花瞻[1]2004年在《复发肝细胞性肝癌相关基因的研究》文中认为原发性肝癌是世界排名第五恶性肿瘤，这其中90％以上是肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC的病死率高，在我国是恶性肿瘤的第二位致死原因。影响HCC疗效的主要障碍是复发。HCC术后肝内复发一般有两个来源，一是原先切除HCC的播散，二是肝脏另外生长出一个新的癌灶。前者是原先切除肝癌的播散，属于转移性质，后者是肝脏另外生长出一个新的肝癌病灶，属于肝癌的多中心发生。近年分子生物学的研究表明HCC是一种演进性的多基因异常疾病，是涉及到多种因素多个步骤的病理过程。微阵列技术可以在基因表达水平区分、鉴定肿瘤的分子标记和探索肿瘤发生发展过程中基因表达调控网络机制，为进行分子诊断和发现新的治疗靶点提供线索。目前该技术已用于HCC基因表达谱的研究，并取得了一些进展，但在整体水平专门针对HCC治疗后复发的研究尚少见。 我们应用含有15843个克隆(其中4892个未知)的cDNA微阵列分析发现有887个基因在复发HCC与配对非癌肝组织间存在2倍以上差异，存在3倍以上差异的基因有219个，这其中有109个上调，110个下调。这其中已知基因为123个(上调表达59条，下调表达64条)。这些已知基因主要为与代谢、分化／发育、信号传导和细胞周期等相关的基因。这提示治疗后复发可能与代谢相关基因异常致化疗耐药有关，复发也可能与HCC细胞与相邻肝脏基质微环境之间的相互影响、相互作用有关。与生物信息学技术结合，我们在整体水平对HCC复发时基因改变的时空发生顺序有了一些认识。另外，我们也得到了许多显着差异表达的代表新基因的表达序列标签。进一步对这些未知基因片断的研究可能为HCC复发的诊治提供有益的线索和帮助。 我们从3倍以上差异表达基因中进一步筛选出两个基因OPN和S100A6，应用免疫组织化学法对二者在51例HCC、33例转移性肝癌(其中12例来自大肠癌转移)和10例正常肝组织中的表达水平进行研究，发现HCC中OPN过度表达率和S100A6表达率分别为51.0％和31.4％。OPN的过度表达与HCC的不良分化(P
苗雄鹰[2]2013年在《循环AFPmRNA及α-干扰素对巨大肝癌（≥10cm）术后复发转移预测及影响的临床研究》文中提出肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。由于肝癌早期症状隐匿,缺乏特异性,并且绝大多数乙肝病毒携带者未能进行常规的肝癌筛查,大多数患者就诊时均已到中晚期,因此大肝癌(直径≥5cm)和巨大肝癌(直径≥10cm)在我国大陆地区很常见。近年来,随着肝胆外科手术切除技术的提高和肝外科理论知识的积累、肝脏影像学技术的进步、肝脏围手术期管理理论和经验的丰富以及治疗观念上的更新,大肝癌及巨大肝癌的手术切除效果获得了大大的改善,但与小肝癌相比,大肝癌外科治疗的远期疗效仍有待提高,围手术期死亡率、术后并发症发生率仍有待进一步下降。肝癌术后5年累计复发率高达35%-75%,仍为主要死亡原因。肝癌术后复发分为近期复发(术后≤2年)及远期复发(>2年)。一般认为,肝癌术后近期复发归咎于被切除肿瘤的残存肿瘤细胞,当这些残存肿瘤细胞发展到常规影像学检查技术可以发现的程度,要么由于复发病灶太大,要么已合并出现远处转移,致使积极的治疗常常无法施行或收效甚微。因此,肝癌术后早期发现这些残存的肿瘤细胞将有助于规划术后进一步的治疗策略。肿瘤细胞可以自发脱落或人为挤压导致脱落后进入全身循环成为肝内或远处转移灶。应用聚合酶链式反应(PCR)鉴定肿瘤特异性基因转录产物(mRNA/循环DNA)这种分子生物学方法,可以敏感地发现少许血样标本中存在的脱落肿瘤细胞(Isolated tumor cell, ITC)。越来越多的研究表明,ITC可以被看做是肿瘤术后预后的一个指标。α-甲胎球蛋白信使RNA (AFPmRNA)通常被认为是肝脏特异及肿瘤特异的标志物。临床研究表明,外周血AFPmRNA与肝细胞肝癌血源性播散有关,对接受手术治疗、无水酒精注射或肝动脉化疗栓塞的肝癌患者有预后价值。然而,据我们所知,目前尚无文献报告大肝癌切除术后外周血AFPmRNA的变化情况及其与肝癌术后预后的关系,因此我们进行本研究以探求大肝癌切除术后监测外周血AFPmRNA能否预测术后肝癌的复发及转移。肝癌肿瘤直径超过10cm表明肿瘤已处于进展期,形成子灶或侵犯血管的可能性大大增加,导致术后肝内复发/转移和肝外复发/转移的可能性亦大大增加。据报道巨大肝癌(直径≥10cm)术后第一年复发率高达35%-72%,高复发率导致此类患者预后差。因此,抑制复发,特别是早期复发,是改善巨大肝癌患者术后预后的关键因素之一。迄今为止,已有诸多研究报告肝癌术后辅助治疗可以减少复发。这些辅助治疗包括：经皮肝动脉化疗栓塞、化疗、非循环性环甲酸治疗、免疫治疗及干扰素治疗。干扰素治疗作为肝癌术后辅助治疗是近十几年来兴起的热点。干扰素是一类细胞因子,拥有一系列的生物学特性,既有抗肿瘤特性,如抗增殖及抗血管形成,也有抗病毒等特性一些作者报告,α-干扰素可明显降低术后早期复发,但也有与之相矛盾的临床研究报告。此外,一些回顾性及样本量较少的前瞻性研究发现,α-干扰素可以提高患者总生存率,而与此相反的临床研究结果亦可见于文献。尚未见文献报道术后α-干扰素治疗是否影响巨大肝癌患者术后复发及生存。方法1.巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测外周血AFPmRNA实验分为大肝癌(≥10cm)手术切除组(n=178例)和对照组(n=60,其中20名健康志愿者及40名非肝癌住院病人)。分别于术前及术后两周从各实验对象抽取外周静脉血5ml,用巢式RT-PCR检测AFPmRNA;2.统计所有178例巨大肝癌病人临床病理资料,对这些病人进行追踪随访,及时发现复发灶并记录患者生存情况；3.用统计学方法进行分析,以确定AFPmRNA能否预测巨大肝癌患者早期复发；4.α-干扰素用于AFPmRNA(+)患者术后治疗；60例术后AFPmRNA(+)巨大肝癌(≥10cm)病人术后随机分为治疗组(n=30)和对照组(n=30)。白术后第5-6周开始,用α-干扰素对实验组病人进行肌肉注射,初始剂量为300万U/次,2次/周,持续2周,随后改为500万U/次,3次/周,持续18个月；5.用统计学方法进行分析,以确定α-干扰素是否影响巨大肝癌患者术后复发及总生存率。结果1.用巢式逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)可以检测到外周血肝癌特异性AFPmRNA:2.对照组术前及术后外周血AFPmRNA均为阴性；3.实验组术前44.9%(80/178)患者外周血AFPmRNA为阳性,术后38.8%(69/178)为阳性；4.37例术后外周血AFPmRNA(+)患者术后1、2、3年无瘤生存率分别为64.6%、33.9%、0%；92例术后外周血AFPmRNA(-)患者术后1、2、3年无瘤生存率分别为80.0%、62.1%、29.1%,二者比较有明显统计学差异(P=0.001)；5.统计学分析表明,外周血AFPmRNA是无瘤生存率的独立影响因子；6.α-干扰素治疗组1、2、3年无瘤生存率分别为50.0%、33.3%、28.3%,较对照组的35.3%、14.1%、0%高,但两组之间无统计学意义；7.α-干扰素治疗组1、2、3年总生存率分别为82.5%、71.2%、49.8%,对照组为53.3%、33.8%、22.6%,两组之间有显着性统计学差异；8.统计学分析表明α-干扰素是总生存率的独立预后因素；9.统计学分析表明肝硬化、肿瘤数目、血管侵犯均是巨大肝癌患者术后预后的独立影响因素。结论1.能在巨大肝癌病人术前及术后外周血中检测到AFPmRNA:2.巨大肝癌术后外周血AFPmRNA可以作为预测肝癌早期复发的指标之一；3.术后α-干扰素治疗可以提高1、2、3年无瘤生存率,但无显着统计学意义；4.术后α-干扰素可以显着提高1、2、3年总生存率；5.肝硬化、肿瘤数目、血管侵犯均是巨大肝癌术后预后的独立影响因素。
陈军[3]2008年在《肝细胞癌中P14~（ARF）基因甲基化与P14~（ARF）、P53蛋白表达相关性的研究》文中研究说明目的:通过检测肝细胞癌及癌旁组织、非癌肝组织中抑癌基因P14~(ARF)启动子甲基化状态以及其蛋白表达和P53蛋白表达情况,探讨它们与肝癌临床病理特征的关联,并分析P14~(ARF)基因甲基化与其蛋白表达和P53蛋白表达的相关性,探讨在肝癌发生发展过程中P14~(ARF)基因可能的作用机制。方法:通过甲基化特异性PCR(MSP)方法检测50例肝细胞癌组织、癌旁组织和18例非癌肝组织中P14~(ARF)基因启动子甲基化状态,并用免疫组织化学(IHC)法分别检测这50例肝细胞性肝癌组织、癌旁组织和18例非癌肝组织中P14~(ARF)以及P53蛋白的表达情况。结果:癌组织及癌旁组织中P14~(ARF)基因启动子甲基化阳性率分别为28.0%(14/50)和4.0%(2/50),两者阳性率比较差异显着(P＜0.05),非癌肝组织中未见阳性表达。P14~(ARF)蛋白在癌组织(66.0%,33/50)和癌旁组织(94.0%,47/50)中表达亦有显着性差异(P＜0.05);在癌旁及非癌肝组织(100%,18/18)中的表达无明显差别(P＞0.05)。P53蛋白在癌及癌旁组织的表达阳性率分别为54.0%(27/50),14.0%(7/50),两组间差异有统计学意义(P＜0.05);癌旁及非癌肝组织(11.11%,2/18)组织中的表达无明显差别(P＞0.05)。P14~(ARF)基因启动子甲基化和蛋白表达与临床分期、门脉癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤大小、肿瘤个数及血清AFP值无关(P＞0.05),而在肿瘤分化程度高低上P14~(ARF)蛋白表达阳性率有显着性差异(P＜0.05),P14~(ARF)基因启动子甲基化则无差异(P＞0.05)。P14~(ARF)基因启动子甲基化与蛋白表达呈负相关(γ=-0.493,P=0.001)。P53蛋白表达在有无门脉癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤分化程度高低分组间比较有显着性差异(P＜0.05),在临床分期、肿瘤大小、肿瘤个数及血清AFP值等分组间没有显着性差异(P＞0.05)。P14~(ARF)基因启动子甲基化和P53蛋白表达在肝癌组织中呈显着正相关(γ=0.307,P=0.030),P14~(ARF)和P53蛋白表达在肝癌组织中表达呈显着负相关(γ=-0.324,P=0.022)。结论:启动子区甲基化是P14~(ARF)基因失活的重要机制。P14~(ARF)启动子区异常甲基化可能参与了肝癌的发生发展,P14~(ARF)蛋白失活与突变型P53蛋白的高表达在肝细胞癌的发生及进展中起着重要作用。
