郑山根[1]2003年在《LPS多表位模拟肽及抗原性的研究》文中提出脂多糖是引起革兰氏阴性菌败血症休克的重要始动因素之一，目前尚无理想的拮抗LPS或类脂A制剂。虽然抗LPS抗体可拮抗LPS而具保护性，但临床上抗体的应用时机难以掌握。因此，建立针对内毒素的主动免疫是防治内毒素血症及败血症休克的重要途径之一。 LPS属TI-Ⅰ抗原，不能诱导有效的再次应答及高亲和力、调理杀菌力强的抗体的产生，加之LPS存在众多菌株及血清型特异性，因此研制有效的、具广谱保护性的LPS疫苗有一定困难。本文拟用对革兰氏阴性菌感染具交叉保护作用的抗LPS单克隆抗体和多克隆抗体从噬菌体肽库中筛选多个LPS表位模拟肽，进行人工合成及原核表达。具体目标如下：(1)获得LPS表位模拟肽，将LPS的多糖(TI)表位变为多肽(TD)表位，诱导有效的再次应答；(2)获得模拟LPS多个表位的多肽，诱导针对多种革兰氏阴性菌及其LPS的交叉保护力，即广谱预防作用；(3)基因表达模拟肽的融合蛋白，探索制备短肽疫苗更有效、经济的途径。 本研究分为以下四部分： 一、交叉保护性抗LPS多克隆抗体及单克隆抗体的制备和鉴定 经特殊处理的鼠伤寒沙门氏菌免疫大白兔，获得了既能与鼠伤寒沙门氏菌LPS反应，又能与大肠菌LPS(L2630)，尤其是具保守结构的LPS如明尼苏达沙门氏菌Re595株LPS(L9764)和Lipid A(L0744和L5399)有较好交叉反应的兔多克隆抗血清。 细菌攻击试验表明，兔抗血清对大肠杆菌和绿脓杆菌感染小鼠分别具有非常显着(P＜0.005，表4)和显着的(P＜0.05，表5)交叉保护性。亲和纯化制备的抗鼠伤寒沙门氏菌LPS单抗和多抗，约10ng／ml水平可检出1μg／mlLPS，具较好的抗体活性，可作为筛选噬菌体肽库的靶分子。 二、LPS多表位模拟肽的筛选与鉴定 用纯化的抗鼠伤寒沙门氏菌LPS单抗，对噬菌体随机环七肽库进行了筛选，经ELISA鉴定，所挑选的克隆中有34个克隆显示与单抗有较强结合；竞争抑制试验表明，阳性噬菌体克隆与多抗结合可被浓度低达。.spg/ml的鼠伤寒沙门氏菌LPS抑制。挑选其中10个克隆，经DNA测序获得了六种序列，相应的氨基酸序列分别为PSWASFW、PEWASSW、PAWAS柳、MSWFP户Y、QSWF[PY和PPGwPGF。 为获得模拟LPS多表位的噬菌体展示肤，用纯化的抗鼠伤寒沙门氏菌LPS多抗筛选噬菌体随机环七肤库，经鉴定，所挑选的克隆中有20个显示与多抗有较强结合。竞争抑制试验表明阳性克隆与多抗结合可被浓度低达。.5阳/m1的鼠伤寒沙门氏菌LPS抑制。挑选其中10个阳性克隆，经DNA测序获得了四种序列，相应的氨基酸序列分别为FQFYP从、LQFYPGA、LFTFA盯和YQ丫YP从。 以阳性噬菌体展示肤免疫动物鉴定其免疫原性，挑选四个含不同序列的阳性克隆(分别展示PSWASFW、QSWFLPY、FQFYP从和YQ丫YP从)分别免疫小鼠，以及将四个克隆混合免疫小鼠。其中QSWFLPY和FQFYPAA克隆及混合克隆免疫后，部分小鼠血清产生LPS抗体，效价为1:100一1:800，而对照组小鼠及经过长期观察的其它免疫原接种的小鼠均无抗LPS抗体产生。证明这两个噬菌体短肤为结合抗体的互补位(paratope)，即可模拟LPS表位结构，在体内能诱导产生抗LPS抗体。叁、LPS表位模拟肤的合成与鉴定 挑选了用单抗筛选的阳性噬菌体克隆Kl展示序列(SACPSwASFwCGG)及用多抗筛选的阳性噬菌体克隆P4展示序列(SACFQFYPAACGG)进行人工合成，合成时将原序列两侧加入氨基酸臂SA及GG以稳定环七肤构象，两种肚分别命名为13a和13b。 竞争抑制试验表明，游离的13a单体能抑制单抗与LPS以及Kl克隆与单抗的结合，其ICS。