周知午1王畅2
1湖南省中医药研究院附属医院；2湖南中西医结合医院410006
【摘要】目的：对壮、瑶药小槐花中异柠檬酚进行分离鉴定并测定其含量。方法：采用硅胶色谱柱分离纯化法在小槐花中分离出异柠檬酚，采用高效液相色谱法（HPLC）对异柠檬酚的含量进行测定。结果：异柠檬酚在0.010～0.244ug范围内的进样量与其峰面积呈较好的线性关系，异柠檬酚的加样总体平均回收率为99.87%，相对标准误差RSD为1.34%。结论：采用高效液相色谱（HPLC）法测定小槐花中异柠檬酚的含量具有操作简单、结果准确、稳定性好等特点，为制定小槐花质量标准及现代化中医研究提供参考，为研究异柠檬酚含量测定提供依据。
【关键词】小槐花；异柠檬酚；高效液相色谱；分离鉴定
小槐花[1，2]又名草鞋板、羊带归、味噌草等，属于豆科山蚂蟥属植物，是壮族、瑶族常用的药材之一，其根或全株均可入药。壮医理论认为，小槐花具有清热毒、止血、通气利湿之功效，因此常用于治疗胃痛、肠胃炎、腹泻、小儿疳积、风湿关节痛、乳腺炎以及外用治毒蛇咬伤等。瑶医则认为小槐花具有清热解毒、消积趋于、健脾开胃的功效，常用于治疗吐血、水肿、感冒、咳嗽、胃痛、跌打损伤、痈疖疔疮等疾病。随着现代中医学的发展，对小槐花药材的有效成分及治病机理进行研究成为众多学者的研究的热点[3]。成为小槐花药材为了探究小槐花药材中化学成分及含量，本研究对小槐花样本进行分离提纯，并采用高效液相色谱法对主要化学物质异柠檬酚进行含量测定，旨在为壮、瑶医学的诊断及小槐花的治病机理提供参考。
1材料与仪器设备
1.1材料
本研究所采用的小槐花药材样本取自广西中医药研究院中药房，药材样本经鉴定确定为小槐花。研究中所采用的异柠檬酚对照样本取自小槐花提取物，经样本结构鉴定以及高效液相色谱分析其含量大于98%。
1.2仪器与设备
高效液相色谱仪（生产企业：苏州光谱仪器有限公司，型号：天瑞SkyrayLC-310LC310）、色谱工作站（生产企业：赛智科技（杭州）有限公司，型号：HS2000）、红外光谱仪（生产企业：北京卓乐康科技有限公司，型号：ZLKTJ270-30A）、分析天平（生产企业：海特勒托力有限公司，型号：XS205）、数控超声波清洗器（生产企业：上海弘兴超声电子仪器有限公司，型号：CQ-25-48）、循环水式多用真空泵（生产企业：郑州长城科工贸有限公司，型号：SHB-Ⅲ）等。
1.3研究方法
1.3.1分离与结构鉴定
取小槐花药材15kg，充分粉碎后采用95%乙醇进行回流式提取，连续提取5次，每次2小时，获取小槐花混悬液[4]。之后采用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，取石油醚部位进行硅胶色谱分离，按照石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱[5]，经过反复多次的柱层分析后获取重结晶物质共50mg。对所获取的重结晶物质进行结构鉴定，并与异柠檬酚样本结构对照确定重结晶物质为异柠檬酚。
1.3.2含量测定
设定高效液相色谱仪参数如下：采用250mm×4.6mm，5um色谱柱，流动相流速设定为1ml/min，检测波长设定为270nm，柱温设定为35℃。配置对照样品溶液，取异柠檬酚对照品10mg，使用甲醇溶解并定容至0.22mg/mL的对照品溶液[6，7]。精密量取对照品溶液1ml，采用甲醇稀释至0.011mg/mL的对照样品溶液。测试样品溶液的制备如下：取小槐花药材充分粉碎，取药材粉末2g，精确称取后加入甲醇，采用超声波震荡1小时后冷却放置。之后取甲醇补足溶液并进行过滤处理，滤液即可用于测定。取对照样品溶液，采用高效液相色谱分析法进行测定，并采用不同体积进量，根据样品进样量与色谱峰面积绘制标准曲线，并进行线性规划拟合方程，给出异柠檬酚进样量与峰面积呈线性关系的区间[8]。取0.011mg/mL异柠檬酚样品溶液以不同的体积进样进行色谱测定，检测仪器的精度。选取同一样品溶液，分别在0、2、4、6、8、10h进样测定，分析异柠檬酚峰面积以及RSD，分析样品溶液的稳定性。最后即可取待测试验样品（0.22mg/mL，1ml）5份，按照高效液相色谱分析法进行异柠檬酚含量测定，计算加样的回收率以及RSD值。
