程婕[1]2003年在《猪肝酯酶基因的克隆与表达》文中提出猪肝酯酶(Pig Liver Esterase，简称PLE)是手性催化工业中最常用的叁种生物催化剂之一。它是从猪肝中提取出来的一种羧酸酯水解酶(EC 3．1．1．1)，具有很强的手性选择水解能力。 纯的PLE具有高的催化活性，为了得到单一纯组分蛋白，设计构建基因工程菌株以快速高效得到PLE。甲醇酵母表达系统是最近迅速发展起来的一种真核表达系统，它能以甲醇为唯一碳源大量合成蛋白质，已用于表达多种外源蛋白，被认为是最具发展前景的蛋白质生产工具之一。针对PLE这一真核生物的糖蛋白，本实验选用Invitrogen公司的Phichia pastoris Multi-copy Expression System克隆表达PLE，使PLE能够得到正确的翻译后加工和修饰。 从新鲜猪肝组织中提取总RNA，并设计嵌套引物进行RT-PCR。目的片断与载体pPIC9K，连接并转化入E.coli JM109，得到含有PLE基因的重组质粒pPIC9K-PLE。该质粒经双酶切、不同引物的PCR扩增、NcoⅠ酶切等方法鉴定，以及DNA测序，证明pPIC9K-PLE表达载体构建成功。 pPIC9K-PLE经线性化后，电击转化入甲醇酵母GS115中，通过MD平板筛选、PCR扩增鉴定，证明pPIC9K-PLE成功整合入GS115中。阳性转化子经发酵诱导，PLE表达量达450mg／L，且纯度高，分子量在60kDa左右，发酵液上清酶活力达2.21U／ml。 本实验获得的结果为PLE的下一步开发利用打下了基础。
程婕, 赵晓瑜[2]2005年在《猪肝酯酶在甲醇酵母中的克隆与表达》文中研究说明猪肝酯酶(Pig Liver Esterase,PLE)是手性合成工业中最常用的叁种生物催化剂之一,它的 生化提取物是多种同工酶(α、β和γ亚基)的混合物,而它的单一组分(γ亚基)有很高的手性拆分 活性。为获得重组PLE,从猪肝提取总RNA,经RT-PCR得到γ亚基目的基因,并利用pPIC9K质 粒构建成pPIC9K-PLE表达载体,转化到Pichia pastoris中,转化细胞株摇瓶发酵表达重组PLE达 450mg／L,活性染色证明分子量略低于天然酶。
李朋辉[3]2014年在《猪PLE1的功能性表达及其启动子的克隆和分析》文中研究表明猪肝羧酸酯酶(pig liver esterase,PLE)是由多种同工酶组成的酶家族,属于丝氨酸水解酶类。已有研究提示PLE可能在猪的内、外源性酯类物质(包括前药)的水解和代谢中发挥着重要作用,PLE在猪体内表达水平和活性变化可能影响相关兽药的疗效和毒副作用。遗憾的是,目前人们对PLE的研究仍局限于其在有机化学合成领域的应用,很少涉及PLE与兽医临床用药疗效的关系以及与机体内毒物形成的关系。PLE1是该酶家族表达丰度最高、最为重要的成员之一,进行PLE1功能性表达不仅可为研究猪肝羧酯酶水解兽药的特点提供高纯度的具有原有酶活性的酶,同时也为功能性表达该家族其它成员搭建技术平台；研究PLE1的启动子,有助于揭示PLE1的转录调控分子机制,进而可预测在内外源性物质的作用下,PLE表达水平发生何种变化,以及这种变化导致相关药物疗效和毒副作用的变化,为临床用药提供必要的理论依据,为阐明该家族其它成员的转录调控机制提供有益参考。主要研究内容和结果如下：首先,进行了PLE1的功能性表达。提取猪肝脏总RNA,反转录为cDNA,在PLE基因5'和3'同源区设计引物,扩增PLE同工酶亚型基因编码区,将扩增产物连接pMD-18T,测序结果表明克隆到包括PLE1在内的多种PLE同工酶；双酶切PLE1及pET15b,用T4连接酶连接,构建pET15b-PLE1表达载体；将分子伴侣pGro7质粒转化E.coli OrigamiTM 2(DE3), CaCl2处理,制备Origami-pGro7感受态细胞；pET15b-PLE1转化Origami-pGro7感受态细胞,筛选出阳性克隆,命名为Origami-pGro7-PLE 1；用L-Arabinose诱导分子伴侣pGro7首先表达,在细菌生长的对数期用IPTG诱导PLE1表达。在分子伴侣pGro7辅助下,PLE1重组蛋白以可溶性形式表达,经检测具有原有酶催化水解的活性。