分别为125肛岁ml和巧.6卜岁ml，且呈现浓度依赖效应，无关对照12肤不显示任何抑制效应，提示13a合成肤能特异地与LPS单抗IB6的抗原结合部位(即互补位)结合，可在空间结构上模拟LPS。游离的13b单体抑制阳性噬菌体克隆P4与LPs多抗结合，其IC50为31 .25林留ml，呈现浓度依赖效应，无关对照12肤不显示任何抑制效应，说明13b模拟噬菌体表面展示肤构象而与LPS多抗结合;13b在500协留ml时不能抑制多抗与LPS抗原的结合，推测可能是因为13b只能抑制作为其筛选靶抗体与LPS的结合，而不能抑制大部分针对其它表位的抗体分子与LPS的结合，并非不能模拟LPS抗原表位。 13a和13b与蓝载体的交联物能分别与单抗和多抗呈结合反应，其反应性随抗体浓度的增加而加强，而阴性对照肚则无此反应，说明交联后环七肤构象无变化，仍然能模拟LPS表位。将交联肤免疫小鼠，其中四只小鼠血清产生抗LPS，抗体效价随免疫次数的增加而提高，即产生了抗体再次应答，实现了多糖抗原(TI抗原)表位到多肤抗原(TD抗原)表位的转变。四、模拟肤的原核表达与鉴定 考虑合成肤的成本、环肤合成和抗原多价肤(MAPs)制备的技术难度与成本等因素，我们挑选两个噬菌体克隆展示序列在两种的原核载体中以不同的方法进行了表达，以期探索获得低成本、高活性模拟序列的途径。 第一种方法是将阳性噬菌体克隆Kl和KIO的环七肤原序列CPS从7ASFWC和cQS从TLPYC在谷肤甘肤硫转移酶(GST)原核表达系统中表达，经纯化获得GST融合蛋白:为使表达序?
罗海波, 郑山根, 文维延, 蒋小滔, 朱平[2]2007年在《LPS表位模拟肽诱导小鼠保护性免疫的研究》文中认为目的鉴定叁种LPS模拟位合成肽的抗原性、诱导抗LPS抗体的产生及对细菌攻击的保护性。方法叁种LPS模拟位合成肽与载体BSA交联后,ELISA测定其与多种抗LPS单、多克隆抗体的结合活性;合成肽与蓝载体交联物免疫Balb/c小鼠,观察其诱发小鼠体内抗LPS抗体产生的规律及血清抗LPS抗体效价;鉴定针对细菌感染的保护性效应。结果叁种合成肽均能与抗鼠伤寒和大肠杆菌LPS抗体结合;用合成肽-蓝载体交联物免疫动物可诱发小鼠体内针对两种LPS的抗体反应,并对细菌攻击的免疫动物具不同程度的保护性作用,以合成肽13a,13b及12W与蓝载体交联物免疫的小鼠在鼠伤寒沙门氏菌攻击后存活时间分别为(6.5±0.77),(9.5±1.38)及(9.3±0.75)d,而PBS/蓝载体对照组存活时间为5d。结论本研究所采用的3种LPS表位模拟肽作为疫苗免疫小鼠能够产生针对细菌攻击的保护性效应,提示此3种表位模拟肽作为LPS交叉保护性疫苗候选的可行性与可靠性。
罗海波[3]2005年在《LPS模拟肽疫苗诱导保护性免疫应答的研究》文中指出脂多糖(lipopolysacchride,LPS)是引起多种感染性疾病的革兰氏阴性(G~-)菌重要的共同致病物质,可导致败血性休克等严重病理变化。鉴于G~-菌内毒素血症的高发病率和严重危害,针对LPS的治疗与预防的研究始终是人们极为关注的课题。目前尚无LPS或类脂A拮抗剂用于临床或进入临床观察;而在预防方面,预存抗LPS抗体与败血症的发生、大样本住院肿瘤患者、烧伤、外科手术等因感染死亡例数呈负相关的现象早已被证实,即对LPS诱发的病理进程有明确的保护作用,但这种保护力只限于对接种菌或特定血清型的LPS;而被动输入抗体则有时相限制,即感染前1小时内应用有效,这显然只适于动物实验。 理想的LPS疫苗应能诱导再次免疫应答,所产生的抗体应是具广谱预防与保护作用。目前LPS疫苗研制所面临的主要困难包括:①LPS为TI-I(非胸腺依赖抗原-I)型抗原,自然诱导产生的抗体亲和力低、调理杀菌力弱,且无再次抗体应答,亦不能诱导特异性细胞免疫;②源于不同种属、不同株乃至不同血清型的LPS可具不同的抗原性,只能诱导产生与接种菌或LPS结合的抗体。