论文摘要
荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是多种冷藏水产品的特定腐败菌（Specific Spoilage Organism,SSO）,它能够在低温环境下生长繁殖并产生极耐热的蛋白酶和脂肪酶,引起食品腐败变质。P.fluorescens还能产成大量的生物被膜,帮助细菌躲避不利因素的危害并使细菌形成耐药性。生物被膜一旦形成,则很难彻底去除,给食品安全造成巨大威胁。在食品加工过程中进行普通的消毒对除去生物被膜是无济于事的,由于细菌会对杀菌剂的抵抗力不断增强,因此需要发展新的方法来控制细菌产生的生物被膜以及对食品的致腐能力。研究表明,荧光假单胞菌的多种与食品腐败相关的特性都受到其群体感应（Quorum Sensing,QS）系统的调控。因此,寻找群体感应抑制剂（Quorum Sensing Inhibitor,QSI）来干扰QS所参与或调控的生理活动,可能为消除细菌的耐药性、延长食品的货架期提供可能的途径。但是,传统方法来寻找QSI往往是随机的,效率低、成本高,且需要大量的实验,而计算机辅助筛选QSI则恰好可以解决这一问题。鉴于此,本研究以荧光假单胞菌为研究对象,以其QS系统为靶点,通过同源建模、虚拟筛选、分子对接等方法,更加直观、便捷地寻找新的QSI,并对其抑制机理进行探究,最后,将筛选到的QSI与静电纺丝技术结合,将其应用到水产品保鲜中,为探究荧光假单胞菌的QS系统调控的致腐机理以及寻找新的延长水产品货架期、增强水产品安全性的方法提供参考。主要结果如下:（1）通过对荧光假单胞菌进行全基因组测序及基因注释,得到了其QS系统的LuxI型和LuxR型蛋白的氨基酸序列。通过同源建模方法得到了受体蛋白的三维结构。用SAVES、QMEAN等方法对所建的蛋白模型的质量进行评价,发现所建的蛋白模型具有较好的质量。（2）以LuxI型和LuxR型蛋白为对接靶点,从传统中药化合物数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）中筛选潜在的QSI。结果发现,有10种物质具有群体感应抑制活性（命中率66.67%）。苯甲醇、甲酸玫瑰酯、玫瑰醇和鱼腥草素等物质具有很强的QS抑制活性。活性最强的苯甲醇对P.fluorescens P07的群体感应表型具有显著的抑制效果。分子对接技术分析其对QS系统的抑制机理,发现苯甲醇的抑制机理可能是由于其紧密地结合到LuxI型蛋白中,从而阻断了P.fluorescens P07信号分子的产生并阻断了其QS通路,从而达到抑制的效果。（3）为了筛选更加安全高效的QSI,我们以LuxI型和LuxR型蛋白为对接靶点,从食物组分数据库中筛选潜在的QSI。结果发现,有19种物质具有QS抑制活性（命中率76.00%）。其中,（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素、没食子酸丙酯、橙皮苷、番茄红素以及茄尼醇等物质具有很强的QS抑制活性。具有最强QS抑制活性的（+）-儿茶素对P.fluorescens P07的胞外蛋白酶产生、泳动性、生物被膜以及EPS的形成具有显著的抑制效果。（4）分别用基于分子相似性、基于配体和受体药效团模型的方法,从ChEBI、ChEMBL、中药数据库（TCM Database@Taiwan）和ZINC天然产物数据库中筛选P.fluorescens P07的QSI。结果发现了丙酸-2-苯乙酯、和厚朴酚、厚朴酚、尼泊金乙酯、姜酮、愈创木酚、辛可尼丁、水杨苷、柠檬醛、香兰素、褪黑素、10-十一烯酸以及（L）-（+）-酒石酸二乙酯等具有较强的QS抑制活性的物质。（5）用具有较强QS抑制活性的香兰素处理P.fluorescens P07并检测其对细菌的群集性、生物被膜以及EPS的影响,并利用转录组学探究其抑制机理。结果发现,香兰素对于P.fluorescens P07的群集性、生物被膜以及EPS均具有显著的抑制效果。转录组学测试发现经香兰素处理后,细菌的差异表达基因上调的有92个,下调的有87个。细菌生物被膜的减少是香兰素对细菌的运动性、粘附性、趋化性、EPS的含量以及QS系统等多种因素影响所致。