利用巢式PCR技术,克隆得到PLE1基因5'端上游1153bp的调控区片段；对该调控区进行了生物信息学分析,发现含有典型的启动子序列,不存在TATA盒和CpG岛。但存在多个得分高的转录因子结合位点如C/EBP、SP1、USF、SRY等,同时还发现存在EGF_1、VWFC_1、ANAPHYLATOXIN_1等7种基序；利用5'-RACE技术对PLE1的转录起始位点进行了鉴定,发现PLE1翻译起始位点ATG上游-56bp处G出现频率高,认为是PLE1的转录起始位点；确定了PLE1的核心启动区为-235/+66bp;PLE1的核心启动子区存在SP1和CEBP两个重要的转录因子结合位点,它们在PLE1基因的转录激活过程中发挥了重要的作用,突变GC盒,PLE1启动子活性下降55%,突变CEBP转录因子结合位点,启动子活性下降22%,双突变GC盒和CEBP位点,启动子活性下降46%；EMSA(?)supershift assays证明SP1和SP3均能结合于GC盒,C/EBPα和C/EBPβ均能结合于CEBP位点；进行了转录激活试验,C/EBPβ、SP1均表现为PLE1转录的强激活因子,单独作用均可强烈地上调PLE1启动子的活性,C/EBPα表现为PLE1基因转录的抑制因子,可大幅度下调PLE1启动子活性,SP3似乎对PLE1启动子活性的影响不大,C/EBPa与SP1、SP3和/或C/EBPβ共同作用时,可显着地下调PLE1启动子的活性,表现出负协同作用。
肖启玲, 李朋辉, 闫秉芳, 杨路, 王喜亮[4]2015年在《猪肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核细胞中的功能性表达》文中提出为获得有活性的猪肝羧酸酯酶1(PLE1)并研究其功能,利用RT-PCR与常规PCR方法,从大白猪肝组织中扩增PLE1基因的ORF。将PLE1的ORF序列连接到pET15b原核表达载体,在Origami TM2(DE3)中与pGro7质粒共诱导表达,纯化目的蛋白质并检测其酶活性。测序结果表明克隆到PLE1基因编码区全长1 686bp的片段,该片段编码562个氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,PLE1融合蛋白质成功表达,在30℃的培养温度下,IPTG诱导6h后,PLE1重组蛋白质表达量最高,且大部分以可溶性形式存在。酶活性试验结果表明,PLE1融合蛋白质水解底物p-NPA的酶活力为1.24U。研究结果不仅为研究PLE1水解兽药特性提供高纯度的具有原有酶活性的重组蛋白质,也为PLE同工酶家族其他重要成员的活性功能研究提供理论依据和技术手段。
王振豹[5]2011年在《成年猪与仔猪肝脏γ猪肝羧酸酯酶表达差异研究》文中认为肝脏是动物(或人)机体清除药物的主要器官,它可表达多种药物代谢酶(Drug-metabolizing enzyme, DMEs),γ猪肝羧酸酯酶(γpig liver carboxlesterase,γ-PLE, EC 3.1.1.1)是肝脏最重要最常见的药物代谢酶之一,属于Ⅰ相药物代谢酶。具有促使各种包含酯类、胺类和硫酯药物生物转化的功能,以及激活前药物和代谢的作用。除此以外,还参与多种环境毒物、致癌物质的解毒和代谢；参与脂质运输和代谢以及参与信号跨膜转导及保持生物膜的完整性。药物在临床上的联合应用是目前最为常见的用药方式,而不论两种或多种药物同时或连续应用,药物治疗效果变化的可能性是存在的；临床用药时,药物在不同日龄、不同品种猪之间的使用剂量不同；而这些作用的产生大多数是由药物代谢酶介导的。因此,对于γ-PLE表达谱的研究将为这些临床用药中存在的问题提供理论依据。本研究运用Western blot、Real-time PCR技术,对γ-PLE在不同日龄猪肝脏中的表达,进行了γ-PLE表达谱的研究,取得如下研究结果：1.1,猪肝羧酸酯酶基因的克隆及重组表达质粒的构建提取猪肝脏总RNA, RT-PCR获全长cDNA, PCR扩增获得γ-PLE基因片段,大小为1686 bp,酶切回收后连接到pET-32a(+)载体,对重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析及测序分析,与GenBank序列号为X63323的γ-PLE基因片段序列进行BLAST比对,同源性达99%,成功构建pET32a-yPLE重组表达质粒。