因而至今尚无批准进入临床实验的具广谱保护作用的LPS疫苗。 针对上述存在的问题,本课题的主要研究思路是:利用噬菌体肽库筛选获得的短肽模拟LPS的保守性结构表位,将其抗原表位的化学性质由脂多糖改变为短肽,由此使TI抗原改变为TD抗原,进而诱导机体内产生有效的再次抗体应答和交叉保护性免疫。 本课题组在前期的工作中,从噬菌体肽库中筛选了数十个模拟位克隆,选择叁个模拟鼠伤寒杆菌LPS表位的序列合成短肽,并证明用这叁种模拟短肽免疫动物后,可诱发机体产生针对鼠伤寒杆菌LPS的抗体应答,但由于所获模拟位合成肽的免疫原性较弱,加之当时以BSA为载体,所产生的抗体效价较低,保护作用亦不明显。据此,本研究着重解决了具交叉保护性抗体的纯化,并以
罗海波, 郑山根, 朱平, 富宁[4]2004年在《大肠杆菌脂多糖2630模拟位的研究》文中提出目的 :利用纯化的抗大肠杆菌L2 6 30多抗筛选噬菌体环七肽库 ,以获得可模拟脂多糖 (LPS)表位的短肽克隆。方法 :以亲和层析纯化的抗大肠杆菌L2 6 30多克隆抗体为靶分子 ,筛选噬菌体随机环七肽库 ,用双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的抗原性。结果 :对噬菌体环肽库进行 3轮筛选后 ,随机挑选 2 0个克隆 ,经鉴定其中 12个可与抗L2 6 30抗体结合 ,即为阳性克隆 ;其中有 5个阳性噬菌体克隆表现出与抗鼠伤寒沙门氏菌LPS多抗结合的活性 ,提示这 5个噬菌体展示的短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的性质。经DNA序列分析显示 ,其中 8个克隆的氨基酸序列具有X DGLL XX或X EDGLL X保守序列 ,其余 4个克隆的序列均不相同。结论 :筛选获得的噬菌体环七肽克隆具有模拟大肠杆菌LPS表位的活性 ,为大肠杆菌L2 6 30多表位模拟短肽。其中 5个阳性噬菌体克隆短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的活性
罗海波, 郑健, 朱平, 黄来强, 富宁[5]2008年在《脂多糖模拟肽13L诱导对小鼠内毒素休克的保护反应》文中研究说明为研究LPS 2630表位模拟肽13L是否能诱导抗脂多糖(LPS)抗体的产生、对细菌攻击及内毒素休克的保护性反应,合成了模拟LPS表位的短肽13L.用合成肽13L-蓝载体(blue carrier,BC)交联物免疫Balb/C小鼠,观察小鼠体内抗LPS抗体产生的规律,并观察免疫小鼠细菌感染存活时间,用颈总动脉插管测定技术观察免疫小鼠内毒素休克的血压变化.结果显示,合成肽13L-BSA交联物能与兔抗鼠伤寒和大肠杆菌LPS抗血清及抗鼠伤寒LPS单抗结合,证明短肽13L可模拟LPS的抗原性.用13L-BC交联物免疫可诱发小鼠体内针对大肠杆菌LPS 2630和鼠伤寒沙门氏菌LPS 7261的抗体反应,该反应可被灭活大肠杆菌及两种LPS所加强,其抗体亚类主要为IgG2a,其次为IgG2b与IgM,而IgG1与IgG3含量极低.免疫13L-BC小鼠显示对细菌攻击的抵抗,与免疫BC对照小鼠比较,其存活时间分别为(12±1.3)天和(5.3±0.4)天(P<0.01).免疫13L-BC小鼠对静脉注射LPS诱发内毒素休克的保护作用体现在血压下降幅度明显低于对照动物,在LPS 2630攻击后1、2、3及4h时两组动物血压明显差别(P<0.05、P<0.01、P<0.05及P<0.01),而LPS 7261攻击后1、2、3及4h时两组动物血压差别则略小于LPS 2630组(P>0.05、P<0.05、P<0.05及P<0.01).上述结果证明,LPS表位模拟肽13L交联物免疫小鼠可产生针对细菌攻击及内毒素休克的保护性效应,提示该模拟肽作为LPS交叉保护性疫苗候选的可行性.
