光遗传调控SOCE通路诱导NFATcl与NFATc3活化在神经祖细胞分化调控中作用机制的研究

论文摘要

神经祖细胞（Neural Progenitor Cell,NPCs）是中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）中一种特殊类型的专能干细胞,具有自我更新和定向分化为星型胶质细胞（Astrocyte,Ast）,少突胶质细胞（Oligodendrocyte,OL）和神经元（Neuron,Neo）的能力。NPCs不仅作为哺乳动物CNS发育早期的神经发生细胞,在成熟的CNS中,NPCs也可作为后备存储细胞,少量的储存在成体脑组织的特定区域内。当CNS受到损伤或疾病刺激而发生不可逆转的细胞死亡和缺失后,NPCs被重新激活,参与细胞和组织的损伤修复过程。基于这种特性,临床上已经应用体外培养的NPCs移植来治疗CNS损伤。然而,在自然分化的条件下,仅有约15%的NPCs向Neo分化,约10%的NPCs向OL分化,绝大部分约75%的NPCs向Ast方向分化。在这种不平衡的分化比例下,不仅过多Ast会形成胶质瘢痕而阻碍损伤的修复,Neo和OL分化比例过低也会严重限制神经功能的恢复。因此,如何诱导NPCs定向OL或者Neo分化目前NPCs研究领域中亟待解决的难题。研究发现NPCs的分化调控可以概括为外部信号和内部信号两个主要方面。而NPCs内部转录因子的表达水平被发现在NPCs定向分化中发挥了决定性作用,过表达Mash1/Olig2/Hes1三种重要的转录因子在NPCs中的表达能够直接促进NPCs向Neo/OL/Ast的定向分化。这提示我们NPCs的定向分化调控是可以通过调转录因子的表达水平来实现。活化的T细胞核内转录因子（Nuclear factor of activated T cells,NFAT）是一大类转录因子家族,包括NFATc1—c5五种亚型。目前研究发现NFAT家族的功能不仅仅局限于免疫系统中,同时也广泛调控着CNS中重要的生理过程,如:神经发生,神经细胞分化等。Tranque等人通过药理阻断NFAT蛋白功能后,发现NPCs的增殖、迁移、分化均等功能受到显著的影响;Wegner等人报道了NFAT转录因子在OL细胞系中表达下调会抑制Olig2的表达,阻碍OL的分化过程。这说明NFAT转录因子家族可能在NPCs中广泛参与了重要细胞功能的调控,甚至调控着Olig2的表达,从而参与了NPCs向OL的分化过程。然而目前探究NFAT信号在NPCs定向分化中的研究报道非常少,这一假设需要进一步的实验证据支持。不仅如此,NFAT信号的活化和关闭具有明显的钙离子(Calcium,[Ca2+])依赖性和可调控性。在细胞处于静息状态时,磷酸化的NFAT蛋白富集于细胞浆内。而在刺激作用后,细胞浆内[Ca2+]浓度快速升高,诱导钙调素（Calmodulin,CaM）的活化,从而激活下游钙调蛋白（Calcineurin,CaN）使NFAT蛋白发生去磷酸化。去磷酸化后NFAT蛋白入核并与DNA序列结合从而发挥调控作用。值得注意的是,NFAT信号核转位的维持需要连续的[Ca2+]信号刺激,当细胞内的[Ca2+]水平下降时,NFAT蛋白会迅速的被重新磷酸化而转运出细胞核。因此,NFAT转录因子功能的发挥不仅与细胞浆内[Ca2+]浓度密切相关,更需要持续的高浓度的[Ca2+]信号刺激。研究发现,钙库操纵性钙离子内流(Store—operated Ca2+entry,SOCE)是非兴奋细胞中胞内[Ca2+]升高的主要方式之一。SOCE通路目前已明确是由两个主要的蛋白质家族构成,即位于内质网上STIM蛋白和位于细胞膜上的Orai蛋白。Nieswandt等人发现当小鼠胸腺T细胞内的STIM蛋白被敲除后,NFAT信号通路显著减弱甚至消失。这提示我们SOCE通路所介导的[Ca2+]升高是NFAT信号激活的主要源头,并且理论上通过调控SOCE通路在NPCs中的开放与关闭,可以间接的实现对其下游[Ca2+]/CaN/NFAT信号通路的精确调控。不仅如此,通过调控SOCE/NFAT通路能否实时调控NPCs的分化启动和命运决定,这些假设值得进一步的探究。