刘卫仁[4]2014年在《免疫微环境及代谢在肝细胞癌侵袭与转移中的作用研究》文中研究表明肝癌是影响人类健康的常见病和多发病。肝癌的复发转移是影响肝癌病人生存率的重要因素,由于肝内的卫星灶或多中心起源的病灶导致的复发,肝细胞肝癌的术后的5年复发率高达61.5%。要深入的研究肿瘤,在研究肿瘤细胞本身的同时,肿瘤细胞所处的“肿瘤微环境”也不容忽视。肿瘤微环境在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色。肿瘤微环境中癌细胞与间质细胞在不同过程中共演进。间质细胞可以影响癌细胞从发生到转移的全过程,对肿瘤起增强或抑制作用;肿瘤可导致间质理化性质、成分、细胞因子等发生改变,形成一个促进肿瘤生长的肿瘤微环境。肿瘤细胞也主要是通过糖酵解来供应所需的能量,这个效应即为“Warburg效应。葡萄糖的摄取增加与大量的癌基因激活(如RAS、MYC)以及抑癌基因突变有关,这些改变与肿瘤细胞的增殖、避免细胞增殖抑制剂的抑制剂凋亡减少有关。因此,研究肿瘤微环境和肿瘤代谢促进肝癌侵袭转移的分子机制有重要意义。由正常组织来源的肌成纤维细胞的招募可以促进肿瘤的演进,包括促进肿瘤增殖、血管形成、侵袭转移等。癌相关成纤维细胞与肿瘤细胞的“交叉对话”在多种肿瘤中研究较为深入。癌相关成纤维细胞可分泌多种细胞因子来促进肿瘤侵袭转移。同时,肿瘤细胞分泌TGF-β、PDGF等细胞因子促进静止期的肝星状细胞向癌相关成纤维细胞分化。最近的研究表明肿瘤细胞分泌过氧化氢促使CAFs发生自噬、线粒体吞噬及无氧糖酵解。这种“寄生”的能量代谢关系使得间质作为肿瘤细胞的“能量工厂”,癌相关成纤维细胞分泌大量的重新利用高能量代谢产物(如乳酸、谷氨酰胺)来促进肿瘤细胞的有氧氧化磷酸化。我们研究发现活化的肝星状细胞LX-2和肝癌细胞共培养后,LX-2发生内部能量代谢重排来促进肝癌恶性行为,肝癌细胞分泌TIM-1等免疫分子来趋化免疫细胞来促进肝癌侵袭转移,TIM-1可能在肝星状细胞和肝癌细胞“免疫交叉对话”中发挥重要作用。TIM-1分子表达于Th2细胞,在哮喘和缺血再灌注损伤有重要作用。在肿瘤的研究中,TIM-1在结直肠癌中高表达,与预后呈负相关,过表达TIM-1降低肿瘤细胞粘附能力。TIM-1通过IL-6/STAT3通路来促进透明肾细胞癌恶性行为并与透明肾细胞癌患者呈负相关。我们的研究发现TIM-1在高转移潜能细胞系高表达并在体内体外促进肝癌侵袭转移并与肝癌患者预后呈负相关。可能与TIM-1招募适应性免疫相关的免疫细胞有关。PKM2是肿瘤Warburg效应中的关键分子,已有报道PKM2在人类多种肿瘤中表达增高。高表达PKM2的肿瘤细胞相比于高表达PKM1的肿瘤细胞体外、体内增殖活性增高。PKM2是决定代谢通路的关键酶。同时,PKM2可与HIF-1P结合并在转录水平激活SLC2A1、LDHA、PDK1。我们的研究表明PKM2不仅在肿瘤细胞水平促进肿瘤恶性行为,同时PKM2可通过下游趋化因子招募MDSC及巨噬细胞来促进肝癌侵袭转移及PKM2也与肝癌患者预后呈负相关。髓系衍生抑制性细胞(MDSCs)是一群具有异质性的未成熟的骨髓源性细胞,在病理状态下增殖并具有抑制免疫应答的能力。MDSCs在前炎症因子的作用下积聚,通过多重机制抑制抗肿瘤免疫,促进肿瘤血管新生和转移。我们的研究发现HCC患者与正常人和FNH患者相比,外周血及原位MDSCs匕例高。免疫微环境、代谢以及肿瘤侵袭转移叁者之间的复杂关系在肿瘤的研究日益受到重视。肿瘤微环境通过代谢调节促使肿瘤相关的DC细胞失活。在肿瘤相关的T细胞中敲减Ppp2rd可以抑制T细胞的凋亡、促进T细胞增殖以及细胞因子分泌。我们的研究发现微环境中肿瘤细胞分泌的TIM-1免疫分子可以促进肿瘤细胞增殖侵袭转移的同时,也可能可以通过分泌趋化因子招募适应性免疫细胞来促进肿瘤发生免疫逃逸。肿瘤代谢的关键分子PKM2在促进肿瘤细胞恶性行为的同时,也可以重塑免疫微环境,现有的研究发现PKM2可以促进肿瘤微环境中MDSC细胞和TAM细胞的浸润。本研究一定程度上为日后的肿瘤综合治疗提供了理论基础。结论从全文研究中可以得出以下结论：1.癌相关成纤维细胞与肝癌细胞共培养后的细胞上清促进肝癌细胞迁移能力和管形成能力。2.癌相关成纤维细胞与肝癌细胞共培养后LX-2细胞发生自噬及能量重排来促进肝癌恶性行为,肝癌细胞侵袭转移能力增强。TIM-1分子可能在肝星状细胞和肝癌细胞“交叉对话”中发挥重要作用。3.TIM-1表达程度与肝癌细胞系的侵袭转移潜能明显相关,TIM-1体外体内实验中能够促肿瘤细胞增殖和侵袭转移。4.TIM-1可能通过促CCL2、CCL5、CCL21分泌趋化适应性免疫细胞来促进肿瘤瘤体生长和发生肺转移。5.TIM-1高表达与肝细胞肝癌的侵袭、转移及不良预后相关。6.PKM2表达程度与肝癌细胞系的侵袭转移潜能明显相关,PKM2能够促肿瘤细胞增殖、侵袭转移、自噬发生、血管形成。7.PKM2可能通过促使CCL8、CCL2、CXCL1、MIF mRNA表达增高、趋化MDSC和巨噬细胞来促进肿瘤瘤体生长和发生肺转移。8.PKM2可预测肝癌患者的早期复发与不良预后。9.HCC患者与正常人和FNH患者相比,外周血及原位MDSCs比例高。晚期HCC的患者腹水中也成功分离鉴定出MDSCs。研究展望1.本研究初步阐明了肿瘤炎性微环境及代谢在肿瘤侵袭转移中的作用,深入的机制尚需进一步的深入研究。2.明确癌相关成纤维细胞通过自噬来促进肝癌细胞的恶性行为。3.通过体外免疫学实验研究TIM-1对于肝癌微环境中适应性免疫细胞的功能影响。以及TIM-1与CCL2、CCL5和CCL21的关系。4.TIM-1对于肝癌细胞本身自噬水平的影响。5.PKM2对于肝癌免疫微环境适应性免疫细胞的影响6.PKM2与下游趋化因子CCL8、CCL2、CXCL1、MIF的直接关系验证。7. MDSC内部基因的改变与修饰与其功能研究,以利于深入的研究MDSC在肝癌中的功能。
于杰[5]2013年在《ZNF545表观遗传改变对肝癌热消融后复发的预测价值及微波和射频治疗肝癌的对照研究》文中研究指明目的：(1)研究ZNF545基因在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)中的表观遗传学改变及对其表达的调控探讨ZNF545在HCC发生中的作用及作用机制。在此基础上,阐明ZNF545表观遗传改变对早期HCC超声引导下热消融治疗后转移复发的预测价值及其对HCC生存预后的影响,以期获得HCC诊断和预后的表观遗传学标志物。(2)采用随机对照研究(Randomized controlled trial, RCT)观察经皮水冷微波消融(Microwave ablation, MWA)与经皮水冷双极射频消融(Radiofrequency ablation, RFA)治疗早期肝细胞癌的中期疗效,为肝癌的临床微创热消融治疗方式选择提供进一步的理论及临床依据。(3)采用前瞻性队列对照研究,观察比较经皮水冷MWA及RFA与手术切除治疗早期肝细胞癌的中期疗效,为肝癌的治疗手段的选择提供理论依据。材料和方法：1、表观遗传研究：应用半定量RT-PCR方法在7株肝癌细胞系及一株永生化肝细胞系(HepG2、SMMC7721、SUN449、HBXF34、PLC-PRF-5、SK-Hep1、 BEL7402及LO2)中检测甲基转移酶抑制齐5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dc)处理前后ZNF545在mRNA的表达水平；应用甲基化特异性PCR检测7株肝癌细胞系、一株永生化肝细胞系、8例正常肝组织、10例肝硬化组织和101例HCC组织标本中ZNF545的甲基化情况；应用免疫组织化学染色检测20例具有石蜡包块的肝癌组织和配对癌旁组织中ZNF545的表达水平；克隆形成实验分析ZNF545对细胞生长的影响；流式细胞技术检测ZNF545对细胞凋亡的影响；利用MTT检测ZNF545对细胞增殖的影响；联合患者年龄、性别、肝功Child分级、甲胎蛋白、肿瘤数目、大小、病理分级、病毒含量、肝炎类型、消融后局部复发、肝内转移、生存等进行多因素分析ZNF545的甲基化情况与早期HCC热消融治疗后转移复发的相关性及其对HCC生存预后的影响。2、临床对照研究：(1)2008年10月至2013年1月满足以下入组标准在我院行超声引导下经皮消融治疗的290例HCC患者共364个病灶,按照计算机产生序号随机分为两组,其中MWA组146例192个病灶,RFA组144例172个病灶,入组患者满足以下标准：a)术前评估肝脏功能：Child-Pugh A或B级,凝血酶原时间<25秒,凝血酶原活动度>40%；b)单个结节直径≤5cm,结节数目≤3个；c)术前影像学检查及术中探查判断无明确的静脉、胆管癌栓和肝外转移；d)病理证实为HCC；e)术前无抗癌处理；f)自愿受试,术前均签署知情同意书。(2)满足以上入组标准2008年8月至2013年1月在我院行超声引导下消融治疗的290例HCC患者共364个病灶设为消融组,同期进行手术切除306例患者339个病灶设为手术组。分别观察比较两组治疗时间、术后住院日、住院费用、技术有效率(Technique effectiveness rate, TER)、局部肿瘤进展率(Local tumor progression, LTP)、肝内外转移率、并发症发生率和中期生存率。结果：1、表观遗传研究：MSP检测ZHF545基因在细胞系结果显示,HepG2、 SMMC7721、SUN449、PRF-PLC-5、 Sk-hep1及L02完全甲基化状态,Be17402呈部分甲基化状态及HBXF344呈未甲基化状态；经RT-PCR方法检测ZNF545基因mRNA水平上在肝细胞系Be17402及HBXF344中,经甲基转移酶抑制5-aza-dc处理前后无变化,其余肝癌细胞系经5-aza-dc处理后均恢复表达。恢复HepG2、SUN449中ZNF545的表达可抑制克隆形成和细胞增殖,促进细胞凋亡。在101例HCC组织中,ZNF545甲基化率为56.4%(57/101),在正常肝组织和肝硬化组织中均无甲基化改变提示ZNF545是一个潜在的HCC诊断的生物学标志物。单因素分析结果显示ZNF545甲基化阳性组>65岁老年患者居多(P<0.05)，多因素分析结果表明ZNF545甲基化虽然与12个临床因素均无统计学相关(P>0.05)，但ZNF545甲基化表达阳性组肝内转移率和死亡率均呈明显增高趋势。2、临床对照研究：随访期为2～51.8月(中位时间19.8月)。(1)超声引导下经皮水冷MWA较水冷RFA治疗HCC需要更少的消融针数、消融次数、穿刺针数、消融时间和治疗费用(P<0.05)，两组具有相似的TER、LTP、肝内外转移率、并发症发生率和中期生存率(P>0.05)，但MWA在临近血管、胃肠、膈肌处肿瘤和3～5cm肿瘤消融中具有略好的局部肿瘤控制能力。(2)超声引导下经皮水冷热消融与手术切除治疗HCC相比，TER、LTP、中期生存率比较无显着差异(P>0.05)，但手术治疗在3～5cm肿瘤中体现了更好的局部控制能力。消融组严重并发症的数量、种类和严重程度优于手术，需要更短的住院时间和更少的治疗费用(P<0.05)，体现了经皮消融治疗的微创性。结论：1、表观遗传研究：ZNF545基因甲基化是肝癌的频发事件，ZNF545基因的表达受启动子区甲基化的调控，并抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡。ZNF545基因的甲基化具有促进早期肝癌消融后肝内转移和死亡增加趋势，提示ZNF545甲基化是一个潜在的肝癌诊断及预后的指标，尚需大样本长随访病例以进一步明确ZNF545在不同分期肝癌热消融后的预测价值。上述基础及临床研究为揭示肝癌热消融联合表观遗传治疗奠定了理论基础。2、临床对照研究：在早期HCC的治疗中，(1)经皮水冷MWA和RAF取得了相似的中期疗效，但MWA在邻近重要结构的肿瘤和较大肿瘤消融中在局部肿瘤控制能力方面略占优势，MWA较RFA需要更少的治疗时间、次数和费用，减少了创伤，节约了医疗资源。(2)经皮水冷热消融治疗与手术切除取得了相似的中期生存疗效，虽然手术治疗对于较大肿瘤局部控制能力优于消融治疗，但消融体现了其微创、廉价、可重复治疗的优势。