2.γ猪肝羧酸酯酶的原核表达及表达蛋白的纯化和活性检测携带γ-PLE基因的pET32a-yPLE表达质粒在E. coli BL21 (DE3)中进行表达,并对表达条件进行优化,结果显示pET32a-yPLE在37℃条件下诱导5h后表达量最佳,表达物分子量约为75 KDa。Western blot证实重组蛋白具有较好的免疫反应活性。经包涵体复性纯化,获得了高纯度的表达蛋白,浓度为2.01mg/mL,为制备兔抗γ-PLE多抗奠定了基础；表达产物可进行酶活性染色,说明复性后的表达产物具有酶活性。3.兔抗γ-PLE多抗的制备与纯化用纯化的表达蛋白pET32a-yPLE免疫健康家兔,经多次免疫,制备了兔抗PET32a-yPLE的高免血清。将所得高免血清采用饱和硫酸铵粗提和G-200过柱纯化,最后得到了纯化的兔抗pET32a-yPLE多克隆抗体。Western blot证实此多抗具有较好的免疫反应活性,为γ-PLE的表达谱的研究奠定了基础。4.γ-PLE表达谱的研究提取仔猪、成年猪肝脏蛋白,以β-actin蛋白为内参蛋白,利用制备的多抗做Western blot,实验结果表明γ-PLE在成年猪表达量较高；提取仔猪和成年猪肝脏总RNA,反转录cDNA,以GAPDH基因为内参基因,利用荧光定量PCR技术,实验结果表明γ-PLE在成年猪表达量是仔猪的31倍,差异极显着。分别从蛋白水平和mRNA水平进行了γ-PLE表达谱的研究。
杨路[6]2016年在《猪肝羧酸酯酶主要亚型功能性表达及其酶活性比较研究》文中研究表明猪肝羧酸酯酶(pig liver carboxylesterase,PLE)是一个由多种同工酶组成的酶家族,它存在于猪的肝脏中。从猪体内直接提取的PLE是多种同工酶的混合物,且不同批次提取物的成分和活性差异较大。到目前为止,文献报道的PLE有7种亚型,分别为PLE1,PLE2,PLE3,PLE4,PLE5,PLE6以及APLE。PLE具有高度的立体选择性,在水解对映异构体的反应中能选择性地水解其中的一种,获得单一的对映体产物,在功能性单一对映体化合物和药物中间体工业生产中起到重要的作用,因而在有机化学合成领域扮演重要的角色。本研究早期的研究表明,在通城猪和大白猪肝脏中有多种PLE同工酶存在,它们的表达丰度和表达水平与年龄及品种显着相关。本研究通过对PLE主要亚型进行原核功能性表达,获得PLE重组蛋白,测定PLE重组蛋白对通用底物和特异性底物的水解活力,获得PLE同工酶的水解特征,为进行PLE水解兽药的研究提供理论依据。又选取PLE同工酶中氨基酸差异最小且酶活力差异最大的亚型,进行基因定点突变,寻找影响酶活性大小的关键氨基酸,探讨影响PLE水解活性的决定因素。本研究在克隆得到多种PLE同工酶c DNA的基础上,通过对PLE的表达丰度分析,筛选出PLE同工酶中的主要亚型PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE、PLE12、PLE13、PLE18,对其进行原核功能性表达。依据Gen Bank中PLE1c DNA序列设计引物。上游引物从去除信号肽之后的核苷酸序列开始,5'端依次加上7个保护性碱基GGAATTC和Nde I酶切位点CATATG;下游引物去除编码内质网滞留信号的12个核苷酸(CATGCTGAGCTG),5'端依次加入3个保护性碱基CCG、Xho I酶切位点CTCGAG和终止密码子TCA。用课题组前期构建的重组p MD18T-PLE为模板,用上述引物扩增PLE的ORF。将PLE基因插入到表达载体p ET15b上,构建p ET15b-PLE原核表达载体。将构建的表达载体与分子伴侣质粒p Gro7在Origami?2(DE3)中进行共表达。首先加入L-阿拉伯糖(L-Arabinose)诱导p Gro7表达,接着加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导PLE表达。诱导后离心集菌,破碎菌体收集上清液,用镍离子亲和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE电泳分析PLE蛋白。