郑山根, 文维延, 刘北一, 朱平, 富宁[6]2005年在《模拟鼠伤寒脂多糖表位合成肽的初步研究》文中研究说明目的探讨3种模拟LPS表位的合成肽的抗原性。方法固相合成模拟LPS表位的线性十二肽P12(GPPQW-FFSQPQL)、环七肽13a(SACPSWASFWCGG)和13b(SACFQFYPAACGG),与钥孔嘁血蓝蛋白或蓝载体交联,ELISA鉴定合成肽-载体交联物与抗LPS抗体的反应性,竞争ELISA鉴定游离的合成肽对抗LPS抗体与LPS、表达LPS模拟位的阳性噬菌体克隆结合的抑制。结果合成肽-载体交联物可与LPS抗体结合;游离环七肽13a可抑制抗LPS单克隆抗体与LPS结合(IC50=125μg/mL)及抗LPS单克隆抗体与阳性噬菌体克隆K1的结合(IC50=15.6μg/mL);游离十二肽P12抑制抗LPS单克隆抗体与LPS结合(IC50=550μg/mL)及阳性噬菌体克隆P12与抗LPS单克隆抗体结合(IC50=375μg/mL);游离环七肽13b可抑制噬菌体克隆P4和LPS多克隆抗体的结合(IC50=31.25μg/mL)。结论模拟LPS表位的合成肽可模拟LPS表位的抗原性,环肽优于线性肽。
陈益国[7]2011年在《金葡菌肽聚糖模拟肽疫苗候选保护性作用的初步研究》文中指出金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)是一种可寄居在人体皮肤和粘膜部位的革兰阳性菌(G+菌),是社区和院内感染的主要病原体。当各种原因导致免疫低下或缺陷、异位寄生、菌群失调时可引起如高死亡率的脓毒血症等严重后果。自20世纪60年代首次发现耐甲氧西林的菌株以来(MRSA),各种耐药菌株陆续出现,使临床用药面临着严峻的挑战；在应对上述挑战中,人们对兴起于20世纪60年代的金葡菌免疫防治寄予希望。但真正将免疫治疗、预防及应急预防用于临床仍有很多的难题需解决。目前国内外用于研发金葡菌疫苗的主要成份包括：金葡菌减毒活疫苗、荚膜多糖—蛋白连接疫苗(StaphVAX, PentaStaph)和毒素(a-hemolysin、PVL、TSST-1等)疫苗；葡糖胺(PNAG、PNSG)和表面蛋白(IsdA,IsdB,SdrD and SdrE)疫苗；和DNA疫苗FnBPA-CIfA等。虽部分被批准进入临床实验,但尚无一被批准临床应用。肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)是金葡菌细胞壁的重要成份,近年更是被称为是细菌的“阿喀琉斯之踵”,意为强者的致命弱点,是免疫防治的靶抗原。但至今未被作为疫苗候选靶点的主要原因在于：PGN为非蛋白抗原,即TI抗原(胸腺非依赖抗原),免疫原性弱,即便是感染个体其抗体滴度也不高。本研究尝试用短肽模拟PGN抗原表位,将其抗原性质由TI抗原改变为TD(胸腺依赖抗原)抗原,以诱导有效的再次免疫应答,探索以模拟肽作为疫苗候选的可能性。已知,短肽可模拟蛋白与非蛋白(糖、脂等)表位,常用于构象性表位特性以及糖脂类抗原表位研究。近十余年来,已在研究病原生物及肿瘤的非蛋白成份方面做了大量探索,并可用于分析蛋白质折迭中形成非连续性表位的特点。合成肽疫苗的优势是对有效与非必要抗原表位的组合与取舍,而缺点则是免疫原性弱,需设计合适的载体与佐剂。