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裂解性多糖单加氧酶参与醌氧化还原循环驱动Fenton反应研究

2020-12-08阅读(443)

裂解性多糖单加氧酶参与醌氧化还原循环驱动Fenton反应研究

论文摘要

醌氧化还原循环利用氢醌/醌类化合物作为电子穿梭载体,驱动Fenton反应,在木腐真菌胞外降解木质纤维素过程中发挥重要作用。裂解性多糖单加氧酶（英文,LPMO）是最近发现的一类新型铜依赖氧化酶,可在抗坏血酸、氢醌等外源电子供体驱动下氧化糖苷键,并促进多糖水解。LPMO氧化氢醌的过程中产生的半醌中间体已被证实可以还原Fe3+产生Fe2+和H2O2,从而驱动Fenton反应的发生并产生羟自由基。是否暗示着LPMO有可能参与醌氧化还原循环驱动Fenton反应呢?本论文首次将LPMO与醌氧化还原循环联系起来,在体外证实了LPMO可参与醌氧化还原循环驱动Fenton反应并产生羟自由基,进一步系统地研究了葡萄糖脱氢酶（英文,GDH）和1,4-苯醌还原酶（英文,BQR）分别协同LPMO反应过程中H2O2、铁还原和羟自由基的产生规律。具体研究结果如下:经异源表达及分离纯化分别获得了来源于Iprex lacteus CD2和Echinodontium taxodii 2538的裂解性多糖单加氧酶Il LPMO9A和EtLPMO9A,来自于Glomerella cingulata的葡萄糖脱氢酶（GcGDH）以及来自于Pleurotus ostreatus BP3的苯醌还原酶（PoBQR2）,并进行了生物信息学分析。LPMO的酶学性质研究显示,2-甲氧基-1,4-对苯二酚（MBQH2）和2,6-二甲氧基-1,4-对苯二酚（DBQH2）等氢醌化合物可作为电子供体驱动Il LPMO9A和EtLPMO9A反应,两种LPMO均可以在C1和C4位氧化纤维素底物,并促进纤维素水解,当pH5.0、50℃条件下表现出最强活性,纤维素水解率最高分别提升28.89%和28.41%。在LPMO参与醌氧化还原的系统研究中发现,不同的LPMO能以两种途径促进铁的还原:（1）GcGDH通过还原2,6-二甲氧基-1,4-苯醌（DBQ）为LPMO提供电子,并还原Fe3+,铁还原能力最高增强252.9%（Il LPMO9A）和237.8%（EtLPMO9A）;（2）PoBQR2通过还原MBQ或DBQ为LPMO提供电子还原Fe3+产生H2O2,铁还原能力最高增强81.9%（IlLPMO9A）和30.4%（EtLPMO9A）;研究还发现LPMO能够参与醌氧化还原的系统并与PoBQR2、GcGDH协同效应显著。LPMO与GDH协同作用时,Fenton反应的产物羟自由基的浓度分别增加271.6%（IlLPMO9A）和82.9%（EtLPMO9A）,当LPMO与BQR协同作用时,羟自由基的浓度能提高23.4%（IlLPMO9A）和5.3%（EtLPMO9A）。综上所述,本论文研究不仅证实了LPMO通过与GDH或BQR协同作用将Fe3+还原为Fe2+,并且发现LPMO参与醌氧化还原循环,显著促进Fenton反应产生羟自由基,研究结果为LPMO生物学功能的拓展和在生物质降解中的新作用提供基础理论依据。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 绪论
  •   1.1 裂解性多糖单加氧酶
  •     1.1.1 裂解性多糖单加氧酶的生物学功能
  •     1.1.2 裂解性多糖单加氧酶的结构特点
  •     1.1.3 裂解性多糖单加氧酶的催化机制
  •     1.1.4 裂解性多糖单加氧酶的电子供体
  •   1.2 醌氧化还原循环系统
  •     1.2.1 醌氧化还原循环的生物学功能与应用
  •     1.2.2 醌氧化还原循环驱动Fenton反应的机制
  •     1.2.3 醌氧化还原循环中的酶促反应
  •   1.3 论文研究内容
  •     1.3.1 目的与意义
  •     1.3.2 主要研究内容
  •     1.3.3 研究思路与技术路线
  • 2 LPMO的异源表达及酶学性质
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌种
  •     2.1.2 培养基
  •     2.1.3 主要试剂
  •     2.1.4 引物
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 LPMO的基因克隆与克隆载体的构建
  •     2.2.2 LPMO在毕赤酵母中的异源表达与分离纯化
  •     2.2.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
  •     2.2.4 LPMO协同纤维素酶水解纤维素的实验方法
  •     2.2.5 LPMO小分子电子供体的鉴定方法
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 LPMO的基因克隆与异源表达
  •     2.3.2 LPMO氧化活性的验证
  •     2.3.3 LPMO促进纤维素酶水解
  •     2.3.4 LPMO的小分子电子供体
  •   2.4 本章小结
  • 3 LPMO协同GDH驱动醌氧化还原循环
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 培养基
  •     3.1.3 主要试剂
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 GDH的表达与纯化
  •     3.2.2 GDH的酶活测定
  • 2O2的测定方法'>    3.2.3 H2O2的测定方法
  •     3.2.4 铁还原力的测定方法
  •     3.2.5 羟自由基的测定方法
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 GDH的表达与纯化
  • 2O0'>    3.3.2 LPMO与 GDH协同产生H2O0
  •     3.3.3 LPMO与 GDH协同还原三价铁
  •     3.3.4 LPMO与 GDH协同产生羟自由基
  •   3.4 本章小结
  • 4 LPMO协同BQR驱动醌氧化还原循环
  •   4.1 实验材料
  •     4.1.1 菌种
  •     4.1.2 培养基
  •     4.1.3 主要试剂
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 BQR的表达及分离纯化
  •     4.2.2 BQR的酶活测定
  • 2O2的测定方法'>    4.2.3 H2O2的测定方法
  •     4.2.4 铁还原力的测定方法
  •     4.2.5 羟自由基的测定方法
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 BQR的表达与纯化
  • 2O2'>    4.3.2 LPMO与 BQR协同产生H2O2
  •     4.3.3 LPMO与 BQR协同还原三价铁
  •     4.3.4 LPMO与 BQR协同产生羟自由基
  •   4.4 本章小结
  • 5 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录 攻读硕士学位期间发表论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 赵洪鹭

    导师: 张晓昱

    关键词: 裂解性多糖单加氧酶,醌氧化还原循环,葡萄糖脱氢酶,苯醌还原酶,反应,羟自由基

    来源: 华中科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 华中科技大学

    分类号: Q936

    DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.002730

    总页数: 83

    文件大小: 2611K

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