用通用底物对硝基苯基乙酸酯(p-NPA)检测纯化PLE的水解活性,重组PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE、PLE12、PLE13、PLE18水解p-NPA的活力分别为:3.5U/mg、1.75 U/mg、1.19 U/mg、1.41 U/mg、1.78 U/mg、6.72 U/mg、2.91 U/mg、1.83 U/mg、1.73 U/mg、1.71 U/mg。用自动电位滴定仪测定PLE1、PLE2、PLE3、PLE4、PLE5、PLE6、APLE对特异性底物丁酸甲酯和丁酸己酯的活性,发现PLE1,PLE2,PLE3,PLE4,APLE优先水解丁酸甲酯,而PLE5,PLE6优先水解丁酸己酯。笔者对所有已见报道的PLE亚型和本研究新发现的PLE亚型(数据尚未发表)进行分析,发现所有亚型都具有相同的活性中心即催化叁联体(Ser204-Glu336-His449)。但前述研究结果显示不同的同工酶水解活力存在差异,表明PLE的活性中心并不能完全决定酶活力的高低,于是笔者对存在于活性中心以外的可能影响因素进行了研究。本研究前期研究共克隆到54种同工酶(已见报道的有7种),根据同工酶氨基酸序列的相似度将其分为七大类,用大写字母A~G代表,每一大类型用阿拉伯数字进行区别。从上述54种同工酶中筛选出5组彼此之间氨基酸差异最小的同工酶,为PLE-A8/PLE-A9、PLE-C2/PLE-C3、PLE-D4/PLE-D5、PLE-F3/PLE-F4、PLE-G6/PLE-G7,分别进行原核功能性表达。测定它们对p-NPA的酶活力分别为:1.17U/mg/5.9U/mg、0.99 U/mg/0.63U/mg、40.27U/mg/0.83U/mg、7.84U/mg/13.29U/mg、1.57U/mg/0.8U/mg,发现PLE-D4/PLE-D5这组亚型中酶活力相差最大。对PLE-D4和PLE-D5氨基酸全序列进行比对,发现两者间共有4个氨基酸不同,分别位于43、92、150、305位。以PLE-D4、PLE-D5为模板对这4个位置的氨基酸分别进行定点突变,获得8种突变体。对突变体进行原核功能性表达,测定PLE-D4的4种突变体L43P、T92I、A150D、M305V对p-NPA的酶活力分别为:0.48 U/mg、7.68 U/mg、1.07 U/mg、2.85 U/mg,酶活性相比PLE-D4的40.27 U/mg分别降低84.5倍、5.2倍、37.7倍、14.1倍。PLE-D5的4种突变体P43L、I92T、D150A、V305M对p-NPA的酶活力分别为:1.33 U/mg、2.0 U/mg、0.38 U/mg、0.57 U/mg,酶活性相比PLE-D5的0.83 U/mg,P43L、I92T分别升高1.6倍、2.4倍,D150A、V305M分别降低2.2倍、1.5倍。通过突变体活力分析发现PLE-D4的43位亮氨酸L和92位苏氨酸T能够显着提高PLE对通用底物p-NPA的活力,可作为定点突变提高PLE活力的靶点。
张好[7]2014年在《南海沉积物中酯酶基因克隆表达及酶学性质研究》文中研究表明酯酶(Esterase,E.C.3.1.1.X)在广义上指的是一类具有催化酯键水解或酯键形成的一类酶的总称,广泛存在于各种生态环境的动植物和微生物中。海洋具有各种低温、高温、高静水压、强酸、强碱以及营养条件极为贫乏的各种极端环境,因此从海洋特殊环境的微生物中筛选具有工业所需高效新型特性的酯酶具有广泛的开发前景。本研究从南海深海沉积物中分离得到元基因组DNA,并构建元基因组Fosmid文库,筛选克隆获得酯酶完整基因est424,长度为921bp,编码307个氨基酸,在氨基酸水平上与已经发现的酯酶同源性低于85%,可能是一个新的酯酶。利用pET28系统构建酯酶重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,但是重组酯酶形成包涵体,因此利用伴侣蛋白系统Chaperone Plasmid Set与酯酶重组表达载体进行共转化,通过5种伴侣蛋白的优化,利用分子伴侣蛋白dnaK-dnaJ-grpE共表达,最终获得了可溶性的重组酯酶蛋白,约35kDa。