碳代谢阻遏基因snf1和Reg1调控黄曲霉生长发育和黄曲霉毒素合成

论文摘要

黄曲霉毒素具有强致癌性和强毒性,严重威胁食品安全和人畜健康。碳代谢阻遏物（CreA）是真菌碳代谢过程关键调控因子,是协调水解酶合成分泌、碳代谢和次级代谢产物合成的关键节点。AMP依赖的蛋白激酶（SNF1）和磷酸酶Ⅰ（Reg1）可调控CreA磷酸化水平,影响CreA细胞定位和功能。本研究通过构建缺失突变株,解析SNF1和Reg1对黄曲霉生长发育、碳源利用和黄曲霉毒素合成的调控作用。主要结论如下:（1）在黄曲霉野生株NRRL3357中敲除snf1基因后,突变株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、果胶和微晶纤维素培养基中,菌落直径普遍变小,菌落颜色变浅,分生孢子量减少。敲除Reg1基因后,在葡萄糖、蔗糖、海藻糖、果胶和微晶纤维素培养基上,菌落直径比出发菌株小,孢子量减少;在淀粉培养基上,菌落直径略微变大,孢子在菌落边缘形成完整的环状。结合显微观察实验的结果,表明SNF1和Reg1正调控黄曲霉的生长和分生孢子的正常发育。（2）淀粉培养基上,Δsnf1菌落直径减小,ΔReg1菌落直径变大,SNF1和Reg1可能通过碳代谢抑制因子CreA影响淀粉酶表达,Reg1基因敲除后导致核内CreA含量下降,诱导淀粉水解酶的表达分泌,而snf1基因敲除后导致核内CreA含量上升,抑制淀粉水解酶的表达分泌。果胶、微晶纤维素多糖培养基上,Δsnf1和ΔReg1生长速度出现差异都呈现下降趋势,SNF1和Reg1通过其他途径参与胞外水解酶表达调控。（3）对突变株Δsnf1和ΔReg1黄曲霉毒素B1（AFB1）产量分析发现,AFB1产量均下降,降低率分别为80.2%,77.4%（以产毒培养基YES为例）,表明SNF1和Reg1对毒素AFB1合成具有正调控作用。（4）分析突变株Δsnf1和ΔReg1毒素合成相关基因aflD、aflM、aflO、aflP和转录因子aaflS/flR基因和调控分生孢子转录基因brlA、abaA的转录水平可以知道:snf1、Reg1基因敲除后下调转录因子aflS/aflR的转录表达水平,进而结构基因转录受到抑制,最终引起毒素合成受阻。在aflS/aflR启动子区存在CreA结合位点,SNF1和Reg1缺失后影响CreA磷酸化水平,扰乱CreA在核质间的动态平衡,影响转录因子aflS/aflR的转录表达水平。在Δsnf1和ΔReg1突变体中,参与调控分生孢子形成发育基因呈现下调。snf1基因缺失引起分生孢子滞后发育形成,结合显微观察发现分生孢子缺陷。因此我们推断,snf1调控分生孢子的准备阶段,该基因缺失导致生长分化相关基因下调,如brlA、abaA转录抑制造成分生孢子滞后发育。（5）采用侵染花生实验,研究黄曲霉SNF1和Reg1缺失对黄曲霉侵染定殖力的影响。研究发现,snf1缺失后花生表面几乎没有黄曲霉生长,黄曲霉侵染定殖受到极大程度抑制,并且检测不到AFB1。Reg1缺失后花生少部分表面被黄曲霉包裹,生长受到抑制,AFB1含量急剧下降。表明SNF1和Reg1对于黄曲霉侵染定殖能力具有正调控作用。SNF1和Reg1影响水解酶,如淀粉酶、果胶酶等的表达分泌,最终削弱黄曲霉侵染和定殖能力,比较而言SNF1缺失对黄曲霉侵染定殖能力造成的影响更大。本研究结果为黄曲霉毒素污染风险评估及防控技术开发奠定一定的理论基础。

论文目录

摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 黄曲霉及黄曲霉毒素简介

1.1.1 黄曲霉

1.1.2 黄曲霉毒素及污染现状

1.1.3 碳代谢阻遏路径CCR

1.1.4 关键调控因子

1.1.5 染色质修饰与CCR

1.1.6 CCR对真菌生长发育、次级代谢产物合成及碳源利用的影响

1.1.7 碳代谢阻遏与碳源利用

1.2 研究目的及意义

1.3 主要研究内容

第二章 Snf1、Reg1 调控黄曲霉生长发育和黄曲霉毒素合成

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 菌株

2.2.2 质粒

2.2.3 培养基、培养方法和菌株保存

2.2.4 常用缓冲液

2.2.5 主要生化试剂和仪器

2.2.6 敲除盒的构建

2.2.7 孢子萌发

2.2.8 原生质体的制备与转化

2.2.9 基因组DNA提取

2.2.10 转化子验证

2.2.11 保菌

2.2.12 表型点板试验

2.2.13 菌丝形态观察

2.2.14 黄曲霉毒素产量分析

2.2.15 菌核形成分析

2.2.16 qRT-PCR

2.2.17 数据整理分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 黄曲霉Snf1、Reg1 的生物信息学分析

2.3.2 敲除盒的构建

2.3.3 敲除株的构建

2.3.4 snf1、Reg1 对黄曲霉生长发育的影响

2.3.5 snf1、Reg1 对黄曲霉分生孢子形成的影响

2.3.6 snf1、Reg1 对黄曲霉毒素合成的影响

2.3.7 snf1、Reg1 对黄曲霉菌核生成的影响

2.3.8 snf1、Reg1 对毒素合成相关基因和分生孢子形成调控基因转录的影响

2.3.9 snf1、Reg1 对碳源响应

2.4 本章小结

第三章 Snf1、Reg1 调控影响黄曲霉侵染花生

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 菌株

3.2.2 培养基和培养方法

3.2.3 主要生化试剂和仪器

3.2.4 花生等温稀释曲线

3.2.5 花生水活度调节

3.2.6 花生定殖表型实验

3.2.7 花生带菌量测定

3.2.8 毒素产量分析

3.2.9 扫描电镜观察

3.2.10 数据整理分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 花生等温稀释曲线分析

3.3.2 电镜结果分析

3.3.3 snf1和Reg1 对黄曲霉侵染能力的影响

3.4 本章小结

第四章结论与展望

4.1 主要结论

4.2 创新点

4.3 展望

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王平

导师: 邢福国

关键词: 碳代谢阻遏,黄曲霉毒素合成,生长发育

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发项目“生鲜食用农产品水活度和微生物调控品质劣变机理”(2016YFD0400105)

分类号: Q933

总页数: 69

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