本研究结合最新的光遗传学技术,即在NPCs稳定表达光敏感的SOCE通路蛋白,利用470nm波长蓝光照射（Blue Light Stimulation,BLS）来实时、精确的调控SOCE通路在NPCs中的开放与关闭。随后通过Fluo-3检测胞内[Ca2+]水平,PCR、ICC等方法检测BLS刺激后SOCE通路开放及NFAT信号核转位情况。最后通过ICC检测BLS刺激后,NPCs分化情况以及NFAT亚型不同的调控功能。本研究期望通过光遗传技术构建体外实时调控NPCs定向分化的细胞模型同时为NFAT通路在NPCs定向分化中的重要作用提供实验依据。本实验分为四个部分:第一部分光遗传质粒rLOVsoc病毒质粒的构建与鉴定,体外NPCs转染效率评定光遗传LOVsoc原始质粒由Yubin Zhou教授赠送（Addgene,#101245）,其质粒结构为pTriEx-mCh-LOV2-hSTIM1。我们通过分子克隆技术将原始质粒中hSTIM1片段替换为大鼠来源的rSTIM1片段。并将mCh-LOV2-rSTIM1片段扩增下来后重组至LeGO-iT2慢病毒载体中,构成本实验所采用的rLOVsoc质粒。体外培养NPCs以新生3 d内的SD乳鼠脑组织为原材料,在体外呈悬浮生长的神经球,ICC检测出>90%的细胞表现出Nestin强阳性,提示NPCs纯度高。随后重组的rLOVsoc质粒经慢病毒包装后成功转染NPCs,统计结果显示带有红色荧光信号的NPCs的比例为92%,提示转染率高。Western Blot结果显示在rLOVsoc转染NPCs两周后,mCherry蛋白条带仍然呈阳性,提示mCh-LOV2-STIM1重组蛋白稳定表达于转染细胞中,为后续实验打下基础第二部分不同光刺激强度对于NPCs功能的影响、体外光刺激诱导NPCs分化模式的优化首先采用载体质粒LeGO-iT2包装的慢病毒转染NPCs,在BLS刺激0-60 min后,无明显台盼蓝阳性细胞比例升高,也无Nestin荧光强度降低,提示单纯BLS刺激不会影响NPCs功能。随后我们使用光遗传质粒rLOVsoc包装的慢病毒转染NPCs,在BLS刺激0-60 min后,台盼蓝阳性细胞比例在BLS 30 min后呈现显著的升高,而Nestin阳性荧光信号强度随着BLS刺激时长而逐渐降低。尤其,观察到BLS 30 min时,视野内已几乎无Nestin阳性细胞存在,提示BLS 30 min刺激后,NPCs在3 d内已全部启动分化。综合NPCs分化和细胞死亡的情况,BLS 30 min将作为一个最优的刺激模式,既能有力的诱导NPCs的分化启动,又能避免引起细胞损伤,甚至死亡。第三部分BLS刺激后NPCs胞内[Ca2+]震荡信号活化,诱导NFATc1与NFATc3核移位,参与NPCs向OL的定向分化首先采用钙成像技术检测Fluo-3探针标记细胞的静息和动态胞内[Ca2+]水平。结果显示在BLS 30 min刺激后,胞内[Ca2+]局部升高在重组蛋白聚集的一侧,而BLS 60min刺激后,全胞浆内[Ca2+]呈现增高的强荧光信号。而[Ca2+]曲线显示,BLS 30 min诱导了时高时低“钙震荡”信号传递波形,BLS 60 min诱导了快速上升后稳定维持的“钙超载”损伤波形。PCR反应检测了下游信号分子的表达情况。结果显示BLS 30min后,STIM1、Orai1、CaN mRNA条表达显著升高,伴随着下游NFATc1-3亚型mRNA表达的升高,提示BLS刺激了SOCE通路的开放和CaN蛋白功能来调控NFATc1-3亚型的表达。进一步通过ICC验证NFAT1-3亚型是否参与了核转位过程。结果显示BLS刺激后,NFATc1与NFATc3荧光信号升高集中在胞核区域,而NFATc2荧光信号在胞浆内升高,而非在胞核内。提示在BLS刺激后,只有NFATc1与NFATc3蛋白发生了核转位。而对NPCs分化的细胞类型检测的结果显示,BLS刺激后,NPCs分化的细胞中,GFAP阳性细胞比例明显降低,而OLIG阳性细胞比例显著升高。这一表型同时伴随着Hes1表达水平降低和Olig2表达水平升高。提示NFAT核转位后通过调控Olig2的表达诱导了NPCs向OL的定向分化。然而这一现象可以被VIVIT（CaN/NFAT通路特异性阻断剂）所逆转。