谭运华[6]2017年在《多电极转换射频消融系统治疗肝细胞癌临床和基础研究》文中指出研究背景肝细胞癌(HCC)是世界是第六最常见的恶性肿瘤,也是第叁最致命的癌症,全球每年新发HCC病例为50万至100万。85%的病例发生在发展中国家,高发地区是东亚和东南亚、中非和西非。特别是在中国,肝细胞癌的发生率占全世界55%,HBV感染是东亚地区的主要危险因素。多年来,部分肝切除术和肝移植被认为是HCC主要的治疗方法。然而,大多数患者因为肿瘤解剖位置、肿瘤大小、肿瘤数目、肝脏残留量不足或肝外转移不能手术治疗。肝移植被认为是HCC最好的治疗选择,因为它移除了肿瘤病灶和潜在患病的肝脏,但是缺乏肝源限制了肝移植的发展。只有10%?20%的肝细胞癌是可手术治疗的。各种局部消融技术已经越来越多地应用于替代性HCC传统治疗方案。射频消融(RFA)近年来已经成为最广泛使用的局部热消融方法。射频消融(RFA)是物理热消融技术,通过其有源电极将能量直接导入肿瘤组织。电流在闭环回路中转化为热量,并且由电极针尖处的交流电在细胞内震动引起的分子和离子相互摩擦产生高热,大约60℃以上的温度可以导致肿瘤及肿瘤周围组织凝固坏死。影响RFA是否成功的一个重要因素是肿瘤组织完全消融和产生足够消融边界的能力。理论上需要在肿瘤周围产生0.5cm至1cm的消融安全边界。安全边界能够确保肿瘤的周边部分以及位于其附近的微小病灶完全毁损。在过去十年,射频消融已经成为治疗小肝癌的最具潜力的方法之一,是目前针对小肝癌(<3cm)非手术的根治性治疗的主要方法。大量数据表示RFA有很高的安全性和有效性,死亡率为0%至1.2%,并发症发生率为3%至7%。在肝脏肿瘤治疗领域,RFA具有其技术易用性、安全性、令人满意的局部肿瘤控制和可重复性质,热消融封闭效应使肿瘤周围血管凝固,减少肿瘤细胞转移途径,也可避免部分肝切除手术过程中对肝脏肿瘤的挤压,导致肝癌细胞的扩散;RFA作为肝脏肿瘤一线治愈性技术已经得到了推广。尽管对于小肝癌是成功的,但是对于直径3cm到5cm的肝细胞癌,完全消融率报告范围从61.3%-82.5%,这些结果可能过时。由于射频消融技术和器械的发展,如使用集群电极和改进的电机,可以获得更高的功率,多电极转换射频消融(MESS-RFA)利用各种方法来创造一个更大的消融区,包括使用多个电极增加消融体积;内部冷凝电极能够提高电离子利用效率;多个电极同时启动产生协同作用提供更高能量。针对直径3cm到5cm的肝细胞癌可以有更好的消融结果。因此,射频消融相关治疗策略需要我们作进一步的更新。然而,射频消融后的肝细胞癌复发仍然是一个显着的问题。我们将经射频消融后的肝内复发模式分为局部肿瘤进展(LTP)和肝内远处复发(IDR),每种类型的复发具有不同的发病机制,并且被认为独立发生。通常,LTP被认为与在显微镜下超出消融边缘扩散的残余肿瘤细胞相关;IDR的发病机制被认为是原发性肝癌肝内转移的结果,或者是由于HCC的多中心来源。理解复发的机制、模式和风险因素对于射频消融的发展、临床应用以及肝细胞癌的预后具有非常重要的意义。研究(一)我们前瞻性多中心研究了早期HCC射频消融后早期复发的相关风险因素以及疗效分析;通过研究(二)验证了多电极转换RFA系统治疗米兰标准HCC的长期生存疗效;在研究(叁)扩大了RFA的治疗范围,进行了多电极转换RFA在中型HCC中的疗效分析;并在研究(四)建立RFA后过渡区的体外热休克细胞模型,验证HCC射频消融后复发的相关生物细胞学机制。研究一经皮多电极转换射频消融治疗早期肝癌早期复发风险因素的多中心前瞻性研究*目的探讨多电极转换射频消融治疗早期肝细胞癌的疗效,并评估射频消融后肝细胞癌的肝内复发的模式和风险因素材料和方法按入组标准多中心前瞻性纳入139例早期肝细胞癌患者接受射频消融作为一线治疗方案,我们评估了局部肿瘤进展(LTP)和肝内远端复发(IDR)的进展率和累积无复发生存、无IDR生存和整体生存发生率。以及相关风险因素分析。结果2014年1月至2014年12月共139例患者纳入研究(平均年龄54岁,范围,19-79岁),平均随访时间为29个月(范围,7-36个月)。肿瘤完全消融率为98.9%,总复发率,LTP和IDR的发生率分别为35.9%、5.0%和31.6%。累计无病生存率分别1年为26.6%、4.0%、24.1%,2年为34.6%、4.9%、31.7%。在多因素分析中,肿瘤大小是LTP的唯一重要的危险因素;ALP和肿瘤数量是IDR的独立危险因素;AFP和复发间隔时间为总生存期的危险因素。结论MESS-RFA是早期肝细胞癌局部控制的有效治疗方法,具有高ALP水平的多个肿瘤的早期肝细胞癌具有较高的复发率,主要是肝内远处复发模式;具有高AFP水平和较短的首次复发间隔时间的早期肝细胞癌具有较差的预后,应该更积极地治疗。研究二多电极转换射频消融治疗米兰标准肝细胞癌的大样本回顾性研究目的评估多电极转换射频消融治疗516例符合米兰标准肝细胞癌连续患者的长期结果。方法我们对2006年12月至2011年6月的516例患者进行了522次多电极转换射频消融程序。总共956个符合米兰标准肝细胞肿瘤,平均直径2.64cm(范围,0.9-4.6cm)。在术后第一年每2个月和以后每4个月测量超声造影和血清甲胎蛋白。每6个月进行增强CT扫描。使用Kaplan-Meier方法估计生存率。随访截止时间为60个月。使用Cox比例风险模型进行多变量分析。结果对于956个肝细胞癌肿瘤,多电极转换射频消融系统的完全消融率为98.83%(510/516)。在34个月(IQR,23-52个月)的中位随访期间,171例患者死亡,4例失访(15,30,38和42个月)。在1、3和5年,局部肿瘤进展的累积发生率分别为0.39%、4.96%和6.66%,1年、3年和5年总生存率分别为99.42%、83.97%和68.42%。肿瘤大小>30mm是预测局部肿瘤进展的唯一参数(P<0.0001)。与整体生存相关的风险因素包括凝血酶原时间>14s,血清AFP水平>200ng/m L,肿瘤邻接血管直径<5mm。并发症发生率为1.74%。结论多电极转换射频消融是一种安全有效的治疗肝细胞癌方法。这种方法能够为符合米兰标准HCC提供较高的无局部肿瘤进展生存期。研究叁多电极转换射频消融治疗中型肝细胞癌的回顾性研究目的回顾性研究评估使用多电极转换射频消融治疗中型肝细胞癌(3.0-5.0 cm)的安全性和有效性方法我们使用多电极转换射频消融系统对166名患者进行了总共168次射频消融。通过经皮多电极转换射频消融系统的多通道RF发生器和两个或叁个内部冷却电极在超声引导下对患者进行治疗。确定MESS-RFA的技术有效性。结果治疗166例肝细胞癌患者,MESS-RFA的完全消融率为98.79%(164/166)。每次手术的平均消融时间为12.33±3.01分钟,平均消融直径为5.79±0.61厘米。并发症发生率为2.41%。在随访期间(平均16.54个月),166名患者中有15名(9.03%)发生局部肿瘤进展,而在166名患者中有40名(24.09%)检测到新的HCC。多变量分析显示局部肿瘤进展的风险仅与血清AFP水平高于100ng/ml相关。结论多电极转换射频消融系统能够实现足够的消融体积,是安全有效的。这种方法在短期随访治疗中型肝细胞(3.0-5.0 cm)癌显示相对成效的治疗效果。研究四Mi R-103靶向调控PTEN在射频消融后过渡区中的作用及机制研究*背景原发性肝癌,特别是肝细胞癌(HCC),是世界是第六最常见的恶性肿瘤,也是第叁最致命的恶性癌症,而且发病率还在上升趋势。虽然手术切除是早期肝癌的治疗原则,而肝功能失代偿和门静脉高压限制了这个过程,肝移植可被认为最好的选择,但是捐献者的短缺限制了其发展。全球范围内,只有10-20%的患者有资格接受移植或手术切除。非手术治疗是目前可用于大多数HCC患者的唯一选择,各种局部消融技术已经越来越多地应用于替代性HCC传统治疗方案,射频消融(RFA)近年来已经成为最广泛使用的局部热消融方法。射频消融(RFA)是一种局部热消融技术,使用高频交流电流通过放置在组织内的电极诱导温度变化使肿瘤以及肿瘤周围组织产生凝固性坏死达到治疗目的。大量数据积累了RFA的安全性和有效性。近年来已经成为最广泛使用的局部热消融方法,在技术上具有方便性,安全性,微创性以及可重复性的优势。然而,射频消融后的复发仍然是一个显着的问题,肝细胞癌RFA后复发以肝内复发为主,本研究中心一项前瞻性研究中,2年内RFA后复发率为35.9%,已有研究表明,RFA后肿瘤复发与RFA后过渡区残癌细胞相关,而残癌细胞经历了热休克过程,了解RFA后过渡区的残癌细胞的生物学特征对解释RFA后高的复发发生和发展有重要的意义。PTEN,磷酸酶及张力蛋白同源的一个抑癌基因,广泛分布在各种肿瘤细胞中,具有蛋白和脂质双重磷酸酶活性,它帮助监测疾病复发和(或)进展,逐渐被接受为一个独立预后危险因子,它在细胞的生长、迁移、信号传递、凋亡等方面起着重要的调控作用。PTEN在癌细胞中表达缺失突变或者下调,可激活PI3K/Akt信号通路,从而引起肿瘤的发展和侵袭。mi RNA源自DNA转录而来,属于非编码RNA。mi RNA一般通过与目标m RNA结合,来抑制转录后的基因表达,在细胞周期、基因表达、发育时序等方面起着非常重要的调控作用,而且一种mi RNA往往可以调控很多类基因。已有研究表明非编码RNAs,比如mi RNAs在各种肿瘤发生发展中具有重要的作用。Yu等人发现mi R-103可以通过下调TIPM3来调节子宫内膜癌的侵袭和转移。以及Chen等人发现mi R-103的表达受低氧诱导因子HIF-1α的调控,靶向(AGO1)来促进肿瘤血管生成。所以mi R-103在RFA后过渡区低氧状态下经历了热休克过程的残癌细胞的机制需要深入的研究。目的为了进一步明确mi R-103对肝细胞癌射频消融后过渡区肝癌细胞的影响,探索mi R-103在肝癌射频消融后过渡区残癌细胞增殖和侵袭中的作用及可能的分子机制。方法转染筛选出的mi R-103过表达质粒至RFA后过渡区细胞中,通过MTT、细胞侵移实验检测RFA后过渡区细胞的增殖和侵袭能力。QPCR检测细胞或组织中mi R-103、Cyclin D1、p21、Bim、FASL、PTEN基因的表达水平,WB法进一步验证检测细胞中Cyclin D1、p21、Bim、FASL、MMP9、AKT、p-AKT、p Rb、p-p Rb蛋白表达水平。荧光素酶检测mi R-103与PTEN相互调控关系,同时检测PTEN-3’端突变体荧光值的变化水平。结果1、mi R-103在复发的肝细胞癌组织和肝细胞癌射频消融后过渡区热休克细胞肝癌细胞是上调的;2、mi R-103促进肝细胞癌射频消融后过渡区热休克残癌细胞的增殖和迁移;3、mi R-103靶向调控作用于PTEN基因;抑制PTEN表达并通过PI3K/Akt信号通路来影响细胞功能的改变。结论mi R-103上调抑制PTEN基因的表达并通过PI3K/Akt信号通路来促进RFA后过渡区肝癌细胞的增殖和迁移,这可能有助于我们理解RFA治疗后HCC复发的发病机理和为HCC的治疗提供新的思路。
