熊振海[1]2004年在《大环芳香配体配合物对正常和错配DNA结构识别作用的分子模拟》文中研究说明人体内众多的遗传机理都是基于对核酸的特异性识别，实现人工合成的小分子对DNA特定碱基序列的识别是化学、生物学和药学领域关注的焦点之一。大平面芳香过渡金属配合物作为探针对DNA二级结构的识别功能已经被广泛应用到医药开发和生物基础研究当中。然而，目前由于金属配合物种类很多，DNA结构多样性非常强，所以国际上关于部分金属配合物对DNA的识别机理仍然没有形成一致的观点。这种状况对新的有效配合物探针的开发非常不利。 本文过分子力学计算的方法，对这种识别过程建立模型，并且结合分子动力学研究各种识别作用，以求从分子水平上探讨它们的作用机理。课题意义在于从原子水平上对作用机理深入分析，而不仅仅局限于现象学的研究；同时，由于计算机建模比实验研究更快捷方便，我们就可以进行更多的体系，进行更广泛的研究，从而在统计的角度上总结规律。 在此前我们工作组关于[Co(phen)_2dppz]~(3+)对正常B-DNA序列识别作用的分子模拟研究基础上，在本工作中我们研究了应用较广泛的配合物[Ru(phen)_2dppz]~(n+)、[Co(phen)_2tpphz]~(n+)、[Co(phen)_2hpip]~(n+)和[Rh(bpy)_2Chrysi]~(3+)对正常和错配B型DNA序列的作用。在研究过程中，我们成功的模拟了国际上其他课题组对这些识别体系的实验结果。此外，通过对整个识别过程的作用能量考察，我们对各识别体系的详细作用进行了分析，对实验结果进行了合理的解释。 经过分子模拟研究，我们对国际上存在的关于该识别体系中的作用机理的争论进行了分析，提出了理论计算关于识别机理的观点，对争论的存在原因进行了解释。 具体来说，本论文包括的工作如下： 1．△、∧-[Co(phen)_2tpphz]~(3+)对B-DNA序列[d(GTCGATCGAC)_2]识别作用的分子模拟：金属配合物△，∧-[Co(phen)_2tpphz]~(3+)的插入配体tpphz由于比dppz配体具有更好的平面共轭作用，是一种良好的电子转移体，有望用来当作DNA电子转移体系的电子接受体。分子模拟研究标明，配合物只有从两对碱基对之间采用正面方式或者侧面方式插入小沟中才可以保证体系能量变化值小于零，也即保证二者相互作用的顺利进行；在立体选择性上，△-[Co(phen)_2tpphz]~(3+)更占优势。 2．∧、△-[Ru(phen)_2dppz]~(n+)对错配DNA序列d(CCGAATGAGG)_2识别作用的分子模拟，并且将其与△，∧-[Co(phen)_2dppz]~(n+)对正常序列DNA的识别作用进行对比，发现其对错配DNA中的错配区域的识别作用要比对正常序列DNA识别作用的更具特异性。研究结果表明：(1) 该识别作用具备位点特异性。金属配合物倾向于插入到博士论文山西人学错配位点上;(2)该识别作用是手性选择性的。金属配合物和DNA螺旋的空间作用和静电相互作用是导致手性选择的主要因素。相比之下△一【CO印hen)ZdPPz〕n+更占优势。但是由于两种手性配合物的插入能量差异不是太大，实验手段可能无法得到满意结果，这可能是导致国际上其他实验工作组研究结果不一致的原因所在:(3)沟选择性比较明显。从小沟插入要比从大沟插入优先。其中，电荷分布导致的静电相互作用是主要因素:(4)金属配合物插入之后，插入位点的双碱基对内碱基间距离增加了大约一倍。 3.A、△一[eo(phen)Zhpip]，+对错配DNA序列d(CCoAAToAoo):和其同源正常序列B一DNA d(ccTAATTAGG)2识别作用的分子模拟研究:对新配合物[C o(Phen)2帅iP]’+与正常和错配DNA序列相互作用的模拟结果表明，该配合物能够对错配DNA序列d(ccGAATGAGG)2中的错正常碱基对位点进行识别。这种识别作用具备手性和沟选择性。相比之下，A一[eo(phen)Zhpip]’+从小沟插入到oNA螺旋比其他插入方式更占优势。对详细能量项的考察结果说明，体系的电荷分布和空间阻力作用导致了手性选择性，其中电荷分布是主要因素。然而，空间作用是导致沟选择性的主要因素。 