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代谢工程改造丙酮丁醇梭菌强化丁醇合成及廉价生物质利用

2020-12-02阅读(719)

代谢工程改造丙酮丁醇梭菌强化丁醇合成及廉价生物质利用

论文摘要

丁醇作为大宗化学品,广泛应用于化工、医药、能源等领域。随着化石能源日益枯竭以及全球环境问题的不断恶化,丁醇由于其理化性质优于乙醇并且与汽油相似,因此,被认为是比乙醇更好的第二代生物燃料。丁醇可通过石油化工合成法和微生物发酵法生产,石油化工法合成丁醇具有高效性和经济性,目前仍是生产丁醇的主要方法。但由于化石能源的不可再生性以及石化工业会对环境造成严重污染等问题,因此,具有可持续发展和环境友好型等优点的微生物发酵法生产丁醇重新受到人们的关注,并成为全球科学家研究的热点。但微生物发酵法生产丁醇面临着产量低、生产效率低以及生产成本高等诸多问题和挑战,导致其市场竞争力远低于石油化工法。因此,进一步提高丁醇产量和生产效率、降低生产成本是提高生物丁醇市场竞争力的关键。本论文通过基因工程手段对丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）进行改造,以提高丁醇生产强度和对木质纤维素生物质的利用能力。在C.acetobutylicum ATCC 824中过表达VB1生物合成相关基因thiC、thiG和thiE,显著提高菌体VB1的生物合成强度,促进碳源代谢以及能量生产,最终使更多的碳源流向丁醇合成。在不添加VB1的P2培养基中,工程菌C.acetobutylicum 824（thiCGE）的碳源利用和丁醇合成得到显著提高。当以葡萄糖为底物时,底物消耗和丁醇产量分别提高了 11.6±2.8%和13.0±0.1%;当以木糖为底物时,总碳源消耗和丁醇产量分别提高了11.6±0.4%和12.7±1.2%;当以混合糖为底物时,木糖消耗和丁醇产量分别提高了45.8±1.9%和 20.4±0.3%。辅因子NADH在丁醇的生物合成过程中起关键作用。C.acetobutylicum ATCC 824胞内NADH的供应不足限制了丁醇合成,因此提高C.acetobutylicum ATCC 824胞内NADH的供应是提高丁醇合成的有效途径。在ABE发酵过程中外源添加NAD（H）从头合成前体物质-天冬氨酸,发现丁醇产量显著提高,进一步研究表明NAD+从头合成相关基因nadA、nadB和nadC的表达量显著上调,胞内总NAD（H）的浓度显著提高。有鉴于此,在C.acetobutylicum ATCC 824中研究了过表达NAD+从头合成相关基因对丁醇合成的影响。结果表明,分别过表达nadA、nadB和nadC后,丁醇产量均有提高,其中过表达nadC丁醇产量提高最为显著,较出发菌提高了 13.5±0.4%。为了进一步提高丁醇产量,同时过表达了 VB1生物合成相关基因thiC、thiG、thiE和DNA（H）从头合成相关基因nadC,使得在提高碳源代谢和能量生产的同时强化NADH的供应。结果表明,工程菌C.acetobutylicum 824（thiCGE-nadC）的丁醇产量达到 13.96±0.11 g/L,较工程菌C.acetobutylicum 824（thiCGE）和C.acetobutylicum 824（nadC）分别提高了 7.2±0.4%和18.1±0.1%,较出发菌提高了 34.1±0.1%。研究了嗜极微生物热激蛋白对C.acetobutylicum ATCC 824细胞性能的影响。在C.acetobutylicum 824中异源表达来自耐辐射奇异球菌Deinococcus wulumuqiensis R12的热激蛋白GroESL和DnaK,显著提高菌体对丁醇、低pH值以及纤维素水解液抑制物的耐受性,同时也发现来自于Deinococcus wulumuqiensis R12的热激蛋白性能优于C.acetobutylicum 824本身的热激蛋白,异源表达来自Deinococcus wulumuqiensis R12的热激蛋白DnaK的工程菌C.acetobutylicum 824（dnaK R12）性能最佳。当以未脱毒的大豆秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆水解液为底物发酵时,工程菌C.acetobutylicum 824（dnaK R12）的丁醇产量分别达到 5.82±0.07、3.32±0.15 和 4.38±0.30g/L,较出发菌（4.50±0.14g/L、1.63±0.21g/L 和 2.03±0.03g/L）分别提高了 29.4±2.5%、104.8±17.1%和 115.7±10.9%。探索了脯氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824耐受纤维素水解液抑制物的影响。通过外源添加脯氨酸后,菌体对甲酸、阿魏酸、丁香醛和香豆酸的耐受性显著提高。进一步研究表明,共表达脯氨酸合成相关基因proA、proB和proC后,胞内脯氨酸合成能力和ROS清除能力得到显著提高,同时,工程菌C.acetobutylicum 824（proABC）对甲酸、阿魏酸、丁香醛和香豆酸的耐受性也显著提高。当以未脱毒的大豆秸秆、水稻秸秆和玉米秸秆水解液为底物发酵时,工程菌C.acetobutylicum 824（proABC）的丁醇产量分别为8.0±0.07、7.80±0.20 和 6.30±0.10g/L,分别是出发菌的 2、3.4 和 4.4 倍。上述研究结果表明,本研究所使用的策略成功提高了C.acetobutylicum ATCC 824的丁醇生产能力和对木质纤维素生物质的利用能力,对其它燃料微生物的相关分子育种具有一定的参考价值。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 中英文对照和缩略词表
  • 第一章 绪论
  •   1.1 正丁醇概述
  •     1.1.1 正丁醇的性质
  •     1.1.2 丁醇的应用
  •     1.1.3 丁醇的生产
  •   1.2 ABE发酵
  •     1.2.1 ABE发酵概述
  •     1.2.2 ABE发酵研究进展
  •     1.2.3 ABE发酵面临的问题和挑战
  •   1.3 本课题的目的意义及研究内容
  •     1.3.1 课题的目的和意义
  •     1.3.2 课题的研究内容
  • 第二章 强化VB1生物合成对C.acetobutylicum ATCC 824丁醇生产的影响
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料和方法
  •     2.2.1 实验试剂与仪器
  •     2.2.2 菌株和质粒
  •     2.2.3 本章所用引物
  •     2.2.4 本论文常用培养基和抗生素
