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利用CRISPR/Cpf1系统构建DDX21基因敲除模型及功能初步研究

2020-12-08阅读(741)

利用CRISPR/Cpf1系统构建DDX21基因敲除模型及功能初步研究

论文摘要

CRISPR/Cpf1是2015年张峰小组报道的新型CRISPR系统,研究证实该系统具有更简单、更精准实现基因组编辑的潜能。解旋酶DDX21不仅能够参与信使RNA（Messenger RNA,mRNA）前体加工、RNA的转运和降解、核糖体的生成等多种生物学过程,而且在禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、登革热病毒（Dengue virus,DENV）、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）等病毒的增殖及信号传导过程中也发挥了重要作用。本研究首先利用CRISPR/Cpf1技术敲除哺乳动物HEK293细胞DDX21基因并感染H9N2亚型AIV,在细胞水平验证了CRISPR/Cpf1系统的活性及DDX21介导AIV感染的天然免疫应答机制;进一步探索了CRISPR/Cpf1慢病毒系统在鸡DF-1细胞和鸡体上的基因编辑,为揭示DDX21基因功能、病毒致病机制研究奠定了基础。CRISPR/Cpf1系统编辑哺乳动物细胞:以DDX21为靶向基因,利用在线软件chopchop筛选靶位点,分别构建pU6-Lb-crRNA-DDX21打靶载体和pcDNA3.1-hLbCpf1-RFP报告载体。将两个载体共同转染HEK293细胞,流式细胞仪分选阳性细胞,T7E1酶切法检测Cpf1核酸酶切割活性为56.8%,经筛选后获得2株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,成功建立以CRISPR/Cpf1系统介导基因稳定敲除的新方法。以构建的HEK293-DDX21-/-为细胞模型,H9N2亚型AIV感染后测定病毒滴度,荧光定量PCR检测模式识别受体、细胞因子、抗病毒蛋白的mRNA表达水平,进一步验证及揭示敲除DDX21基因的功能变化。结果显示:TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IFN-α、IFN-β、IL-6及OAS的mRNA表达水平下调,TCID50差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后可能引起DDX21-TRIF-MyD88信号通路受阻,抑制I型干扰素、炎症因子和抗病毒蛋白表达,促进流感病毒复制。CRISPR/Cpf1系统编辑鸡DF-1细胞:根据设计原则,在鸡DDX21基因第2外显子筛选4个靶点,分别将重新构建的4个打靶载体与报告载体共同转染DF-1细胞,T7E1酶切和TA克隆测序发现靶点1切割效率最高为33.3%（10/30）,靶点处存在548bp的缺失。包装Lenti-Cpf1-DDX21慢病毒感染DF-1细胞,嘌呤霉素筛选富集阳性细胞,通过流式细胞仪分选至96孔板中,经测序鉴定后,成功获得2株DDX21基因敲除的DF-1细胞株。基因编辑鸡的探索:慢病毒表达载体与相应的包装质粒按照一定的比例混合后转染至293T细胞,通过ELISA方法测定慢病毒滴度为2.5×107Tu/mL;采用赤道面开窗法,将包装的慢病毒显微注射到527枚新生种蛋的胚盘下腔,孵化得到83只雏鸡,孵化率为15.86%;凝胶电泳鉴定,外源基因整合至鸡基因组中的效率为22.9%（19/83）。本研究成功建立CRISPR/Cpf1介导的HEK293及DF-1细胞的基因敲除方法,通过H9N2亚型AIV感染实验验证DDX21参与的信号通路过程,探索了CRISPR/Cpf1慢病毒系统在鸡体内的基因编辑,对利用CRISPR/Cpf1建立细胞、动物模型和研究基因功能等具有重要的应用价值。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 CRISPR/Cas系统
  •     1.1.1 CRISPR/Cas系统的组成及分类
  •     1.1.2 CRISPR/Cas系统作用机制
  •     1.1.3 CRISPR/Cas系统在家禽中的应用
  •   1.2 慢病毒载体
  •     1.2.1 慢病毒的结构
  •     1.2.2 慢病毒侵染细胞的机制
  •     1.2.3 慢病毒载体的发展
  •     1.2.4 慢病毒载体的应用
  •   1.3 DExD/H-box蛋白家族
  •     1.3.1 DExD/H-box家族的结构
  •     1.3.2 DExD/H-box家族的分类
  •     1.3.3 DExD/H-box家族DDX21 蛋白功能简介
  •   1.4 研究目的和意义
  • 第二章 CRISPR/Cpf1系统介导哺乳动物细胞的基因组编辑
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 质粒和细胞
  •     2.1.2 主要试剂和仪器
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 靶点的选择及设计
  •     2.2.2 CRISPR/Cpf1打靶载体的构建
  •     2.2.3 CRISPR/Cpf1报告载体的构建
  •     2.2.4 细胞的培养及转染
  •     2.2.5 CRISPR/Cpf1载体对靶基因的编辑
  •     2.2.6 脱靶检测
  •     2.2.7 细胞接毒
  •     2.2.8 模式识别受体、细胞因子及抗病毒蛋白mRNA表达水平检测
  •     2.2.9 统计分析
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 CRISPR/Cpf1打靶及报告载体的鉴定
  •     2.3.2 CRISPR/Cpf1核酸酶活性检测
  •     2.3.3 稳定敲除DDX21的HEK293细胞系的建立
  •     2.3.4 脱靶检测结果
  •     2.3.5 病毒生长曲线
  •     2.3.6 模式识别受体、细胞因子及抗病毒蛋白mRNA表达水平检测
  •   2.4 讨论
  • 第三章 CRISPR/Cpf1系统介导鸡DF-1 及鸡体中的基因组编辑
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 种蛋、质粒和细胞
  •     3.1.2 主要试剂和仪器
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 gRNA寡核苷酸链的合成及载体构建
  •     3.2.2 DF-1细胞的转染
  •     3.2.3 gRNA活性检测
  •     3.2.4 重组慢病毒载体构建
  •     3.2.5 慢病毒的包装
  •     3.2.6 慢病毒滴度测定
  •     3.2.7 敲除细胞株的建立
  •     3.2.8 鸡胚慢病毒注射
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 gRNA表达载体的鉴定
  •     3.3.2 双质粒转染DF-1 细胞
  •     3.3.3 敲除效率检测
  •     3.3.4 慢病毒载体的构建
  •     3.3.5 CRISPR/Cpf1靶向编辑DF-1 细胞
  •     3.3.6 注射慢病毒种蛋的检测
  •   3.4 讨论
  • 第四章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 鲁国涛

    导师: 孟庆文

    关键词: 慢病毒,细胞,基因编辑

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: Q78;S852.65

    总页数: 57

    文件大小: 4012K

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