利用Ni+亲和层析系统,对重组酯酶进行分离纯化,获得了单一的纯化的重组酯酶est424。利用p-nitrophenol butyrat方法,研究重组酯酶的酶学性质。酯酶est424最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,该酯酶是一个中温碱性酯酶,其酶活单位为171.03U/mg。它在20℃下稳定,Fe2+和Mn2+可以有效提高酶的活性,1%的Tween80和20也可以提高酯酯酶的活性。从海洋微生物及海洋环境中来源的重组酶,在大肠杆菌系统中容易形成包涵体,该研究利用伴侣蛋白的共农达方法解决了包涵体的问题,并且为开发和利用海洋环境来源的酯酶资源,提供了理论和方法学基础。
肖启玲[8]2015年在《通城猪与大白猪猪肝羧酸酯酶表达谱与品种差异研究》文中指出猪肝羧酸酯酶(pig liver esterase,PLE),属于丝氨酸水解酶,是由多种同工酶组成的酶家族,各同工酶之间基因序列高度同源。由于在催化底物水解时具有高度的立体选择性和高度酶活性,PLE成为有机化学合成领域水解酶的主角,而PLE作为药物代谢酶角色的研究很少。本课题组前期研究结果提示:PLE主要成员之一PLE1可催化水解某些磺胺类药物,PLE同工酶活性存在差异,不同品种猪PLE同工酶丰度存在差异。受PLE表现出的高度水解活性、以及人羧酸酯酶的表达水平呈显着年龄相关性且已成为临床用药依据事实的启发,同时基于本课题的前期研究,系统比较研究不同品种和不同年龄猪PLE同工酶丰度和总表达量差异,可望为猪临床合理用药提供必要的理论依据。本研究选取国家重点保护品种通城猪和外来优良瘦肉型品种大白猪,进行PLE的品种差异研究;参考研究人羧酸酯酶表达谱的年龄段,选取8日、1月、3月、成年(6~7月)四个年龄段猪,每个年龄段选取3头叁代以内无血缘关系的猪进行PLE表达谱研究。由于PLE同工酶之间的基因和氨基酸序列高度同源,导致RT-q PCR和WB无法区分各自的m RNA和蛋白质,因此,本研究先根据同工酶保守区的核苷酸序列和氨基酸序列,分别设计RT-q PCR通用引物和制备通用抗体,检测PLE同工酶的m RNA和蛋白质总表达水平,同时用通用底物p-NPA测定肝脏S9的水解活性;再通过对肝脏中PLE同工酶ORF的大量克隆、测序,获得各同工酶出现的频率。结合PLE同工酶的m RNA水平和各同工酶出现的频率,得到各PLE同工酶表达丰度的数据。主要研究内容和结果如下:对1月龄和成年的两个品种猪,首先用RT-q PCR检测了11种组织中(分别是肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肺脏、小肠、皮肤、肌肉、脑、淋巴结及胸腺)PLE同工酶m RNA总表达水平,结果表明无论年龄大小,PLE在两种猪肝脏中表达量均为最高,其次为肾脏、小肠和皮肤。肝脏是机体内主要的代谢解毒器官,同时PLE在肝脏中表达量也最高,因此,后续研究集中在猪肝脏中PLE上。RT-q PCR检测四个年龄段的两个品种猪肝脏中PLE同工酶m RNA总表达量。结果表明在通城猪和大白猪肝脏中PLE m RNA总表达量最高的年龄段分别是3月龄和1月龄,但总体上m RNA表达水平与年龄呈正相关。两个品种猪相比,除3月龄时通城猪的PLE m RNA表达水平比大白猪高,其它叁个年龄段都是大白猪比通城猪的高。根据PLE同工酶靠近C末端的氨基酸保守序列设计合成两种多肽段,即PLE-C1-1:SKEAAKKPPKIKC和PLE-C2:CNTQAAKRLKGEE,两种多肽链等量混合后与KLH偶联,合成人工免疫原,免疫新西兰大耳兔,获得免疫血清,免疫血清用已偶联前述两种多肽的Sulfo Link凝胶柱进行免疫亲和层析纯化,得到效价高、特异性强的抗PLE通用抗体。等量混合同年龄段S9配制S9样品,WB检测S9样品中PLE总蛋白量,用Image J读取PLE和内参GAPDH的灰度值,计算两者的比值,得到四个年龄段通城猪和大白猪的比值依次是0.74,2.00,3.62,3.09和1.30,3.86,2.89,3.82,表明通城猪和大白猪PLE总蛋白表达量最高的年龄段分别是3月龄和1月龄,但总体上PLE蛋白表达水平与年龄呈正相关。