（6）通过将静电纺丝技术与筛选到的QSI相结合,制备了PLA–没食子酸丙酯以及PCL–表儿茶素同轴静电纺丝纤维,对制备的纳米纤维进行表征并测试其对冷藏条件下三文鱼片中P.fluorescens P07的致腐性的抑制效果。结果发现,制备的静电纺丝纤维直径较小,表面光滑,无串珠及其他缺陷,并具有核-壳结构。通过对纺丝纤维的性能进行表征,发现其热稳定性、拉伸强度等性能均能满足冷藏条件需要,且纤维能很好地包裹QSI并具有缓释行为。载有QSI的纺丝纤维在没有抑制三文鱼片中细菌的生长的前提下,对鱼片中挥发性盐基氮（Total Volatile Basic Nitrogen,TVB-N）、三甲胺（Trimethylamine,TMA）以及细菌水溶性胞外多糖的生成能力都显示了显著的抑制效果,并显著延缓了三文鱼片中Ca2+-ATPase活性的降低速度和三文鱼片肌肉组织的劣变速度。载有QSI的纺丝纤维对细菌的致腐能力也有显著的抑制作用。
论文目录
摘要Abstract中英文缩写词对照表第一章 绪论 1.1 细菌群体感应系统概述 1.1.1 细菌的群体感应系统分类及作用机制 1.2 水产品中腐败菌的群体感应现象 1.2.1 水产品腐败菌 1.2.2 水产品腐败菌的群体感应现象 1.3 群体感应抑制剂研究进展 1.3.1 QSI的作用途径 1.3.2 目前已发现的QSI 1.4 计算机辅助QSI虚拟筛选与设计 1.5 论文立题背景及意义 1.5.1 课题研究目的及依据 1.6 论文的主要研究内容第二章 荧光假单胞菌全基因组序列测定及LuxI/R型蛋白模型的建立及评价 2.1 前言 2.2 试验材料与设备 2.2.1 主要试剂 2.2.2 菌株 2.2.3 主要仪器和设备 2.3 实验方法 2.3.1 荧光假单胞菌基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳 2.3.2 文库构建及库检 2.3.3 细菌基因组组装及注释 2.3.4 同源建模 2.3.5 模型质量评价 2.4 结果和讨论 2.4.1 全基因组测序结果 2.4.2 同源建模结果 2.4.3 模型质量评价 2.5 本章小结第三章 传统中药数据库虚拟筛选荧光假单胞菌群体感应抑制剂及抑制机理探究 3.1 前言 3.2 实验材料及仪器 3.2.1 主要试剂 3.2.2 菌株与试剂 3.2.3 主要仪器和设备 3.3 实验方法 3.3.1 QSI虚拟筛选 3.3.2 所筛选物质最小抑菌浓度测定 3.3.3 QS抑制活性验证 3.3.4 荧光假单胞菌P.fluorescens P07 信号分子的提取 3.3.5 荧光假单胞菌P.fluorescens P07 群体感应现象检测 3.3.6 苯甲醇对荧光假单胞菌P.fluorescens P07 群体感应表型的影响 3.3.6.1 苯甲醇对P.fluorescens P07 泳动性和群集性的影响 3.3.6.2 苯甲醇对P.fluorescens P07 胞外蛋白酶产量的影响 3.3.6.3 苯甲醇对P.fluorescens P07 嗜铁素产量的影响 3.3.6.4 苯甲醇对P.fluorescens P07 信号分子产量的影响 3.3.6.5 苯甲醇对P.fluorescens P07 生物被膜的影响 3.3.6.6 苯甲醇对P.fluorescens P07 胞外聚合物的影响 3.3.7 苯甲醇对P.fluorescens P07的QS系统抑制机理探究 3.3.8 数据分析 3.4 结果和讨论 3.4.1 QSI虚拟筛选结果 3.4.2 苯甲醇对P.fluorescens P07 的泳动性、群集性、嗜铁素以及胞外蛋白酶产量的影响 3.4.3 苯甲醇对P.fluorescens P07 信号分子产量的影响 3.4.4 苯甲醇对P.fluorescens P07 生物被膜的影响 3.4.5 苯甲醇对P.fluorescens P07的EPS产量的影响 3.4.6 分子对接分析苯甲醇对P.fluorescens P07的QS系统的抑制机理 3.5 本章小结第四章 基于分子对接技术从食物源组分数据库虚拟筛选荧光假单胞菌群体感应抑制剂 4.1 前言 4.2 实验材料及仪器 4.2.1 主要试剂 4.2.2 菌株与试剂 4.2.3 主要仪器和设备 4.3 实验方法 4.3.1 