但近年国内的多价抗原肽(Multiple Antigenic Peptide,MAP)技术有了长足的发展,其优势体现在：不需交联载体,可不用佐剂；除抗体反应,还可诱导CTL与Th细胞反应；尤其在不同的分枝上可有不同序列的肽链,可用于构成或模拟更为复杂或不同功能的表位。国外近年已有数个多价肽疫苗进入临床观察。本课题的主要研究思路是：利用噬菌体肽库筛选获得的短肽模拟PGN的保守性结构表位,将其非蛋白抗原表位的性质改变为短肽,由此使TI-Ag改变为TD-Ag；并以所获模拟肽序列合成四分枝多价抗原肽(MAP)作为疫苗候选诱导机体内产生有效的再次抗体应答和保护性免疫。本课题组用抗PGN商品化单抗从噬菌体随机展示肽库中筛选了十余个模拟位克隆,结合生物信息学分析选择叁个PGN表位的序列进行修饰与合成,并进行体外间接ELISA与抑制ELISA鉴定,从中选择效果较好的SP31进行四分枝多价抗原肽,并对其免疫原性及免疫效果进行评价。一、应用噬菌体展示技术筛选金葡菌PGN模拟肽克隆从噬菌体线性肽库中筛选可模拟PGN表位的噬菌体克隆以商品化抗PGN单克隆抗体为靶分子对噬菌体线性12线性肽库进行了3轮筛选,富集率达为2千倍以上,显示了明显的富集效果；从第叁轮随机挑选49噬菌体克隆中用夹心ELISA鉴定出可与抗PGN单克隆抗体结合的14个克隆。阳性噬菌体测序及序列分析将上述14个阳性噬菌体克隆进行DNA测序,并对其氨基酸序列进行分析,其第31、28、43号克隆具有共同序列：ATWxHxLxSAGL,并与27、39、1序列有保守序列xHx或Hx,除噬菌体克隆1号外与anti-PGN McAb均有高反应性(OD450),第5、23、38、44虽具有共同序列GWWPYAALRALS,但多次重复后第5序列非特异性结合较高,可能含有吸板序列：因此,选择31,27,39叁种噬菌体作为后续研究对象。二、PGN模拟肽的设计、合成与体外鉴定阳性克隆展示序列抗原特性分析通过在线软件www.syfpeithi.de, http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl, http://www.darrenflower.info/mhcpred预测和T细胞表位预测软件(DNAstar)分析发现,叁种阳性噬菌体展示序列均具有人和鼠MHC结合表位；其中No.31可能的抗原表位为-TWxHxLx-序列,在两端分别加上SG-、GG后可能具有T细胞表位；No.27可能的抗原表位为—SPHxH000RS-,在两端加上SG/G GG的不同组合后均不具有T细胞表位；No.39可能的抗原表位为-WxHxVxW-;在两端加上不同SG/A GG氨基酸后可能具有T细胞表位,序列分析结果表明叁种序列具有构成Th、B细胞表位的特性。但是否真正模拟PGN的抗原表位,还需进一步的生物实验验证。PGN模拟肽抗原性鉴定体外ELISA鉴定结果表明,以生物素标记叁种线性合成肽链(SP31,SP27,SP39)能特异结合抗PGN单抗及兔抗S.aureus全菌多抗(FSP31=1139.058, PSP31=0.000; FSP27=196.091, PSP27=0.000; FSP39=90.811,PSP39=0.000),其中SP31、SP27与抗PGN单抗的反应性优于抗S.aureus多抗,而SP39则反之；抑制实验表明,PGN能剂量依赖地抑制SP31、SP27与抗PGN单克隆抗体结合(FPGN抑制SP31=729.036,PPGN抑制SP31=0.027；FSP31抑制PGN=12.286,P SP31抑制PGN=0.039；FPGN抑制SP27=74.776,PPGN抑制SP27=0.001),抑制效果在40%-60%,而39号合成肽抑制效果较差,量效关系不显着(数据未在文中显示)。上述结果提示SP31,SP27,SP39线性肽可不同程度地模拟PGN表位的抗原性。