  •     2.2.5 实验方法
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 不同浓度VB1对C.acetobutylicum ATCC 824发酵性能的影响
  •     2.3.2 重组质粒pMTL-Pthl thiCGE的构建、转化及验证
  •     2.3.3 VB1合成相关基因转录水平分析
  •     2.3.4 过表达thiC thiG和thiE基因对C.acetobutylicum ATCC 824 VB1生物合成的影响
  •     2.3.5 过表达VB1合成相关基因对C.acetobutylicum ATCC 824胞内ATP水平的影响
  •     2.3.6 VB1合成增强对C.acetobutylicum ATCC 824发酵性能的影响
  •   2.4 结论
  • 第三章 天冬氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824 NAD（H）合成及丁醇发酵的影响
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 实验试剂和仪器
  •     3.2.2 菌株和质粒
  •     3.2.3 本章所用引物
  •     3.2.4 本研究常用培养基和抗生素
  •     3.2.5 实验方法
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 外源添加天冬氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824发酵性能的影响
  •     3.3.2 外源添加天冬氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824 NAD（H）合成相关基因转录水平的影响
  •     3.3.3 外源添加天冬氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824胞内NAD（H）水平的影响
  •     3.3.4 载体构建、转化及验证
  •     3.3.5 过表达NAD（H）从头合成关键基因对C.acetobutylicum ATCC 824发酵性能的影响
  •     3.3.6 共表达VB1合成相关基因和NAD（H）合成相关基因对C.acetobutylicum ATCC 824发酵性能的影响
  •   3.4 结论
  • 第四章 嗜极微生物热激蛋白对C.acetobutylicum ATCC 824细胞性能的影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 菌株和质粒
  •     4.2.2 本章所用引物
  •     4.2.3 主要实验试剂和材料
  •     4.2.4 载体构建
  •     4.2.5 SDS-PAGE检测蛋白表达
  •     4.2.6 菌株耐受性测试
  •     4.2.7 木质纤维素生物质预处理和酶水解
  •     4.2.8 批次发酵
  •     4.2.9 实验分析方法
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 载体构建、转化及验证
  •     4.3.2 SDS-PAGE检测工程菌体内热激蛋白的表达
  •     4.3.3 在C.acetobutylicum ATCC 824中异源表达嗜极微生物的热激蛋白对菌株抗逆性的影响
  •     4.3.4 过表达嗜极微生物热激蛋白对C.acetobutylicum ATCC 824丁醇发酵的影响
  •   4.4 结论
  • 第五章 脯氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824纤维素水解液抑制物耐受性的影响
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与方法
  •     5.2.1 菌株和质粒
  •     5.2.2 本章所用引物
  •     5.2.3 脯氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824纤维素水解液抑制物耐受性的影响
  •     5.2.4 载体构建
  •     5.2.5 木质纤维素生物质预处理和酶水解
  •     5.2.6 RT-PCT检测目的基因表达水平
  •     5.2.7 胞内脯氨酸含量测定
  •     5.2.8 胞内ROS水平测定
  •     5.2.9 工程菌对菌纤维素水解液抑制物耐受性测试
  •     5.2.10 批次发酵
  •   5.3 结果
  •     5.3.1 外源添加脯氨酸对C.acetobutylicum ATCC 824纤维素水解液抑制物耐受性的影响
  •     5.3.2 过表达脯氨酸合成相关基因重组质粒的构建、转化及验证
  •     5.3.3 工程菌C.acetobutylicum 824（proABC）脯氨酸合成相关基因转录水平分析
  •     5.3.4 过表达脯氨酸合成相关基因对C.acetobutylicum ATCC 824胞内脯氨酸合成的影响
  •     5.3.5 过表达脯氨酸合成相关基因对C.acetobutylicum ATCC 824胞内ROS清除能力的影响
  •     5.3.6 过表达脯氨酸合成相关基因对C.acetobutylicum ATCC 824纤维素水解液抑制物耐受性的影响
  •     5.3.7 过表达脯氨酸合成相关基因对C.acetobutylicum ATCC 824以未脱毒的纤维素生物质水解液为底物的发酵性能影响
  •   5.4 结论
  • 结论与展望
  •   结论
  •   创新点
  •   展望
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 廖正平

    导师: 王菊芳

    关键词: 丙酮丁醇梭菌,丁醇,热激蛋白,脯氨酸,纤维素生物质

    来源: 华南理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,有机化工

    单位: 华南理工大学

    分类号: Q939.9;TQ223.124

    DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.000365

    总页数: 160

    文件大小: 9103K

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