张延强[7]2013年在《AFP-L3、MMP-9、TNF-α、ICAM-1、IL-18在原发性肝癌中应用价值的研究》文中指出目的探讨血清肿瘤标志物AFP-L3、MMP-9、TNF-α、ICAM-1、IL-18在原发性肝癌(PHC)中的应用价值。研究血清ICAM-1与肝癌组织中其含量是否有相关性。探索AFP-L3在血清中百分比含量与肝癌大小是否相关。方法分别采取PHC组(62例)、非肝癌组60例(由肝炎组30例,健康对照组30例组成)血清,采用ELIsa法或化学发光法检测MMP-9、ICAM-1、IL-18、ALP-L3、 TNF-a的含量。肝癌组织免疫组化染色检测ICAM-1的表达。结果(1)PHC组血清AFP-L3、ICAM-1、IL-18、TNF-a水平均明显高于健康对照组及肝炎组,差异有统计学意义(P<0.01); PHC组血清MMP-9水平高于健康对照组(P<0.01),PHC组血清MMP-9水平与肝炎组差别无统计学意义；肝癌组与非肝癌组IL-18血清水平并无差别(P>0.05)。(2)相关统计分析证明62例PHC组和30例健康对照组血清中的AFP-L3%、 MMP-9、TNF-α、ICAM-1、IL-18两两之间无相关性(P>0.05)；30例肝炎组血清中ICAM-1与IL-18(r=0.362, P=0.049)、ICAM-1与MMP-9(r=-0.412, P=0.024)之间有弱相关性。仅ICAM-1与肿瘤大小相关。(3)PHC患者血清AFP-L3、ICAM-1、MMP-9、TNF-α、IL-18阳性率分别为79.0%、82.3%、45.2%、62.9%、83.9%, AFP-L3、ICAM-1、MMP-9联合检测阳性率为96.8%。(4) ICAM-1的表达在有转移的肝癌组织中明显高于未转移的肝癌组织,差别有统计学意义(P<0.05); PHC患者血清中ICAM-1水平与其肝癌组织免疫组化ICAM-1积分具有高度相关性(r=0.781P<0.01)。结论联合检测AFP-L3、ICAM-1和MMP-9可以提高PHC的诊断阳性率,减少漏诊率；PHC患者血清中ICAM-1表达与其癌组织免疫组化ICAM-1积分成正相关,肝癌组织中ICAM-1积分与肝癌转移相关。AFP-L3在血清中百分比含量与肝癌大小不相关。
于明安[8]2011年在《微波消融联合过继免疫预防肝癌术后复发的实验及临床研究》文中研究指明研究背景：肝癌在我国肿瘤相关死亡率中仅次于肺癌,位居第二。对于局灶性肝癌无论手术还是微波、射频等热消融技术都可以达到灭活肿瘤的目的。但肝癌术后具有易复发性(5年复发率为50-70%),患者在根治术后远期生存率仍然较低。放疗、化疗等传统治疗对预防肝癌的术后复发没有确切疗效,而免疫治疗以其安全有效、特异性强和无毒副作用等优点,已成为当今基础和临床研究的热点。本研究是在总结前阶段研究的基础上,对免疫治疗程序设计、频次和治疗后评估指标进行改进,并观察患者治疗后免疫指标的变化和临床疗效。目的：1研究小鼠H22肝癌细胞悬液在现有临床应用的温控条件下(54℃、60℃)微波消融后细胞存活、凋亡和死亡的比例,并观察肿瘤相关抗原表达情况；2研究小鼠原位肝癌经微波消融后不同区域肿瘤相关抗原的表达情况；3研究微波消融联合免疫治疗对患者各项免疫指标和肝功指标的影响；4研究微波消融联合免疫治疗对肝癌患者术后复发、肝外转移及生存的影响。方法：体外实验：本实验按不同消融温控条件设为3组：对照组,消融温度54℃组和60℃组。消融后两小时流式检测悬液中细胞不同状态百分比,包括存活、凋亡和死亡；免疫荧光检测肿瘤相关抗原表达情况,包括CD147和热休克蛋白70(HSP70)。体内实验：开腹瘤块种植法制作昆明鼠原位肝癌模型8只。肿瘤长至直径约5mm时麻醉开腹,将微波针在直视下插入肿瘤中央,测温针放置在肿瘤边缘,瘤周温控60℃。消融后24小时脱颈处死小鼠,免疫荧光检测肿瘤不同区域(肿瘤中心区、肿瘤边缘区)肿瘤相关抗原(CD147、HSP70)表达情况。临床研究：1微波消融联合免疫治疗对患者术后免疫和肝功影响的研究：实验组为自愿接受微波消融联合过继免疫治疗的14例肝癌患者,对照组为同期仅行微波消融并自愿进行定期免疫和肝功指标检测的15例患者。两组患者在性别,年龄,肿瘤最大直径及分化程度等一般资料方面没有统计学差异,对两组患者术前及治疗后免疫指标和肝功指标进行比较；同时按自身配对原则对实验组14例患者术前和术后3个月外周血PBMC增殖情况进行比较。2微波消融联合免疫治疗肝细胞肝癌对患者肝内复发,肝外转移和患者生存影响的研究。实验组为自愿接受微波消融联合免疫治疗的14例患者,对照组为单纯进行微波消融治疗的42例患者。两组患者在性别,年龄,肿瘤最大直径及分化程度等一般资料方面没有统计学差异。免疫治疗组患者于微波消融后第9天、第1、3个月各做一个疗程免疫治疗,之后每隔3个月根据患者淋巴细胞绝对计数、T淋巴细胞亚群检测结果综合判断是否需要继续进行免疫治疗。比较两组间肝内复发率,肝外转移率和生存率。结果：体外研究：流式检测结果,消融后2小时54℃和60℃组细胞存活率低于对照组(P<0.05),凋亡和死亡率高于对照组(P<0.05)。60℃组细胞凋亡率高于54℃组(86.0% vs 61.0%)(P<0.05),存活和死亡率均低于54℃组(P<0.05)。免疫荧光检测结果：两个温控组中均可检测到肿瘤相关抗原(CD147、HSP70),其中60℃组两种抗原表达率均高于54℃组(HSP70：98.33% vs 46.22%,CD147：44.0% vs19.44%)(P<0.05),同一温控组HSP70表达率高于CD147(P<0.05)。体内实验：小鼠原位肝癌微波消融后24小时免疫荧光所见,在肿瘤边缘温控条件为60℃,有CD147和HSP70表达,主要在细胞膜表达,但胞浆和细胞间质部位均可见染色。在肿瘤中心区域温度达85℃时,该区域只有HSP70表达,且在细胞和周围间质区均可见荧光染色,CD147未见表达。临床研究：1微波消融联合免疫治疗对患者免疫和肝功指标影响的研究：实验组和对照组术前淋巴细胞计数、T淋巴细胞各亚群百分比没有统计学差异(P>0.05),治疗后6个月实验组淋巴细胞计数高于对照组(P<0.05)；实验组细胞毒性淋巴细胞亚群(CD3+/CD8+,CD8+/CD28+,NKT)高于对照组,抑制性T淋巴细胞亚群(CD8+/CD28-,T-reg)低于对照组(P<0.05),表明免疫治疗对患者免疫状态具有正向调节作用；实验组与对照组术前白蛋白和胆碱酯酶比较没有统计学差异(P>0.05),术后6个月实验组高于对照组(P<0.05)；实验组术前和术后3个月抽取45ml外周血分离PBMC计数没有统计学差异(P>0.05),术后3个月PBMC培养终点DC和CIK培养目标亚群比例(CD83+,CD86+,CD3+/CD8+)高于术前,且差异有统计学意义(P<0.05)。2微波消融联合免疫治疗肝细胞肝癌对患者肝内复发,肝外转移和患者生存影响的研究：实验组随访期内(4-26个月,中位随访时间19个月)患者有4例(28.6%)肝内复发,其中包括3例(21.4%)局部肿瘤进展和1例(7.1%)远处复发；对照组随访期内(4-26个月,中位随访时间16个月)有11例(26.2%)肝内复发和1例(2.3%)肝外转移,肝内复发包括2(4.8%)例局部肿瘤进展和9例(21.4%)远处复发。两组间在肝内复发率、局部肿瘤进展率、远处复发率、肝外转移瘤和无瘤生存时间比较无统计学差异(P>0.05)。随访期内对照组有4例患者死亡,实验组没有患者死亡,两组间生存率比较无统计学差异(P>0.05)。结论：实验研究表明,临床现有温控条件下H22细胞悬液微波消融后,大部分肿瘤细胞死亡或凋亡,并表达肿瘤相关抗原。小鼠原位肝癌微波消融后,肿瘤边缘温度为60℃时可见两种肿瘤相关抗原表达。临床研究表明,微波消融术后联合免疫治疗可以改善患者肝功能,提高淋巴细胞计数,优化T淋巴细胞各亚群比例,并可以提高细胞毒性淋巴细胞的增殖活性。由于实验组例数较少,尚未发现微波联合免疫治疗在预防肝癌术后复发和延长患者生存期等方面的优势,该研究还需进一步扩大病例数,延长随访时间。
王智[9]2016年在《1、肝细胞肝癌窄切缘术后调强放射治疗的作用 2、早期（T1-2NO）乳腺癌的临床表型亚组及基于深度学习的乳腺癌个体化预后模型》文中进行了进一步梳理第一部分邻近大血管的肝细胞肝癌窄切缘术后调强放射治疗的作用研究目的：本研究主要是针对邻近肝内大血管的肝细胞肝癌患者,评估窄切缘手术后调强放射治疗(Intensity-modulated radiotherapy, IMRT)的生存是否获益。材料与方法：181例肝细胞肝癌患者纳入分析,其中116例患者接受窄切缘手术(切缘<1.0 cm),65例患者接受根治性宽切缘手术(切缘≥1.0 cm)。窄切缘手术患者中的33例接受了术后IMRT (A组),83例患者未行术后放射治疗(B组)。宽切缘手术患者均未接受术后放射治疗(C组)。通过比较叁组患者的复发模式和预后来评估术后IMRT的作用。采用Kaplan-Meier法进行生存率分析和比较,采用卡方检验比较各组近期复发(术后18个月以内的复发)的比例差异。研究结果：A组接受窄切缘手术联合术后IMRT的患者3年OS (Overall survival)和DFS (Disease-free survival)分别为89.1和64.2%, B组接受单纯窄切缘手术的患者3年OS和DFS分别为67.7和52.2%, C组接受宽切缘手术的患者3年OS和DFS分别为86.0 和 60.1%, A组和C组患者的3年OS和DFS显着优于B组患者(A组vs.B组,P=0.009,C组vs.B组,P=0.002;A组vs.B组,P=0.038,C组vs.B组,P=0.010)。A组和C组患者出现早期复发的比例显着低于B组患者(P=0.002),B组患者主要表现为早期复发,而A组和C组患者的复发在整个随访期间的分布比较均匀。而且,A组和C组患者出现单纯肝内复发和肝外复发的比例显着低于B组患者(P=0.045,P=0.038)。就肝内复发而言,A和C组患者的切缘复发率和肝内弥漫复发率显着低于B组患者(P=0.048；P=0.018),3组患者的肝内孤立结节复发率无明显差异(P=0.426)。A组接受术后IMRT患者的放射治疗毒副作用主要是轻-中度的血液学毒性和肝功能异常,没有患者在放射治疗后出现典型或非典型的放射诱发的肝病。