基于SP31,SP27为模板合成四分枝多价抗原肽(MAP)鉴定表明,MAP-P31剂量依赖地与抗PGN单抗(F=2021.727,P=0.000)和抗S.aureus多抗反应(F=178.344,P=0.000),并能与PGN相互抑制与抗PGN McAb的反应(FPGN抑制MAP-P31=64.032,PPGN抑制MAP-P31=0.015,FMAP-P31抑制PGN=17.532,PMAP-P31抑制PGN=0.053),而MAP-P27仅与抗S.aureus多抗反应；由此我们以MAP-P31作后续的免疫原性研究。PGN模拟肽对小鼠腹腔巨噬细胞(M9)刺激作用实验结果表明MAP-P31模拟肽能显着刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症因子TNFα、IL-6(FrNFα=1265.415,PTNFα=0.000；FIL_6=248.353,PIL-6=0.000),并呈一定的剂量依赖关系,但低于PGN刺激的细胞因子产生水平。该结果提示MAP-P31不但可模拟PGN表位的抗原性,亦可模拟其刺激巨噬细胞并产生细胞因子的生物学活性。叁、PGN抗原模拟肽MAP-P31主动免疫效果评价不同免疫方式的效果评价以MAP-P31(无交联载体)为免疫原,采用不同免疫方案免疫小鼠,二次免疫后一周检测免疫血清效价。结果显示：MAP-P31加弗氏佐剂乳化组效果显着优于基础免疫组(弗氏佐剂提前一周注射,后续均用不含佐剂的MAP-P31进行免疫)、无佐剂组(P=0.001vs FCA prior to MAP-P31;P=0.005vsMAP-P31)。结果提示,MAP-P31免疫接种可以不需要交联其他的蛋白载体,但仍需佐剂。该条件用于后续实验。抗血清免疫反应性评价合成肽MAP-P31加弗氏佐剂免疫小鼠的抗血清含可与PGN、MAP-P31以及S.aureus结合的IgG型抗体,并持续8周以上。提示MAP-P31可诱导小鼠产生了针对PGN和S.aureus的再次抗体应答与免疫记忆(FPGN=70.122,PPGN=0.000；FSaureus=379.255,PSaureus=0.000)。此外,抗MAP-P31抗血清尚可与金葡菌磷壁酸(LTA)有微弱反应,但与LPS不反应；并与表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、大肠杆菌(E.coli)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosus)的超声裂解物反应(P<0.05 vs anti-unrelated MAP),表现出一定的交叉反应性。提示MAP-P31可能模拟不同细菌PGN的共同或相似抗原表位。抗血清的体外杀菌/抑菌及调理吞噬作用实验结果表明,在补体存在或补体灭活情况下,抗MAP-P31抗血清对甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)均具有杀菌／抑制作用；并对肠球菌、人葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和嗜麦芽黄单胞菌均表现出一定的抑制／杀灭作用,然而对MRSA(ATCC43300)反而促进其生长作用,该结果提示血清杀菌作用及抗菌谱具有一定局限性,需进一步优化序列结构,以期能产生广谱的抗菌作用。研究结果亦证实在灭活补体后,抗MAP-P31血清仍能显着增强小鼠腹腔巨噬细胞对FITC标记的甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)的吞噬作用(F=981.862,P=0.000)。