2结果
通过对对照样品进行高效液相色谱研究，以进样量与色谱峰面积绘制标准曲线，经线性回归计算得到回归方程为Y=3350000X-1250.5，R=1.0。结果显示在0.010～0.244ug范围内呈明显的线性关系。采用对照样品多次进样测定，RSD为0.133%，验证了仪器的精度符合研究要求。同时也验证了样品溶液的稳定性。之后利用制备的样品溶液（0.22mg/mL，1ml）进行5次测定，计算得到的平均回收率为99.87%，RSD为1.34%。详见表1。
3讨论
小槐花是壮族、瑶族中医学常用的药材之一，且在当地的分布较广，应用较普及。然而，目前尚无关于小槐花药材的质量标准，不利于小槐花药材的现代化中医制剂的发展[9，10]。因此，对小槐花药材的主要药物成分进行分离并测定，为制定小槐花质量标准以及促进小槐花的现代化医学发展具有重要意义。
本研究通过对小槐花中的黄酮类化合物提取物进行硅胶色谱分离，确定了此黄酮类化合物为异柠檬酚。目前，关于异柠檬酚的相关研究较少，且集中在关于异柠檬酚的分离纯化技术、利用异柠檬酚抗肿瘤效果研究等。关于对异柠檬酚的测定研究尚属少见。本文通过采用高效液相色谱分析法对提取的小槐花药材溶液提取物进行测定，使用甲醇将提取物制备溶液，利用超声震荡1小时便可取得良好的提取效果。本研究通过采用高效液相色谱分析法进行异柠檬酚的含量测定，结果表明，异柠檬酚在0.010～0.244ug范围内的进样量与其峰面积呈较好的线性关系，异柠檬酚的加样总体平均回收率为99.87%，相对标准误差RSD为1.34%。
总之，利用高效液相色谱分析法对小槐花内异柠檬酚含量进行测定具有操作简单、稳定性好、精度高等优势，通过对小槐花中异柠檬酚含量的测定，为制定小槐花质量标准提供了参考，为小槐花药材的现代化中医药研究提供了依据。
参考文献：
[1]李燕婧，钟正贤，卢文杰，等.小槐花醇提物药理作用研究[J].云南中医中药杂志，2013，34（5）：64-65.
[2]李燕婧，钟正贤，卢文杰，等.小槐花水提物药理作用研究[J].中医药导报，2013，19（4）：76-77.
[3]成林，刘吉成，卢森华，等.HPLC测定小槐花药材中山柰酚的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（15）：92-94.
[4]彭俊文，朱晓伟，陈建平，等.黄花蒿中黄酮类成分的分离鉴定[J].内蒙古医学院学报，2011，33（2）：152-154.
[5]叶秀金，宋粉云.HPLC测定清肺抑火丸中盐酸小檗碱的含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（3）：90-92.
[6]耿旦，马雯芳，甄汉深，等.RP-HPLC测定桑椹中芦丁的含量[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（14）：63-65.
[7]毛晓霞，苗光新，赵春颖，等.赤雹根中DubiosideF的分离纯化及含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（24）：43-46.
[8]吕鹏，贾秀梅，张振凌，等.怀山药及非药用部位总黄酮含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（2）：65-68.
[9]邹江冰，孔秋玲，陈龙浩，等.不同产地紫果西番莲叶中总黄酮的含量测定[J].医药导报，2012，31（3）：348-349.
[10]孙小慧，田海妍，闫研，等.鸦胆子油中β-谷甾醇的分离与含量测定[J].暨南大学学报（自然科学与医学版），2014，35（6）：519-524.