两个品种猪相比,除3月龄时通城猪蛋白表达水平比大白猪高,其它的叁个年龄段都是大白猪比通城猪高。PLE蛋白表达趋势与m RNA一致。在含1μmol/L p-NPA的PBS(50m M,p H7.2)反应体系中,检测肝脏S9样品的催化水解活性,测得四个年龄段通城猪和大白猪的S9样品比活依次是:0.19U,0.59U,0.9U,1.29U和0.4U,1.05U,1.22U,1.69U。PLE酶活性表现出随年龄增长而增强的趋势,与PLE的m RNA、蛋白质的表达趋势大体一致。两个品种猪相比,四个年龄段大白猪的肝脏S9对p-NPA的水解活性都比通城猪强。通过以上试验获得了PLE同工酶的总表达量,但无法获得同工酶各自表达丰度的数据。克隆每头猪肝脏中PLE同工酶各亚型的完整ORF。每头猪随机挑取至少20个阳性克隆进行测序,共测序800多个阳性克隆。经统计发现共克隆到108种PLE亚型,除去5种已报道的亚型,发现103种新亚型,重复出现的PLE亚型有50多种,在2头猪以上出现的有39种,其中有19种在两个品种的猪中出现。将出现频率高的54种亚型,按25个变异位点的氨基酸的相似度分为7大类(A~G),每一大类再用阿拉伯数字区分。统计发现两个品种猪肝脏中PLE同工酶表达丰度存在明显差异,大白猪的四个年龄段都是PLE-A1表达丰度最高,其次是PLE-B9;相反地,通城猪在前叁个年龄段都是PLE-B9表达丰度最高,其次是PLE-A1(8日)或PLE-G5(1月和3月),而成年阶段是PLE-G3表达丰度最高。还发现PLE-G5和PLE-G3分别在两个品种猪的1月龄和成年期表达量大幅上升,提示PLE-G3和PLE-G5可能在两个品种猪的生长和成年阶段发挥重要作用。本研究发现通城猪和大白猪肝脏中PLE存在显着的品种差异,且其表达水平与年龄显着相关,这将导致相同兽药对不同年龄段和不同品种猪的疗效和毒副作用差异,因此,猪相关兽药的使用应根据猪的品种和年龄作出相应的调整。本研究获得的数据、以及利用本研究获得的大量PLE新亚进行水解兽药特性的后续研究结果,可为猪的临床合理用药提供必要的理论依据。
高文渊[9]2016年在《宏基因组来源酯酶基因的挖掘及其在非水相中催化性能的研究》文中研究说明自然环境中微生物分布广泛,种类繁多,蕴含着丰富的基因资源,但99%的微生物在目前实验条件下不易获得纯培养,宏基因组学不依赖微生物培养,提供了一个获取宝贵未培养微生物遗传资源的途径。酯酶作为一大类水解酶,广泛应用于不同的领域,具有很高的理论和实际应用价值,在生物催化方面展现出巨大的潜力。不同于脂肪酶,只有少数的酯酶应用于有机合成中。因而,利用丰富的微生物资源去开发新型且具有优良特性的酯酶,具有重要的现实意义和工业应用价值。基于以上目的,本研究致力于新型酯酶基因的开发,利用宏基因组学的方法对深海污泥中的酯酶基因进行筛选和分析,从中筛选得到了一个具有高活力和立体选择性的新型酯酶EST4,基于开发和实际应用的目的,将其成功用于在非水相中催化动力学拆分反应和用于合成工业上重要的乙酸酯类化合物,并通过固定化技术提高其催化稳定性。酯酶EST4显示的独特性质和良好的催化效果,证明是一个非常具有潜力的生物催化剂。具体研究结果如下：(1)本课题首先对深海污泥直接提取基因组用于构建Fosmid文库,库容量约40,000个克隆。基于功能活性的筛选方法,对该文库进行酯酶活性筛选,从中得到了34个阳性克隆表现出酯水解活性。通过对Fosmid质粒构建亚克隆文库的方法,最终获得5个新型的酯酶基因；将5个酯酶基因与NCBI数据库上已报道的脂类水解酶的氨基酸序列比对,其最高同源性在48%至79%之间。系统进化树分析表明,5个酯酶分别隶属于3个不同的酯酶/脂肪酶家族(Family IV, Family V和Family VIII)。这些新型的酯酶为后续的实验提供了材料。(2)对5个新型酯酶进行克隆并成功在大肠杆菌中实现可溶性表达。以叁丁酸甘油酯为底物进行活性筛选,得到水解活性最高的酯酶EST4。