结论：对于邻近肝内大血管的肝细胞肝癌,窄切缘手术后的IMRT显着改善了患者的预后,取得和宽切缘手术相近的疗效,且治疗耐受性好。但是,需要大样本的前瞻性研究来进一步验证此研究结果。第二部分基于聚类分析的不同表型pTl-2N0期浸润性乳腺癌患者的预后分析研究目的：通过聚类分析获得pT1-2N0期浸润性乳腺癌患者的表型亚组,进而评估各亚组患者临床病理特点和预后。材料与方法：1999-2013年共4979例R0根治术后pT1-2N0期乳腺癌患者纳入层次聚类分析,患者间的差异性综合考虑年龄、病理类型、肿瘤大小、分化程度、脉管瘤栓、雌激素受体(Oestrogen receptor, ER)、孕激素受体(Progesterone receptor, PR)和人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2, HER-2)。聚类分析所采用的链接方式为Ward链接,同型相关系数和Spearman相关系数检验进行层次聚类内验证。生存分析采用Kaplan-Meier法,并行Log-rank检验。研究结果：同型相关系数为0.603,Spearman相关系数为0.617,双重内验证结果显示层次聚类模型与数据集中患者实际相异性呈强相关(P<0.001)。4979例R0根治术后pTl-2N0期乳腺癌采用12类分法能最好地说明样本的内在表型差异。其中,类5、类9和类12患者预后最好,其患者年龄多≥40岁,肿瘤较小,以高、中分化为主,多无脉管瘤栓,ER和PR均以阳性为主,HER-2多为阴性。类1和类11患者的预后最差,类1患者的肿瘤较大,以低分化为主,ER和PR均以阴性为主。类11患者主要表现为脉管瘤栓阳性。类2、类3、类4、类6、类7、类8、类10患者的预后居中,也具有独特的临床病理特点和复发模式。结论：通过聚类分析获得了pT1-2N0期浸润性乳腺癌患者的表型亚组,不同亚组的患者在临床病理特征上存在明显差异,并显示出不同的预后,可为术后个体化辅助治疗提供一定的参考。第叁部分基于堆迭式降噪自编码深度学习的乳腺癌个体化预后模型研究目的：利用深度学习建立乳腺癌个体化的预后预测模型材料与方法：1999-2013年共5670例R0根治术后,且随访满5年的pTis-3N0-3期乳腺癌患者以4：1的比例随机分成训练组和验证组,训练组数据输入堆迭式降噪自编码深度学习结构,自变量包括年龄、新辅助治疗、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移个数和转移率、分化程度、脉管瘤栓、ER、PR和HER-2,深度学习结构通过反复15次预训练和最多1000次的微调完成最终模型。受试者工作特征(Receiver operating characteristic, ROC)曲线下面积验证模型的准确率。研究结果：5670例患者中,1308例(23.1%)患者5年内发生复发,仅487例(8.6%)患者首次复发有局部区域复发。局部区域复发组和无局部区域复发组在年龄、肿瘤大小、淋巴结转移个数和转移率、新辅助化疗、ER、PR和HER-2方面存在显着差异。复发组和无复发组在年龄、肿瘤大小、淋巴结转移个数和转移率、新辅助化疗和PR方面存在显着差异。由于激素受体表达差异,复发组患者接受内分泌治疗比例低,而且复发组患者由于肿瘤较大、淋巴结转移个数和转移率较高,术后未接受放射治疗的比例低。5年无复发生存率和无局部区域复发生存率预测模型的ROC曲线下面积分别为0.73和0.72。结论：利用堆迭式降噪自编码建立的预后模型可为患者提供个体化的预后,同时为治疗决策模型开发奠定基础。
陈志平[10]2015年在《MiR-573/apoM/Bcl2A1途径对肝细胞凋亡和肝癌形成影响及其机制研究》文中指出背景在原发性肝癌中,肝细胞癌是主要的组织学亚型,占世界范围内总肝癌的70-85%,是发病率排第六位,致死率排第叁位的癌症。在过去30年,对肝细胞癌的治疗尽管有明显改善,仍缺乏有效的预防措施,只有序贯疗法被临床认可用于早期肝细胞癌病人；然而,这种疗法的预后不佳,这主要归因于肝内转移极易复发。肝细胞癌治疗仍是一个医学难题,尤其是对于没有显着血管入侵,局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞癌病人。慢性乙型肝炎病毒和/或慢性丙型肝炎病毒感染导致的肝纤维化和肝硬化是肝细胞癌的主要危险因素。全世界大约70-85%肝细胞癌是由于慢性乙型肝炎病毒或慢性丙型肝炎病毒持续感染所致。在部分亚洲和撒哈拉以南非洲,高频率肝细胞癌归因于升高的慢性乙型肝炎病毒感染流行。在这些区域,超过8%的人感染慢性乙型肝炎病毒。慢性乙型肝炎病毒感染导致肝癌发病人数与肝癌总发病人数相比,在发展中国家约占60%,在发达国家约占23%。慢性乙型肝炎病毒感染率,在发展中国家为33%,在发达国家为20%。在中国,乙型肝炎病毒感染也是肝细胞癌主要风险因素。慢性乙型肝炎病毒和慢性丙型肝炎病毒感染所致的持续的慢性炎症,导致肝硬化,并最终恶化为肝细胞癌。许多研究表明肝脏是脂类、脂蛋白类和载脂蛋白类代谢的关键器官,并且人类很多载脂蛋白是由肝脏产生。有研究表明,肝细胞癌病人血浆脂质成分异常。在肝细胞损伤和肝细胞癌迁移、侵袭、增殖等过程中,血浆脂质和脂蛋白发生改变。在慢性肝脏疾病和肝细胞癌中,血清脂类、脂蛋白类和／或载脂蛋白类水平可反映出肝细胞损伤程度。ApoM是近期发现的一种载脂蛋白,它主要与人类血浆中高密度脂蛋白相关联,也有少量出现在甘油叁酯和低密度脂蛋白中。apoM主要表达在肝细胞和肾小管细胞中,也有一定程度表达于胎儿肝脏和肾脏。Jiang等人发现apoM在肝细胞癌病人血浆表达水平较正常受试者显着升高,但在肝细胞癌组织中的apoM的mRNA和蛋白质显着低于它们的癌旁组织。尽管进行了大量研究,apoM和肝细胞癌进展关系仍未阐明；肝细胞癌的潜在发病机制是否与apoM直接相关仍不清楚。在本研究中,我们发现apoM有显着的抗癌特性,可能通过抑制肝癌细胞的侵袭、迁移、增殖,并且可以通过抑制Bcl2A1表达从而促进肝癌细胞凋亡。此外,hsa-miR-573下调apoM表达,诱导Bcl2A1表达,减少癌细胞凋亡,促进裸鼠体内移植肿瘤的生长。目的1、观察apoM是否可以影响HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡。2、观察Hsa-miR-573是否可以影响apoM表达。 3、观察Hsa-miR-573是否可以影响HepG2细胞侵袭、迁移、增殖及细胞凋亡。4、观察Hsa-miR-573通过apoM是否可以影响HepG2细胞凋亡及相关机制研究。5、观察Hsa-miR-573和apoM是否可以影响其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡。6、通过裸鼠成瘤实验,观察hsa-miR-573和apoM是否可以影响肿瘤生长。7、在肝细胞癌病人中,血清apoM表达与其它诊断肝癌生化指标是否相关。方法1、观察apoM对HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的影响。1.1人类HepG2细胞从American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)获得,用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)培养,DMEM培养基包含10%胎牛血清、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100 U/ml)。为了长期培养,每月对所有细胞株测试是否感染支原体。全部细胞在37℃,5%二氧化碳环境下孵育。细胞被种植于6孔板或12孔板或60毫米平皿,并且生长到铺满平皿达80-90%时待用。1.2人类HepG2细胞在含25cm2腔室细颈瓶中在标准培养条件(5%CO2,37℃)培养,其中含有DMEM培养基,伴有10%胎牛血清。慢病毒空载体标记绿色荧光蛋白(GFP; LV-Mock)和过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)标记GFP。在8 mg/mL聚凝胺条件下,细胞被慢病毒载体转染。孵育24小时后用新鲜的通用培养基清洗细胞。转导96小时后计数GFP阳性细胞。1.3收集转染LV-Mock和LV-apoM的人类HepG2细胞,制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质提取物,然后进行蛋白印迹分析,使用兔多抗-apoM抗体(Proteintech Group, Inc., Chicago, IL, USA),以及兔多抗-β-actin抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)。采用化学发光方法(ECL Plus Western Blot Detection System; Amersham Biosciences, Foster City, CA, USA)显示测定蛋白条带。1.4用Transwell小室(Millipore-Chemicon, Billerica, MA)进行侵袭实验和迁移实验。侵袭实验：将包被基质胶的小室放置于24孔组织培养皿中空孔中；用无血清培养基分别培养转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞24小时；然后用胰蛋白酶消化,用含有0.1%牛血清白蛋白的培养基稀释制成5×104cells/mL的细胞混悬液；之后,分别将500μL转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞混悬液加入每个小室；再将750μL完全培养基加入培养皿每孔中；孵育36小时后,用棉拭子将没有侵入细胞从小室隔膜上层去除；小室隔膜下层细胞用4%多聚甲醛固定10min,用结晶紫染色,然后通过显微镜摄制隔膜并计数。迁移实验：采用未包被小室,在孵育24小时后,将小室隔膜下层迁移转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞固定,染色然后摄制用于更进一步分析。1.5评估转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞的细胞增殖能力,采用细胞计数试剂盒-8(CCK8; Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)测量细胞生存能力。细胞分别转染慢病毒空载体和过表达apoM的慢病毒,分别种入96孔培养皿各叁份。在不同时间点(0,12,24,36,and 48 h),将10μLCCK-8溶液分别加入培养皿中,并且在CO2培养箱中孵育1小时。然后,加入10μL1%(w/v)SDS溶液停止反应,通过酶标仪在450 nm(Thermo Electron Corporation, Marietta, OH,USA)处对培养皿进行读数。