我们注意到，虽然只有碱基对AST6/TSA6与插入配体hPIP可以产生较强相互作用，但是配合物的尾部两个配体phen却与相邻的错配碱基对可能产生较强的作用。因此，这些错配碱基对的空间结构和静电势分布也必然影响识别结果。考虑到与金属配合物有较强相互作用并且对AST6/TSA6结构有明显影响的仅有两对相邻错配双碱基对，我们认为，此配合物应该是对类似一MMNNMM一(其中M表示错配碱基对、N表示正常碱基对)的序列片段可以进行特异性识别。 从本工作的结果来看，类似的正八面体平面芳香大环过渡金属配合物能够对DNA片断进行特异性识别，而不是针对部分双碱基对进行识别。在设计有效的插入配体时候，我们需要同时充分考虑静电荷分布和空间阻力的作用。 4.不同环境下模拟DNA螺旋结构的性能对比:由于此前的工作中发现真空环境下对DNA螺旋进行优化处理可能导致其结构损坏，本工作考察了amber、cvff.c的1、esff、mmZ五个力场分别在真空和水溶液环境下对DNA螺旋结构的优化情况。计算结果显示，在真空中进行的计算均会破坏DNA螺旋的部分碱基对配对，而在水溶液中，各力场的计算情况相差不大。这就提示我们，采用esff力场在水溶液环境中对本论文中的系列作用体系进行模拟是合理的，但是在真
张翠萍[2]2006年在《多吡啶类手性金属配合物与含Wobble错配DNA相互作用的分子模拟研究》文中指出具有G:C和A:T碱基配对的DNA双股螺旋是遗传信息储存、表达和稳定传递的重要载体。这一特异性配对方式有利于核酸结构的稳定。大沟、小沟中官能团的分布有利于蛋白酶、金属离子以及具有生物功能的金属配合物与DNA的作用。为了使遗传信息准确地传给下一代,DNA复制必须具有极高的精确性。然而,人类基因大约含有10~9个碱基对,任何对DNA物理或化学的破坏都会影响双螺旋结构的完整性,导致在DNA复制过程中的碱基错配或误配、非配对碱基和链的断裂等。 近年来,人们对小分子过渡金属多吡啶配合物与大分子DNA相互作用的研究逐步深入,已经成为生物无机化学领域十分活跃的研究课题,八面体多吡啶钌(Ⅱ)配合物广泛地被用于研究DNA二级结构识别探针、DNA分子光开关、DNA介导的电子转移、DNA断裂试剂等,这些能特异性识别DNA的小分子,为新型基因选择药物的研究打下了坚实的基础。 本文通过分子力学计算方法,对一些多吡啶类金属配合物与错配DNA的相互作用建立模型,以求从分子水平上探讨它们的作用机理。此前,我们工作组已经成功模拟了这类配合物对正常B-DNA和含G:A剪式错配DNA序列的识别作用。在本工作中,我们研究了应用较广泛的多吡啶类过渡金属钌配合物[Ru(phen)_2(hpip)]~(2+)、[Ru(phen)_2(dpq)]~(2+)、[Ru(phen)_2(dppz)]~(2+)、[Ru(IP)_2(dppz)]~(2+)等对含G:T错配的DNA序列的识别作用。通过对整个过程的作用能量考察,我们对各识别体系的详细作用进行了分析,对模拟结果进行了合理的解释。 具体来说,本论文主要包括以下几部分的工作: 1、△、Λ-[Ru(phen)_2hpip]~(2+)对含G:T错配的DNA序列d(CCATGCGTGG)_2识别作用的分子模拟研究:[Ru(phen)_2hpip]~(2+)具有两种构型,二者之间的能量差值处于室温可以提供的能量范围,因此,我们分别考虑了这两种共振结构可能带来的识别结果上的差异。模拟结果显
席小莉[3]2008年在《生物小分子与DNA相互作用的光谱及二维核磁的研究》文中研究指明癌症是目前危及人类生命的最主要疾病之一,在当今世界的疾病中,癌症的致死率要占到25%左右。科学家历经数代人的艰辛努力,正花很大力气来攻克这个危害人类健康的堡垒。目前治疗癌症普遍使用两种方法:一种是化学疗法;另一种是放射元素治疗;简称化疗和放疗。在化疗的过程中几乎所有的抗癌药物在杀伤癌细胞的同时也杀伤正常细胞。同样,放疗也会因为放射线在治疗癌症的同时给身体带来一定的伤害。因此,提高抗癌药物的选择性、研制开发高效低毒的抗癌药物就成为科学家们关注的焦点。对于治疗癌症我们还有第叁种路径可选择,那就是从基因水平上治疗。分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平理解某些生命现象,并通过分子设计来寻找灵敏的核酸探针和有效的治疗药物。