通过酶学性质研究表明：EST4偏好作用于短酰基链长(C2～C10)的对硝基苯酚酯,以对硝基苯基丁酸酯水解活性最高；最适水解温度为45℃,最适pH为8.0,水解比活为1389 U/mg；EST4在45℃的半衰期为46 h,具有较好的热稳定性；表面活性剂和金属离子均对EST4的活性无促进作用,是不依赖金属离子的酯酶；同时在有机溶剂中表现出良好的耐受性,尤其是在疏水性溶剂中,30℃处理12 h后仍然保持90%以上残余酶活。酶学特性研究为EST4的工业化应用提供了一定的基础,尤其是有机溶剂耐受性和热稳定性方面,对于非水相催化非常有利,为后续的催化反应奠定了基础。(3)光学纯的仲醇作为一类重要的手性中间体,是生产药物的重要手性砌块,可以转化为重要的生物活性分子,利用酯酶催化手性化合物拆分制备光学纯手中间体是一种有效途径。以α-苯乙醇为模式底物,通过优化酯酶EST4拆分反应的关键性因素,最终确定了在正己烷中,以丁酸乙烯酯为酰基供体,在30℃下,10mg/mL投酶量,底物与酰基供体摩尔比1：3时,EST4能发挥最高催化特性同时能获得大于99.9%ee底物醇且E>200。EST4在动力学拆分中表现出非常广的底物谱,基于转酯反应,在最优反应条件下,EST4能高效拆分α-苯乙醇衍生物、不同侧链长度的芳香醇和杂环醇(邻位取代α-苯乙醇衍生物除外),底物ee值大于99.9%,一半以上底物E值大于200。此外,为考察工业应用潜力,在高底物浓度下利用EST4进行拆分反应,EST4表现出高底物浓度耐受性,浓度至1M时,仍然能获得大于99%ee的手性醇同时转化率接近理论转化率50%。酯酶EST4表现出对仲醇的高活性和高对映选择性,使其成为工业化生产手性中间体的潜在用酶。(4)乙酸酯类化合物作为重要的香精香料分子,具有典型的水果香味和高挥发性,被广泛应用于食品和化妆品行业。以EST4的冻干细胞作为全细胞催化剂,用于催化乙酸酯类化合物的合成反应,其最优条件为：以log P 3.5的正己烷为反应介质,乙酸乙烯酯为酰基供体,底物摩尔比为1：2,在40℃下,反应90 min,即可将100 mM肉桂醇100%转化完全；同时,EST4对肉桂醇底物具有良好的耐受性,在2.5M(335g/L)浓度下依然能保持高催化活性,且反应12h内转化率大于98%,有效缓解生产过程中出现的底物产物抑制现象；除肉桂醇外,EST4对其他类型的醇同样能耐受较高的浓度,对2.0 M香茅醇和3.0 M异戊醇反应12h后的转化率可达97%以上。底物谱研究发现,EST4对不同结构类型的伯醇、仲醇具有较高的转酯活性,是一个非常适合转酯反应的广谱底物适应性酯酶,具有广泛的应用性。(5)在酯酶EST4共价固定化研究方面,首先通过硫酸铵沉淀的方法对EST4粗酶液进行纯化和回收并对其浓度进行优化,最终确定50%(w/v)的硫酸铵浓度,酶活收率高于98%；选取不同类型的氨基和环氧基载体,以酶活和固定化效率为筛选标准,筛选得到了最佳氨基载体NH；通过单因素优化固定化条件,确定了氨基载体NH固定化EST4的最佳条件：100 mM pH8.0磷酸盐缓冲液,在20℃ 200 rpm下,每克载体20 mg的蛋白量固定3 h。以肉桂醇的转酯反应为研究对象,对固定化酶的操作稳定性进行研究,结果表明,固定化酶在连续反应11个批次后,仍然保持90%以上的残余酶活,提高了其在生物催化过程的稳定性,有望在生物合成和有机合成领域得到广泛的应用。
王博[10]2011年在《具有手性选择性酯酶/脂肪酶的筛选、催化特点及应用研究》文中认为手性是自然界最重要的属性之一,分子手性识别在生命活动中起着极为重要的作用。同一化合物的两个对映体之间不仅具有不同的光学和物理化学性质,而且它们具有不同的生物活性。获得手性化合物的传统方法之一是利用拆分试剂对外消旋底物进行拆分或者不对称水解。然而,使用化学拆分试剂对消旋化合物进行拆分需要耗用大量的手性拆分试剂,成本压力大且环境不友好。酶催化下的不对称合成及拆分反应具有环境友好,反应条件温和以及选择性好等特点。目前的手性化合物制备方法中,应用较多的主要是脂肪酶,但脂肪酶昂贵的价格限制了其规模化应用。长期以来,人们一直寻找用以替代脂肪酶的酯酶,在具有类似的催化能力和催化特性时,使用制备成本较低的酯酶替代脂肪酶使得低成本制备手性化合物更具可行性。本文重点研究,两类手性化合物(S)-3-羟基戊二酸单酯类化合物和手性1-苯乙醇类化合物的生物制备,手性酯酶/脂肪酶的筛选及催化特点。