1.6收集转染LV-Mock或LV-apoM的HepG2细胞,采用配备氩离子激光器(488nnm)的FACScan流式细胞分类仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA)完成细胞周期分析和细胞凋亡定量。根据说明书,采用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology, Beijing, China)完成细胞周期分析。根据说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I(BD Bioscience, MA)通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。2、观察Hsa-miR-573对apoM表达的影响。2.1根据试剂说明书用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取肝脏组织或培养细胞总RNA。根据试剂说明书用miRVana PARIS试剂盒(Ambion, Austin, TX, USA)从200μL血清中分离总RNA。启用靶点预测算法如miRBase、PicTar、 TargetScan和RNAhybrid,推测出apoM调节器有hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-221-3p,、hsa-miR-222-5p、 hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573。根据说明书在20微升反应孔用All-in-OneTM miRNA qPCR试剂盒检测推测出的九种小RNA(miRNAs)调节器。采用实时PCR ABI 7500 Fast系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)进行实时PCR。以U6 RNA作为内参。为了分析血清hsa-miR-573,合成的spiked-in Caenorhabditis elegans miR-39提取之前加入血清标本作为内参RNA。采用ABI 7500快速实时PCR系统SYBR Green检测试剂(TaKaRa Bio, Inc., Shiga, Japan)通过实时定量PCR测定信使RNA水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参。采用△△Ct方法定量测量。所有标本测量叁次,并且取平均值进行比较分析。2.2根据说明书用脂质体2000转染试剂,分别用50 nM miRNA模拟物(hsa-miR-145-5p, hsa-miR-145-3p, hsa-miR-221-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-222-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-766-5p, hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573)转染HepG2细胞48小时。所有实验对照样本给予等量浓度非靶向对照模拟物(阴性对照)。2.3人类apoM cDNA,包含hsa-miR-573靶点,通过化学合成,其中插入pMIR-REPORTM(Ambion)。以pMR-REPORTM beta-半乳糖苷酶对照(JAmbion)作为内参。荧光素酶测定中,采用脂质体2000转染试剂,野生型(pMIR-apoM-wt)或突变型(pMIR-apoM-mt)和hsa-miR-573模拟物共同转染进入人胚肾293T细胞(293T)。采用双重荧光素酶测试试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)测量荧光素酶活性。3、观察Hsa-miR-573对HepG2细胞侵袭、迁移、增殖和细胞凋亡的影响。3.1从ATCC获得HepG2细胞,采用DMEM培养,含10%胎牛血清、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100 U/ml)。在37℃,5%二氧化碳环境下孵育。细胞在6孔板或12孔板或60毫米平皿中培养,生长至汇合度达80-90%时待用。为了长期培养,每月检测所有细胞株是否感染支原体。3.2在标准培养条件,含25 cm2腔室细颈瓶中培养HepG2细胞。慢病毒空载体标记GFP,过表达hsa-miR-573慢病毒载体(LV-miR-573)标记GFP。在8 mg/mL聚凝胺条件下,慢病毒载体转染细胞。孵育24小时之后用新鲜的通用培养基清洗细胞。转导96小时之后计数GFP阳性细胞。3.3收集转染LV-Mock及LV-miR-573的人类HepG2细胞,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离出蛋白质提取物,进行蛋白印迹分析,采用兔多克隆抗-apoM抗体,以及兔多克隆抗-β-actin抗体。采用化学发光方法来显示测定蛋白条带。3.4采用Transwell小室进行侵袭实验及迁移实验。侵袭实验：将包被基质胶的小室放置在24孔组织培养皿中空孔中；采用无血清培养基分别培养转染LV-Mock和LV-miR-573人类HepG2细胞24小时；用胰蛋白酶进行消化,并且将含0.1%牛血清白蛋白培养基制成5×104 cells/mL细胞混悬液；然后,分别将500μL转染了LV-Mock和LV-miR-573的HepG2细胞混悬液加入到每个小室;750止完全培养基加入到培养皿每孔中；孵育36小时之后,使用棉拭子将没有侵人细胞从小室隔膜的上层细胞除去；小室隔膜的下层细胞用4%多聚甲醛固定10min,再用结晶紫染色,然后再通过显微镜摄制隔膜并计数。迁移实验：用未包被小室,孵育24小时后,固定小室隔膜下层迁移转染LV-Mock和LV-miR-573的人类的HepG2细胞,染色然后摄制用于再进一步的分析。3.5评估转染LV-Mock和LV-miR-573人类HepG2细胞的细胞增殖能力,用CCK-8测量细胞生存能力。细胞分别转染慢病毒空载体及过表达miR-573慢病毒,种入到96孔培养皿每种叁份。在不同的时间点(0,12,24,36,and 48 h),将10μLCCK-8溶液加入到培养皿每孔中,并在一个CO2培养箱中孵育1小时。然后,将10 μL 1%(w/v) SDS溶液加入到每孔停止反应,通过酶标仪在光密度450nm(Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, USA)下对培养皿进行读数。3.6收集转染LV-Mock和LV-miR-573的人类HepG2细胞,采用配备氩离子激光器(488 nm)的FACScan流式细胞分类仪来完成细胞周期分析及细胞凋亡定量。根据说明书,用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成对细胞周期分析。根据说明书,使用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I经过流式细胞分类仪来完成细胞凋亡分析。4、观察Hsa-miR-573通过apoM对HepG2细胞凋亡影响及相关机制研究。4.1从ATCC获得HepG2细胞,采用包含10%的胎牛血清、链霉素(100μg/mL)和青霉素(100 U/m1)的DMEM培养基进行培养。为了长期培养,每月对所有的细胞株测试是否感染支原体。细胞全部在37℃,5%二氧化碳环境下进行孵育。在6孔板或12孔板或60毫米平皿种植细胞,并且生长至汇合度达80-90%时待用。4.2用25 cm2腔室细颈瓶,在标准培养条件培养细胞,其培养基为含有10%胎牛血清的DMEM。慢病毒空载体标记GFP,过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)及过表达hsa-miR-573慢病毒载体(LV-miR-573)标记GFP。在8mg/mL聚凝胺条件下,慢病毒载体转染HepG2细胞。孵育24小时之后用新鲜培养基清洗细胞。转染96小时后计数GFP阳性细胞。4.3根据试剂说明书用TRIzol试剂提取转染了LV-Mock、LV-miR-573和LV-miR-573的人类HepG2细胞总RNA。采用ABI 7500快速实时PCR系统SYBR Green检测试剂(TaKaRa Bio, Inc., Shiga, Japan)通过实时定量PCR测定信使RNA水平。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内参。采用△△Ct方法定量测量。所有标本测量叁次,并且取平均值进行比较分析。HepG2细胞中分析相关基因的表达：CASP1, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP8, CASP9, CASP10, P53, P63, P73, B-cell lymphoma (Bcl)-2, Bcl2-A1, Bcl2-L1, Bcl2-L2, Bcl-XL, Bcl-2对应拮抗剂(Bak), Bakl, Bcl-2相似蛋白4(Bax), Bik,髓细胞瘤病病毒致病基因同系物(c-myc), survivin和诱导髓细胞性白血病细胞分化基因(mcl-1)。4.4 PIRES2-EGFP和PCR-XL-TOPO(包含Bcl2A1,通过化学合成oligos经由PCR而组合)购于Invitrogen公司。Eco-RI-Bcl2A1和IRES-EGFP-XhoI部分通过CR-XL-TOPO和PIRES2-EGFP模板放大。采用重迭序列PCR,参与Eco-RI-Bcl2A1-IRES-EGFP-XhoI。凝胶电泳完成后,从凝胶上分离相关条带,采用EcoRI/XhoI双重酶切,合并入pcDNA3.1(+),然后转化进入有活性的大肠杆菌DH5a细胞进行更多地扩增和应用。重组质粒通过序列测定被证实并命名为pcDNA3.1-Bcl2Al。根据说明书采用脂质体2000转染试剂(Invitrogen公司)完成质粒转染实验。4.5将HepG2细胞处理如下：(1) LV-apoM, (2) LV-apoM+pcDNA3.1-Bcl2A1,(3) LV-miR-573, (4) LV-miR-573+pcDNA3.1-Bcl2A1。然后,收集细胞,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质提取物,然后进行蛋白印迹分析,使用兔多克隆抗-apoM和抗-Bc12Al抗体(Proteintech Group, Inc., Chicago, IL, USA),以及兔多克隆抗-β-actin抗体。采用化学发光方法显示测定蛋白条带。