绝大多数抗癌剂在生物体内的靶点是DNA分子,其作用方式大致分为叁种:(1)药物与模板DNA形成非共价复合物,主要与DNA以氢键相结合。当双链开始解离时,药物也随之从DNA上脱离。(2)药物与模板DNA形成共价复合物,主要与DNA以共价键相结合。若介于DNA的双链之间,则在双链之间形成交联,从而妨碍DNA双链的拆开。(3)选择性地与DNA结合,DNA双链结构变得不稳定,引起单链或双链断裂,降解模板DNA。由此可见,对DNA特定序列的断裂,应是抗癌剂高效杀灭癌细胞又保护正常细胞的主攻方向。人类基因组序列的揭示,为DNA特定序列的断裂提供了基础。研究表明,作为基因载体的DNA在聚合酶的错误复制、化学污染的侵袭、药物的滥用及电磁辐射的损伤下会产生碱基错配,通常细胞内的修复系统会及时将其修复,可一旦修复不成功,碱基错配将导致子系DNA的诱变,引发各种分子病,例如癌症等等。因此,作为分子病检测诊疗技术基础的DNA错配识别体系的开发和研究具有重要意义。由于小分子与核酸的键合能力非常强,而体积又小,易通过细胞膜进入细胞内部,直接与核酸作用,所以国际上已有很多课题组在研究小分子对核酸的识别,已经取得很大进展。核酸识别体系与核酸的作用方式有共价键合与非共价键合,如抗癌药物顺铂与核酸的作用为共价键合。而非共价键合的识别体系又分为两种,一种称为沟键合剂,其形状基本与核酸的大小沟互补,靠范德华力或与碱基形成氢键,在核酸的大沟或小沟处键合,如Distamycin,SN7167以及多胺类化合物;另一种称为插入剂,通常含有异环平面大配体,插入到核酸碱基对间,这种作用使得DNA的构型发生很大变化,如抗癌药物Nogalamycin(诺加霉素)以及本课题组和计亮年院士课题组一直研究的惰性金属多吡啶类混配配合物。美国的Barton教授课题组曾合成了一种铑的配合物[Rh(bpy)_2(chrysi)]~(3+),该配合物以插入方式与DNA键合,对单碱基C:C错配具有特异选择性。伯明翰大学Hannon教授课题组又发现了一种新的药物-核酸作用模式,即药物在“叁向连接DNA(3-way DNA junction)”的中心处键合,该工作已在Angewandte Chemie(2006 volume 45 issue 8 pages 1227-31)上发表。着名的生物化学家Stephen Neidle多年来一直致力于研究小分子对核酸的识别及抗癌药物的设计,在其新着的《Nucleic Acid Structure and Recognition》中也详细介绍了小分子对核酸的识别。我们课题组在研究中也发现了许多更有意义的切入点。特别值得提出的是,在所有的碱基错配中,剪式G:A错配构型多样,是最难识别和修复的,已有的研究结果表明,含剪式G:A错配的DNA比正常的B型DNA有较宽的小沟,而且核苷酸A从链内滑移出来,与互补链的核苷酸A形成交联堆积。因此本论文着重于设计合成并筛选出几种对G:A错配具有特异选择性的识别体系,并研究它们与这类寡聚核苷酸的精细、确切的作用情态。为分子病的检测提供某些实验和理论依据;由于不同的错配对应于不同的错配识别体系。DNA错配识别体系大都是一些含有芳香大环配体的手性金属配合物。其相互作用有不少的难点:其一,尽管核酸构型的多样性已逐渐被人们认识,但由于研究方法的局限性,目前对这一领域的认识还不完善、不系统、甚至不同的研究方法得出的结果也不同,因而对它们的识别研究是十分复杂的;其二,由于体系的相互作用是在溶液中的动态过程,通常是用光谱法研究它们与DNA或寡聚核苷酸的作用,而这种研究得出的直接信号是光谱的红移紫移、增色减色,得到的是一些现象学的间接结果,很难确证;鉴于以上两个原因,我们利用二维核磁的NOESY、TOCSY等图谱对它们的作用进行了研究。同时利用分子模拟,研究了构成识别体系的金属配合物与DNA相互作用的精细情态和规律,并揭示金属配合物与核苷酸相互作用的规律。我们设计了两处含G:A错配的十聚错配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)_2和正常的寡聚核苷酸d(CCTAATTAGG)_2,并合成了叁种金属配合物[Co(phen)_2(DPQ)]Cl_3;[Co(phen)_2(HPIP)]Cl_3;[Co(phen)_2(HNAIP)]Cl_3,然后用这叁种金属配合物与正常d(CCTAATTAGG)_2及错配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)_2的作用相对照,得出较满意的结果。