第四部分NFATc1与NFATc3在[Ca2+]/CaN/NFAT通路中介导NPCs不同功能的实验研究通过Crispr-cas9技术,我们构建NFATc1和NFATc3敲减质粒,经Western Blot检测结果证明NFATc1和NFATc3均可有效干扰NFAT蛋白的表达。当NFATc1敲减质粒被包装成慢病毒转染NPCs后。结果显示,与对照组相比,TUNEL阳性细胞比例在敲减组无明显的增加。然而Nestin ICC结果显示,敲减组在分化3d时,依然有较多的Nestin阳性的神经球存在,提示NFATc1敲减抑制了NPCs的分化启动。ICC检测显示在敲减组中TUJ1阳性的细胞比例显著升高,而GFAP与OLIG阳性细胞比例显著下调,证明了NFATc1在NPCs向胶质细胞分化中发挥了重要作用。当NFATc3敲减质粒被包装成慢病毒转染NPCs后。结果显示,与对照组相比,TUNEL阳性细胞比例在敲减组中显著增加,提示NFATc3敲减诱导了凋亡的发生。而Nestin ICC结果显示,在BLS 30min刺激后,敲减组中无明显的Nestin阳性细胞存在,与对照组类似。进一步对分化细胞染色发现,TUJ1阳性细胞比例显著降低,几乎在视野内不可见,证明了NFATc3在NPCs向Neo分化中发挥了重要作用。而当NFATc1和NFATc3同时敲减时,所有NPCs在24 h全部死亡。第五部分[Ca2+]信号介导OLs损伤和分化的实验研究通过采用氧糖剥夺（Oxygen and glucose deprivation,OGD）实验诱导体外培养的OLs中发生缺氧反应,刺激胞外腺苷浓度的升高,从而直接刺激[Ca2+]通道IP3R2的过度开放以验证[Ca2+]信号在OLs损伤和分化功能中的调控作用。结果显示,OGD刺激后IP3R2蛋白的表达显著升高,伴随着腺苷1型受体（Adenosine 1 adenosine receptor,A1AR）荧光信号增强、转录因子Olig2荧光信号减弱和胞内[Ca2+]静息水平的上升,然而这一表型可以被Caffeine（AR非选择性阻断剂）所阻断。随后使用高浓度的腺苷诱导胞内[Ca2+]急性反应,[Ca2+]动态曲线呈现出[Ca2+]超载波形,而使用Caffeine后,[Ca2+]动态曲线波动稳定维持在基线水平,与对照组类似。进一步验证OLs的分化,结果显示OGD刺激显著抑制了OLs前体细胞中CNPase荧光信号强度以及成熟OLs中MBP的荧光信号强度。这些结果提示OGD引起的[Ca2+]超载介导了OLs损伤的发生以及OLs分化受阻,然而通过药理阻断[Ca2+]超载信号,维持[Ca2+]稳态能够逆转OGD对于OLs的损伤并保护OLs正常分化、成熟。小结:本实验通过构建重组rLOVsoc质粒并转染NPCs,创新性的构建了实时体外光调控NPCs定向OL分化的细胞模型。同时实验阐明了其机制:rLOVsoc质粒在接受刺激后通过诱导钙震荡信号,激活下游CaN,促进NFATc1和NFATc3蛋白的核转位,最终上调了转录因子Olig2的表达,调控NPCs向OL分化。本研究首次阐明了NFAT亚型对于NPCs不同细胞功能的调控,为NFAT信号在NPCs中的重要作用提供了实验证据:NFATc1参与了NPCs的分化启动并调控着NPCs向胶质细胞方向分化,而NFATc3抑制了NPCs凋亡的发生并调控着NPCs向Neo方向分化。当NFATc1和NFATc3蛋白同时被抑制后,NPCs的存活便无法维持。不仅如此,[Ca2+]信号对于OLs损伤和分化的影响进一步证明了[Ca2+]信号在神经细胞,尤其是NPCs定向OLs分化以及OLs早期分化过程中发挥了重要调控作用

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马腾

导师: 李红丽

关键词: 神经祖细胞,钙离子,分化,凋亡

来源: 中国人民解放军陆军军医大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国人民解放军陆军军医大学

分类号: R338

DOI: 10.27001/d.cnki.gtjyu.2019.000448

总页数: 87

文件大小: 5064K

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