虚拟筛选 4.3.2 所筛选物质最小抑菌浓度测定 4.3.3 所筛选小分子的QS抑制活性验证 4.3.4 （+）-儿茶素对P.fluorescens P07的QS表型的影响 4.3.5 （+）-儿茶素对P.fluorescens P07 的生长曲线的影响 4.3.6 （+）-儿茶素对P.fluorescens P07的QS系统的抑制机理探究 4.3.7 数据分析 4.4 结果和讨论 4.4.1 QSI虚拟筛选结果 4.4.2 小分子物质的QS抑制活性测试 4.4.3 （+）-儿茶素对P.fluorescens P07 胞外蛋白酶的产生、生物被膜、泳动性以及EPS的影响 4.4.4 （+）-儿茶素的QS抑制机理探究 4.5 本章小结第五章 基于分子相似性和配体/受体药效团模型方法虚拟筛选荧光假单胞菌群体感应抑制剂 5.1 前言 5.2 实验材料及仪器 5.2.1 主要试剂 5.2.2 菌株与试剂 5.2.3 主要仪器和设备 5.3 实验方法 5.3.1 基于配体的药效团模型的构建、评价及虚拟筛选 5.3.2 基于受体的药效团模型的构建、评价及虚拟筛选 5.3.3 基于分子相似性的虚拟筛选 5.3.4 所筛选物质最小抑菌浓度测定 5.3.5 所筛选小分子物质QS抑制活性验证 5.4 结果和讨论 5.4.1 基于配体的药效团模型构建及验证结果 5.4.2 基于配体的药效团模型虚拟筛选结果 5.4.3 基于受体的药效团模型的构建 5.4.4 基于受体的药效团模型验证 5.4.5 基于受体的药效团模型虚拟筛选结果 5.4.6 基于分子相似性的虚拟筛选结果 5.5 本章小结第六章 香兰素对荧光假单胞菌生物被膜产生的抑制作用及转录组学研究 6.1 前言 6.2 实验材料及仪器 6.2.1 主要试剂 6.2.2 主要仪器和设备 6.3 实验方法 6.3.1 香兰素最小抑菌浓度确定 6.3.2 香兰素对P.fluorescens P07 的群集性、生物被膜以及EPS的影响测定 6.3.3 转录组学研究 6.3.4 实时荧光定量PCR验证 6.3.5 数据分析 6.4 结果和讨论 6.4.1 香兰素对P.fluorescens P07 的群集性、生物被膜以及EPS的影响 6.4.2 转录组学检测结果 6.4.2.1 测序数据过滤结果 6.4.2.2 De novo组装结果 6.4.2.3 Unigene功能注释结果 6.4.2.4 差异表达基因检测结果 6.4.2.5 DEG进行GO功能分析结果 6.4.2.6 DEG的 Pathway功能分析结果 6.4.3 实时荧光定量PCR验证结果 6.5 本章小结第七章 同轴聚乳酸-没食子酸丙酯及聚己内酯-表儿茶素纳米纤维的制备、表征及应用 7.1 前言 7.2 实验材料及仪器 7.2.1 主要试剂 7.2.2 主要仪器和设备 7.3 实验方法 7.3.1 同轴电纺纳米纤维膜的制备 7.3.2 静电纺丝纤维表征 7.3.3 静电纺丝纤维对三文鱼片保鲜效果探究 7.3.4 数据分析 7.4 结果和讨论 7.4.1 静电纺丝纤维的制备及表征 7.4.2 静电纺丝纤维对三文鱼片的保鲜效果 7.5 本章小结主要结论与展望 主要结论 展望论文创新点致谢参考文献附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文
文章来源
类型: 博士论文
作者: 丁婷
导师: 励建荣
关键词: 荧光假单胞菌,虚拟筛选,生物被膜,群体感应,静电纺丝
来源: 江南大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,轻工业手工业
单位: 江南大学
基金: 国家自然基金(No.31471639,31301572),国家重点研究开发计划(No.2017YFD0400106)
分类号: TS201.3
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标签：荧光假单胞菌论文; 虚拟筛选论文; 生物被膜论文; 群体感应论文; 静电纺丝论文;
基于荧光假单胞菌群体感应的抑制剂筛选及抑制机理探究
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