同时我们还发现了一些小分子体系能够切割PBR322DNA,一些金属配合物能够对胃癌细胞株的活性具有很好的抑制效果。基于以上的工作,我们概括如下:1.我们首次发现6-苄氨基嘌呤可与Co~(2+)、Ni~(2+)形成稳定配合物,它们的存在影响药物分子与DNA之间的相互作用,本文从吸收光谱、荧光光谱、Scatchard图等方面研究了6-苄氨基嘌呤及其金属配合物与小牛胸腺DNA之间的相互作用,发现这些金属配合物与DNA都存在静电结合。同时,我们发现8-氮杂腺嘌呤可与Co~(2+)、Cu~(2+)形成稳定配合物,用同样方法我们发现,这些8-氮杂腺嘌呤的金属配合物与DNA都存在嵌插结合。2.我们发现现存的广谱抗癌药物(治疗L1210、P388白血病,肉瘤SA180,淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌,黑色素瘤B16,乳腺癌,路易斯肺癌以及结肠癌38等)—表柔比星可与Cu~(2+)形成2:5的稳定体系,并且通过紫外光谱、荧光光谱、粘度实验、DNA熔点实验、电化学实验以及切割实验发现表柔比星及表柔比星-Cu~(2+)体系与DNA之间的作用均为嵌插作用,同时表柔比星-Cu~(2+)体系能在1.0×10~(-5)mol·L~(-1)浓度下将pBR322DNA切割出明显的线性。3.我们首次合成了二水杨醛叁乙基四胺合镁(Ⅱ)配合物并应用紫外光谱、荧光光谱、粘度实验、DNA熔点实验、电化学实验以及切割实验对其与DNA的相互作用进行了研究。结果表明,该配合物与EB在DNA上的结合位点是非竞争型的,同时发现该配合物能在较低浓度(10~(-6)mol/L)下断裂pBR322质粒DNA,当配合物浓度达10×10~(-5)mol·L~(-1)时,可将pBR322质粒DNA切割为线性(formⅢ,linear带),说明该配合物具有较高的切割质粒DNA的活性。而且我们推测,二水杨醛叁乙基四胺合镁(Ⅱ)配合物对质粒DNA的作用很可能是水解切割,即其能较快地推动pBR322DNA磷酸二酯键的水解。这一结果为开发新的人工核酸酶、从分子水平上探讨配合物在药物的开发和分子生物学中的应用提供了有价值的信息。4.我们合成了[Ru(phen)_2tpphz](PF_6)_2·2H_2O及[Co(phen)_2tpphz]Cl(PF_6)_2·2H_2O两种配合物,并通过切割实验及细胞毒性实验首次发现[Ru(phen)_2tpphz](PF_6)_2·2H_2O及[Co(phen)_2tpphz]Cl(PF_6)_2·2H_2O均可导致胃癌细胞活性不同程度的降低,1nM[Co(phen)_2tpphz]Cl(PF_6)_2·2H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低22.2%;1μM[Co(phen)_2tpphz]Cl(PF_6)_2·2H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低30.6%。1nM[Ru(phen)_2tpphz](PF_6)_2·2H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低25.2%;1μM[Ru(phen)_2tpphz](PF_6)_2·2H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低48.6%。这一结果说明所合成的[Co(phen)_2tpphz]Cl(PF_6)_2·2H_2O及[Ru(phen)_2tpphz](PF_6)_2·2H_2O配合物对癌细胞有很好的抑制作用。电泳实验表明它们均能在很低的浓度(5×10~(-6)mol·L~(-1))将pBR322 DNA切割为线性。5.