2.3.4 ORFV感染诱导Ⅰ型IFN在体内表达的结果

2.3.5 ORFV感染导致STAT3的激活和抗病毒蛋白基因ISG15、ISG20和IFITM1的表达的结果

2.3.6 ORFV诱导宿主炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α）表达的结果

2.3.7 ORFV感染可促进TLRs在体内的表达结果

2.3.8 ORFV诱导STING信号通路关键分子的表达结果

3 讨论

4 结论

参考文献

附录

作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨侃侃

导师: 王勇

关键词: 羊口疮病毒,分离鉴定,遗传进化,宿主,天然免疫

来源: 安徽农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 安徽农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.26919/d.cnki.gannu.2019.000198

总页数: 72

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羊口疮病毒六安株遗传进化分析及诱导宿主天然免疫基因表达的影响

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