4.6将HepG2细胞处理如下：(1) LV-apoM, (2) LV-apoM+pcDNA3.1-Bcl2A1,(3) LV-miR-573, (4) LV-miR-573+pcDNA3.1-Bcl2A1。然后,收集细胞,采用配备氩离子激光器(488 nm)的FACScan流式细胞分类仪完成细胞周期分析及细胞凋亡定量。按照说明书,用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成细胞周期分析。按照厂家说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。5、观察Hsa-miR-573和apoM对其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的影响。5.1从ATCC获得Hep3B细胞及SK-Hep-1细胞,使用含10%胎牛血清、链霉素(100μg/mL)和青霉素(100 U/ml)的DMEM培养基。为长期培养,每月对所有的细胞株测试是否感染支原体。在37℃,5%二氧化碳环境下培养细胞。将细胞种植于6孔板或12孔板或60毫米平皿,并且培养到汇合度达80-90%时待用。5.2在含25 cm2腔室细颈瓶中,标准培养条件下培养Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞。慢病毒空载体标记GFP,过表达人类apoM慢病毒载体及过表达hsa-miR-573慢病毒载体标记GFP。在8mg/mL聚凝胺条件下,慢病毒载体转染细胞。孵育24小时之后用新鲜培养基清洗细胞。转染96小时之后计数GFP阳性细胞。5.3收集细胞,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。使用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白质提取物,再进行蛋白印迹分析,使用兔多抗-apoM抗体及抗-Bcl2A1抗体,以及兔多抗-β-actin抗体。采用化学发光显示测定蛋白条带。5.4用Transwell小室进行侵袭实验及迁移实验。侵袭实验：将包被基质胶小室放置在24孔组织培养皿中空孔中；采用无血清培养基分别培养转染了LV-Mock、 LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞24小时；然后用胰蛋白酶消化,并且用含有0.1%牛血清白蛋白培养基稀释制成5×104cells/mL细胞混悬液；然后,分别将500μL转染LV-Mock、LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞或SK-Hep-1细胞混悬液加入到每个小室；再将750μL完全培养基加入到培养皿每孔中；培养36小时之后,用棉拭子将没有侵入的细胞从小室隔膜上层除去；小室隔膜下层细胞使用4%多聚甲醛固定10min,再用结晶紫染色,然后通过显微镜摄制隔膜并计数。迁移实验：用未包被小室,培养24小时后,将小室隔膜下层迁移转染LV-Mock、LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞固定,染色然后摄制用于进一步分析。5.5评估转染LV-Mock、LV-apoM及LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞增殖能力,用细胞计数试剂盒-8测量细胞生存能力。细胞分别转染慢病毒空载体、过表达apoM慢病毒或过表达miR-573慢病毒,种入96孔培养皿各叁份。于不同时间点(0,12,24,36,and48 h),将10 μL CCK-8溶液加入到培养皿每孔,在C02培养箱孵育1小时。然后,将10 μL 1%(w/v) SDS溶液加入每孔停止反应,通过酶标仪在光密度450 nm对培养皿进行读数。5.6收集转染了LV-Moc、LV-apoM或LV-miR-573的Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞,使用配备氩离子激光器(488 nm)的一个FACScan流式细胞分类仪完成细胞周期分析及细胞凋亡定量。按照说明书,使用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成细胞周期分析。根据说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I,再通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。6、通过裸鼠成瘤实验,观察hsa-miR-573和apoM对肿瘤生长的影响。6.1所有研究依据南方医院实验动物管理委员会相关条款完成。无胸腺裸鼠(BALB/c,无特定病原等级,雄性,大约16 g,4周龄)被随机分为叁组(LV-Mock(n=15)组,LV-apoM(n=15)组和LV-miR-573(n=15)组)；每个笼子饲养五只；饲养环境：25。C,每天12小时白天12小时晚上周期。所有小鼠用高压灭菌小鼠食物饲养。HepG2细胞用200此磷酸盐缓冲液混匀,接种剂量为每只小鼠1×107个HepG2细胞。LV-Mock组小鼠皮下注射对照慢病毒(LV-Mock), LV-apoM组小鼠皮下注射过表达apoM'慢病毒(LV-apoM), LV-miR-573组小鼠皮下注射过表达hsa-miR-573慢病毒(LV-miR-573)。所有裸鼠体重和移植性肿瘤每3天测量一次。全部小鼠处死后取出移植成形的肿瘤,并用石蜡包被。6.2收集移植肿瘤组织,根据已建立的方法制备蛋白质提取物。采用10%十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质提取物,然后进行蛋白印迹分析,使用兔多克隆抗-apoM和抗-Bcl2A1抗体,以及兔多克隆抗-β-actin抗体。采用化学发光方法显示测定蛋白条带。6.3收集异种移植肿瘤中分离的肝细胞,采用配备氩离子激光器(488 nm)的FACScan流式细胞分类仪完成细胞周期分析和细胞凋亡定量。根据说明书,采用碘化丙啶(PI)细胞周期检测试剂盒完成细胞周期分析。根据说明书,采用异硫氰酸荧光素膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I通过流式细胞分类仪完成细胞凋亡分析。7、在肝细胞癌病人中,血清apoM表达是否与其它诊断肝癌生化指标相关。7.1从2012年10月到2013年4月在南方医院医学实验中心获得655例血清标本。通过临床诊断结果,655例血清标本被分为4组：181例肝细胞癌病人血清,182例慢性乙型肝炎病人血清,63例慢性丙型肝炎病人血清,89例肝硬化病人血清,140例正常人对照血清。所有正常对照组的受试者氨基转移酶正常,无既往肝病史,无酗酒,未感染乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒。所有受试者特性有图表显示。7.2血清apoM浓度用商品化酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(USCN Life Science Inc., Wuhan, China)定量检测两次。用酶标仪(Titertek Multiskan MC, Sterling, VA, USA)在450纳米光密度下测量,采用apoM试剂盒制定标准线性回归曲线检测apoM溶度。丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)和甲胎蛋白(AFP)采用自动化分析仪测定。乙型肝炎表面抗原采用ELISA法检测。乙肝DNA浓度采用PCR仪检测。并分析血清apoM浓度和年龄之间的单变量相关性。7.3构建ROC曲线并计算曲线下面积,评估预示值的敏感性和特异性,评估血清apoM作为肝脏疾病恶化标志物的可行性。7.4应用以上健康志愿受试者、慢性乙型肝炎病人、慢性丙型肝炎病人、肝硬化病人和肝细胞癌病人血清,采用实时PCR ABI 7500 Fast系统进行实时PCR,验证hsa-miR-573表达。以U6RNA作为内参。分析血清hsa-miR-573时以合成的spiked-in Caenorhabditis elegans miR-39作为内参并在RNA提取之前加入血清标本。结果1.观察apoM对HepG2细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的研究。Jiang等人证明肝细胞癌组织中apoM mRNA和蛋白质水平显着低于癌旁组织。由于apoM涉及肝细胞癌发病机制,因此首先验证了apoM对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响。用慢病毒空载体(LV-Mock)或过表达人类apoM慢病毒载体(LV-apoM)转染HepG2细胞。通过蛋白印迹分析法评价HepG2细胞中apoM蛋白表达。与慢病毒空载体处理细胞组相比,过表达apoM的细胞apoM表达水平显着地升高。用transwell实验研究apoM对HepG2细胞迁移和侵袭的影响。与转染慢病毒空载体的HepG2细胞相比,感染过表达apoM慢病毒载体的HepG2细胞迁移和侵袭能力的显着减低。然后,观察采用CCK-8实验检测apoM的表达是否影响HepG2细胞的生存和增殖。结果表明,过表达人类apoM慢病毒载体处理,减低存活的HepG2细胞的比例。通过流式细胞术,研究apoM对细胞周期的影响。如图1D所示,与对照组相比,感染apoM后,在G1期细胞百分数有所增多,在S期细胞百分数有所减少,在G2期细胞和M期细胞百分数没有改变。通过流式细胞术,用联合标记钙磷脂结合蛋白V(AV)和碘化丙啶的方法,评价HepG2细胞感染慢病毒空载体和过表达人类apoM慢病毒载体后细胞凋亡情况。如图1E所示,与慢病毒空载体转染的HepG2细胞相比,转染过表达apoM'慢病毒载体显着增加细胞凋亡百分数(86.48±2.33 vs.3.31±0.56,p=0.000)。综上,这些数据表明apoM在肝细胞癌中的重要的病理学作用。2.观察Hsa-miR-573对apoM表达影响的研究。既然研究表明,与癌旁组织相比,肝细胞癌组织的apoM mRNA和蛋白质水平显着更低; miRNAs通过与靶向mRNAs的3'端非翻译区域相互作用,抑制基因表达。因此推测miRNAs可能参与apoM表达的调节。首先,用4个预测程序miRBase, PicTar, TargetScan和RNAhybrid去筛选靶向apoM的miRNAs。分析预测9个潜在的apoM-靶向的miRNAs,分别是:hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-221-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573。随后用HepG2细胞,研究九个假定的miRNAs模拟物对apoM表达的影响。hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-222-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573的模拟物下调apoM mRNA的表达。另外,hsa-miR-145-3p、 hsa-miR-766-5p、hsa-miR-766-3p和hsa-miR-573的模拟物下调apoM蛋白表达。因此,hsa-miR-573模拟物显着下调apoM mRNA和蛋白质水平,且最低限度的自由能为-20.7 kcal/mol。采用荧光素酶实验研究,hsa-miR-573是否能直接调节apoM表达。在共转染hsa-miR-573和pMIR-apoM-野生型之后,荧光素酶活性显着地降低。如果把野生型换成突变型,这一效果完全消失。这些结果表明,hsa-miR-573通过直接靶向作用结合apoM的3'-UTR,抑制apoM的表达。3.观察Hsa-miR-573对HepG2细胞侵袭、迁移、增殖及细胞凋亡的研究。由于hsa-miR-573靶向作用于apoM,参与调节HepG2细胞的侵袭、迁移、增殖和凋亡。因此进一步研究了HepG2细胞中hsa-miR-573对侵袭、迁移、增殖和凋亡的效应。慢病毒空载体(LV-Mock)或过表达hsa-miR-573慢病毒载体(LV-miR-573)转染HepG2细胞。通过蛋白印迹法检测apoM蛋白在HepG2细胞中表达情况。与转染慢病毒空载体的细胞相比,转染过表达has-miR-573慢病毒的细胞apoM表达明显降低。Transwell实验发现,与转染慢病毒空载体HepG2细胞相比,转染慢病毒LV-miR-573的HepG2细胞迁移和侵袭能力显着地增强。CCK-8实验发现,慢病毒过表达LV-miR-573使HepG2细胞存活比例显着增强。此外,与转染慢病毒空载体对照组细胞相比,转染慢病毒LV-miR-573的HepG2细胞G1期(DNA合成前期)百分比减少,S期(DNA合成期)百分比增多,G2期(DNA合成后期)/M期(有丝分裂期)百分比不变。LV-miR-573显着抑制HepG2细胞凋亡率(3.65±0.49 vs.1.21±0.32,p=0.000)。这些结果表明,hsa-miR-573可能通过抑制apoM的表达从而促进HepG2细胞侵袭、迁移和增殖,并抑制HepG2细胞凋亡。4.观察Hsa-miR-573和ApoM对HepG2细胞凋亡影响及相关机制的研究。上述实验表明,在HepG2细胞中,与慢病毒空载体组相比,过表达apoM慢病毒组细胞凋亡率显着增强(86.48±2.33 vs.3.31±0.56,p=0.000)。因此进一步通过HepG2细胞中过表达apoM来研究apoM改变凋亡率的潜在机制。首先,在HepG2细胞中分析凋亡相关基因的表达：CASP1, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP8, CASP9, CASP10, P53, P63, P73, B-cell lymphoma (Bcl)-2, Bcl2-A1, Bcl2-L1, Bcl2-L2, Bcl-XL, Bcl-2对应拮抗剂(Bak), Bakl, Bcl-2相似蛋白4(Bax), Bik,髓细胞瘤病病毒致病基因同系物(c-myc), survivin和诱导髓细胞性白血病细胞分化基因(mcl-1)。通过过表达apoM, CASP1和P63转录水平上调,反之,CASP6, CASP8, CASP9, P53, Bcl-2, Bcl2A1, Bak和Bik转录水平下调。在过表达apoM后,Bcl2A1明显下调,并且作为一个细胞内的膜相关蛋白,扮演重要的抑制凋亡的角色。通过蛋白印迹法,在慢病毒过表达apoM的HepG2细胞中,研究Bcl2A1蛋白的表达。过表达apoM导致Bcl2A1水平显着地下调。研究apoM是否通过抑制Bcl2A1表达诱导细胞凋亡；在HepG2细胞中,过表达apoM后,观察过表达Bcl2A1重组质粒(pcDNA-Bcl2A1)对细胞凋亡率的影响。在HepG2细胞中,pcDNA-Bcl2A1处理上调Bcl2A1蛋白表达。在HepG2细胞中,过表达人类apoM细胞凋亡率的增加可以被pcDNA-Bcl2A1处理代偿(85.76±1.96 vs.15.78±1.87,P=0.000)。在HepG2细胞中,通过蛋白印迹方法分析,研究hsa-miR-573是否调节Bcl2A1的表达,apoM是否参与这一过程。LV-miR-573诱导Bcl2A1蛋白表达。LV-miR-573转染所致的Bcl2A1表达的上调被过表达apoM恢复。另外,在HepG2细胞中,pcDNA-Bcl2A1处理显着地增强了LV-miR-573-抑制的细胞凋亡率(1.21±0.32 vs.0.23±0.06,p=0.000)。这些结果表明hsa-miR-573可能下调apoM的表达,上调Bcl2A1的表达。5.观察Hsa-miR-573和apoM对其它肝癌细胞迁移、侵袭、增殖及细胞凋亡的研究。在Hep3B细胞和SK-Hep-1细胞中,研究apoM对侵袭、迁移、增殖和细胞凋亡的影响。与慢病毒空载体处理的细胞相比,过表达miR-573细胞中apoM表达显着地减少,同时Bcl2A1表达显着地增加。此外,与慢病毒空载体处理的细胞相比,过表达人类apoM的细胞中Bcl2A1表达显着地降低。另外,与慢病毒空载体处理的细胞相比,过表达人类apoM细胞显示迁移、侵袭和增殖能力显着地降低。在Hep3B和SK-Hep-1细胞中,与慢病毒空载体处理相比,过表达人类apoM显着地增加细胞凋亡百分数(75.81±3.95 vs.2.95±0.91,p=0.000；83.56±5.13 vs.2.49±1.02,p=0.000)。如图5E所示,在Hep3B和SK-Hep-1细胞中,相比较对照组细胞,过表达人类apoM细胞G1期细胞百分数增加,S期细胞百分数减少,G2期/M期细胞百分数不变。以上结果表明,apoM在肝癌形成中扮演一个重要的角色。6.通过裸鼠成瘤实验,观察hsa-miR-573和apoM对肿瘤生长的影响。活体内实验评估hsa-miR-573和apoM对肿瘤生长的影响。皮下注射四周后,将肿瘤移除并称重。与注射慢病毒空载体处理的HepG2细胞的小鼠相比,注射过表达人类apoM慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,肿瘤生长显着地减慢(52.8% inhibition in weight, p=0.003);而注射过表达miR-573慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,肿瘤生长明显增快(24.7% promotion in weight, p=0.004).通过裸鼠成瘤实验,研究hsa-miR-573和apoM对Bcl2A1表达和细胞凋亡率的影响。采用蛋白印迹分析,检测apoM和Bcl2A1表达；采用流式细胞术,检测异种移植肿瘤分离的肝细胞的细胞凋亡比例。将过表达miR-573慢病毒载体处理的HepG2细胞,腹腔注射进入小鼠,所形成的异种移植肿瘤,通过蛋白印迹实验发现apoM蛋白表达下降,Bcl2A1蛋白水平升高。将过表达apoM慢病毒载体处理的HepG2细胞,腹腔注射进入小鼠,所形成的异种移植肿瘤,通过蛋白印迹实验发现,apoM蛋白表达升高,Bcl2A1蛋白水平降低。与注射慢病毒空载体处理的HepG2细胞的小鼠相比,注射过表达人类apoM慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,异种移植肿瘤分离的肝细胞的凋亡率显着地升高(75.81±3.95 vs.2.59±0.91,p=0.000)：反之,注射过表达miR-573慢病毒载体处理的HepG2细胞的小鼠,异种移植肿瘤分离的肝细胞的凋亡率显着地降低(0.31±0.06vs.2.59±0.91,p=0.000)。以上实验结果表明,apoM在肝细胞癌中起肿瘤抑制的作用。7.在肝细胞癌病人中,血清apoM表达与其它诊断肝癌生化指标相关性研究。研究apoM在肝细胞癌发病机理中所起的作用。在655个受试者中,研究血清apoM浓度与肝癌相关临床和生化指标相关性。在健康受试者、慢性乙型肝炎病人(CHB)、慢性丙型肝炎病人(CHC)、肝硬化病人和肝细胞癌病人中,平均血清apoM浓度分别为18.83±8.98 mg/L,21.36±12.63 mg/L,14.39±4.94 mg/L, 26.47±13.55 mg/L,and 23.59±13.64 mg/L。分析血清apoM浓度和年龄之间的单变量相关关系；血清apoM浓度分别和ALT、AST、AFP、HBsAg-T、HBV-DNA之间的单变量相关关系。在肝细胞癌受试者中,血清apoM浓度和AFP浓度显示一个正相关关系(r=0.470,p=0.025)。另外,与健康受试者相比,肝细胞癌病人、慢性乙型肝炎病人和肝硬化病人,血清apoM水平显着地升高,然而慢性丙型肝炎病人,血清apoM水平显着地降低。在655个已鉴定的受试者(包括182个慢性乙型肝炎病人、63个慢性丙型肝炎病人、89个肝硬化病人和181个肝细胞癌病人)研究apoM的预测值。分析ROC曲线发现,与慢性乙型肝炎病人相比,健康对照受试者apoM的曲线下面积为0.524±0.032(95% confidence interval(CI)=0.462-0.587,p=0.453)；与慢性丙型肝炎病人相比,健康对照受试者apoM的曲线下面积为0.685+0.034(95%CI=0.596-0.741,p=0.000)；与肝硬化病人相比,健康对照受试者apoM显示的曲线下面积为0.687±0.034(95%CI=0.595-0.731,p=0.000)；与肝细胞癌病人相比,健康对照受试者apoM的曲线下面积为0.712±0.031(95%CI=0.615-0.738,p=0.000)。用上述健康志愿受试者、慢性乙型肝炎病人、慢性丙型肝炎病人、肝硬化病人和肝细胞癌病人血清,研究血清hsa-miR-573表达。与健康志愿受试者相比,慢性丙型肝炎病人的血清hsa-miR-573表达显着地上调。此外,与健康志愿受试者相比,慢性乙型肝炎病人、肝硬化病人和肝细胞癌病人的血清hsa-miR-573表达水平显着地下调。结论1、ApoM抑制HepG2细胞迁移、侵袭和增殖,同时促进细胞凋亡。2、通过靶向作用apoM的3'-UTR,Hsa-miR-573下调apoM的表达。3. Hsa-miR-573促进HepG2细胞侵袭、迁移和增殖,同时抑制凋亡。4、通过调节Bcl2A1表达,apoM促进HepG2细胞凋亡,hsa-miR-573抑制HepG2细胞凋亡。5、在其它的肝癌细胞系,ApoM抑制细胞侵袭、迁移和增殖,同时促进细胞凋亡。6、在裸鼠成瘤实验中,ApoM抑制肿瘤生长,反之hsa-miR-573促进肿瘤生长。7、在肝细胞癌病人中,血清apoM浓度升高,并且显示和AFP浓度呈正相关。
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