我们利用二维核磁研究了叁种金属配合物[Co(phen)_2(HPIP)]Cl_3;[Co(phen)_2(HNAIP)]Cl_3;[Co(phen)_2(DPQ)]Cl_3分别与错配d(CCGAATGAGG)_2及正常d(CCTAATTAGG)_2的十聚寡聚核苷酸的作用,结果发现:对于配合物[Co(phen)_2(HPIP)]Cl_3,在其与错配寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们看出,由于NOE相关峰主要来自于错配G:A附近区域的大沟质子,例如相关峰T6H6/A5H2'的消失,相关峰A8H8/G7H4'的减小,都说明[Co(phen)_2(HPIP)]~(3+)从“大沟”插入到错配G:A附近的碱基对,从而影响到附近碱基对的相关峰,近一步的指认我们可以确定[Co(phen)_2(HPIP)]~(3+)插入到碱基对T_6G_7之间。[Co(phen)_2(HPIP)]~(3+)与正常寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们看出,[Co(phen)_2(HPIP)]~(3+)从小沟与正常寡聚核苷酸的端基作用。~(31)P NMR表明配合物的加入没有改变正常寡聚d(CCTAATTAGG)_2的磷酸骨架。由分子模拟可以得知配合物[Co(phen)_2HPIP]~(3+)对正常及剪式错配DNA都具有识别作用,识别的过程体现了异构体的选择性、DNA沟的选择性和位点特异性,在识别错配序列DNA的过程中手性选择性不明显,优先选择配合物结构形式Ⅱ与DNA在T_6G_7大沟发生作用;与正常DNA的相互作用优先选择配合物结构形式Ⅰ,在小沟端基发生作用,同时右手异构体会被富集。以上这些结果表明,分子模拟能够与二维核磁实验很好的吻和。对于[Co(phen)_2(DPQ)]Cl_3,在NOESY谱上,我们可以看到许多[Co(phen)_2(DPQ)]Cl_3与错配及正常寡聚核苷酸作用的NOE相关峰。对于错配寡聚核苷酸,NOE相关峰主要来自于端基G:C质子,我们判定配合物[Co(phen)_2(DPQ)]~(3+)主要从小沟与G:C区域作用,并且插入不深。对于正常寡聚核苷酸,数据表明[Co(phen)_2(DPQ)]~(3+)从小沟插入到碱基对T3/A4间。由于核苷酸G_4和A_5糖环上H4'与H5'/H5”共振的重迭,不可能清晰地归属为哪个核苷酸,但是出现的NOE相关峰表明配合物确实是插入键合。与这一插入模型相一致的是DPQ与大沟质子T_3CH_3的NOE相关峰,表明OPQ体系从小沟横跨堆积的碱基对而延伸到大沟里。~(31)p NMR表明配合物的加入没有使得DNA的构型发生显着的改变。分子模拟结果显示[Co(phen)_2(DPQ)]~(3+)与错配寡聚DNA d(CCGAATGAGG)_2作用时,作用在小沟,端基,同时左手异构体与错配寡聚的作用更加稳定,能量更低,左手异构体会被富集;与正常d(CCTAATTAGG)_2寡聚核苷酸作用在小沟的T_3A_4区作用,同样左手异构体会被富集。这些结果与实验结果非常一致。对于[Co(phen)_2(HNAIP)]~(3+),在其与错配寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们看出,[Co(phen)_2(HNAIP)]~(3+)从“大沟”插入到碱基对G_3A_4、G_7A_8之间或它们附近的T_6G_7之间,这有待于分子模拟进一步给出详细的作用的情况。在[Co(phen)_2(HNAIP)]~(3+)与正常寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们没有看到相关峰,或许由于配合物的尺寸问题,这有待进一步证实其原因。同时~(31)P NMR表明配合物的加入没有改变DNA的构型。
参考文献：
[1]. 大环芳香配体配合物对正常和错配DNA结构识别作用的分子模拟[D]. 熊振海. 山西大学. 2004
[2]. 多吡啶类手性金属配合物与含Wobble错配DNA相互作用的分子模拟研究[D]. 张翠萍. 山西大学. 2006
[3]. 生物小分子与DNA相互作用的光谱及二维核磁的研究[D]. 席小莉. 山西大学. 2008
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