以其为主线,展开了下面六个方面的工作,具体为：(a)选择适合反应的生物酶催化剂,首先需要对酶进行筛选。利用已经建立的酶库,我们开发了一个基于真实底物的荧光高通量筛选方法。相对于目前的高通量筛选体系,该筛选体系具有可靠、精确和灵敏度高等优点。通过已建立的高通量筛选方法,我们筛选到了一种高活性和高选择性的水解酶(酯酶Escherichia coli BioH)。(b)将筛选得到的酯酶应用到仲醇类化合物的拆分中。该酶对仲醇类化合物具有非常好的手性选择性,水溶液中可以将一系列仲醇乙酸酯进行较好的拆分,ee值最高可达到98%。令我们感兴趣的是,该酯酶具备一些目前为止所发现酯酶所不具备的性质-非水溶剂中长时间保持活性及选择性。将该酶应用于有机相中的转酯化拆分苯乙醇类化合物中,得到的转酯化产物的ee值最高为>99%。(c)然后尝试由筛选得到的酯酶和实验室现有的7种酯酶和脂肪酶应用到手性戊二酸单酯类化合物的不对称合成中。结果显示只有CALB和Lipozym TLIM能够催化该反应。通过比较反应活性,固定化酶投料量大小及反应时间等因素,最后确定了CALB为该反应所使用的生物催化剂。为了减轻工作强度,我们采用了分子对接技术预测并指导反应,结果显示分子对接预测结果与实际反应结果较为接近。分子对接能较为准确的预测并指导该生物合成是否能进行,但是不能预测酶的底物构型选择性。(d)将酯酶和脂肪酶二者联合应用于手性醇的绿色,连续拆分中。该方法基于以下策略：将酶能催化转化的异构体完全转化为对应的化合物,可以将剩下的另一异构体的ee值保持在较高值,然后在CALB的催化作用下,有机溶剂中利用NH3作为脱酰试剂对转酯化产物进行氨解(脱酰)反应。实际试验中,未反应的醇的ee值可达到≥98%。经过再次的酶选择性催化,富手性的酯脱酰基得到ee值为≥99%的R构型手性醇,即使ee值低于90%的酯经过氨解脱酰基反应后,ee值也得到了大幅提高,可达到≥99%。实验中所使用的有机溶剂,酰基供体以及固定化酶都能重复利用。这种绿色脱酰基方法避免了使用缓冲溶液水解相应的酯而产生的大量废水和盐溶液,也避免了化学脱酰基过程中使用大量化学试剂对环境造成污染和异构体的消旋化。(e)根据本论文相关章节中酯酶和脂肪酶可催化的底物及反应类型—酯酶和脂肪酶不但能催化其所能接受的传统的底物及催化类型,还能够催化一些新的底物及反应类型,我们总结了本论文中涉及的部分酶催化的反应,对酶的模糊性催化性质进行了初步归纳和论证。最后,总结了研究底物多样性的前景及其对手性化合物的制备具有的积极意义。(f)根据本论文的实验数据以及部分文献中的报道数据,我们对酯酶和脂肪酶在底物手性选择性方面的区别进行了初步的探讨,从对酯酶和脂肪酶手性选择性的各种影响因素方面对酯酶和脂肪酶在手性选择性方面的区别进行了对比和总结,阐述了二者之间的区别及联系,并进行了总结。文中同时验证了文献中报道的E.coli BioH酶是一个类脂肪酶的酯酶(在底物的选择性方面比较接近酯酶,在催化环境方面具有优秀的非水溶剂催化活性,这比较接近与脂肪酶)的说法。
参考文献：
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[2]. 猪肝酯酶在甲醇酵母中的克隆与表达[J]. 程婕, 赵晓瑜. 中国生物工程杂志. 2005
[3]. 猪PLE1的功能性表达及其启动子的克隆和分析[D]. 李朋辉. 华中农业大学. 2014
[4]. 猪肝羧酸酯酶1基因的克隆和在原核细胞中的功能性表达[J]. 肖启玲, 李朋辉, 闫秉芳, 杨路, 王喜亮. 畜牧兽医学报. 2015
[5]. 成年猪与仔猪肝脏γ猪肝羧酸酯酶表达差异研究[D]. 王振豹. 华中农业大学. 2011
[6]. 猪肝羧酸酯酶主要亚型功能性表达及其酶活性比较研究[D]. 杨路. 华中农业大学. 2016
[7]. 南海沉积物中酯酶基因克隆表达及酶学性质研究[D]. 张好. 青岛大学. 2014
[8]. 通城猪与大白猪猪肝羧酸酯酶表达谱与品种差异研究[D]. 肖启玲. 华中农业大学. 2015
[9]. 宏基因组来源酯酶基因的挖掘及其在非水相中催化性能的研究[D]. 高文渊. 华东理工大学. 2016
[10]. 具有手性选择性酯酶/脂肪酶的筛选、催化特点及应用研究[D]. 王博. 浙江大学. 2011