MAP-P31诱导的小鼠体内保护作用小鼠尾静脉注射亚致死剂量的甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)后,MAP-P31免疫组小鼠肝、脾、肾等主要脏器中细菌载量显着低于无关MAP免疫对照组(Piver=0.018,Pspleen=0.015,Pkindey=0.020)；腹腔注射致死剂量的甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)后,MAP-P31免疫组2周后的生存率为90%,而PBS免疫组和无关MAP免疫组小鼠生存率分别为0%和20%,提示免疫MAP-P31免疫后小鼠产生了针对甲氧西林敏感模式菌株(ATCC25923)的保护性免疫。四、PGN模拟肽改造及其被动免疫效果评价PGN模拟肽序列的改造鉴于MAP-P31免疫血清对MSSA菌杀菌作用明显,而对MRSA则有促进其生长作用,我们对其进行了序列改造的尝试。根据I)NAstar软件预测,我们在MAP-P31的两端延长序列中改变个别氨基酸使其形成Th细胞识别表位,合成四分枝多价抗原肽并命名为MAP-P31.1,以期获得对MRSA有杀伤/抑制作用的序列。MAP-P31.1免疫反应性鉴定以此MAP-P31.1加弗氏佐剂为免疫原免疫家兔和Balb/C小鼠,5次免疫后,其免疫血清可结合胰酶消化后PGN(?)S.aureus,提示其可能针对的是PGN的多糖表位,该模拟肽与PGN有相同或相似的抗原表位。MAP-P31.1免疫后,用热灭活S.aureus做加强免疫可增强抗体效价10倍(P=0.002vs no boost),其可能的临床应用价值在于：用合成肽疫苗接种后,自然感染S.aureus可能发挥加强免疫的作用。MAP-P31.1抗血清杀菌/抑菌作用抗MAP-P31.1小鼠血清在有/无补体作用下对MRSA与MSSA均有显着杀菌/抑菌作用(FMSSA(inactive complements)=16.490, PMSSA(inactive complements)=0.001;FMRSA (inactive complements)=13.213,PMRSA(inactive complements) =0.006;FMRSA (complements)=14.150,PMRSA(complements)=:0.005),且均显着优于anti-S.aureus多抗血清与抗MAP-P31血清(P<0.001vs anti-S.aureus组；t=-8.302,P=0.001)。MAP-P31.1免疫兔IgG的被动保护作用与正常兔IgG、抗S.aureus多抗对照组比较,纯化抗MAP-P31.1 IgG抗体被动输入能延长甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)攻击小鼠的生存时间与生存率,MAP31.1保护组小鼠一周后生存率为60%,抗S.aureus与NS组均为0%,NRS组为20%；显着增强小鼠主要脏器对MSSA清除率(Pliver=0.006 vs NRS, Pspleen=0.013 vs NRS,Pkidey=0.010 vs NRS)。该结果提示MAP-P31.1免疫兔IgG对S.aureus具有一定的保护效果；遗憾的是该抗MAP-P31.1纯化IgG对甲氧西林耐药菌株(MRSA)仍无保护作用。随后的清除实验表明正常兔IgG和MAP-P31.1免疫纯化IgG与MRSA(ATCC43300)混合静脉注射后,抗MAP-P31.1组脾脏中细菌载量显着降低(P=0.030vsNRS),肝脏中无显着差异,该结果提示抗MAP-P31.1 IgG对MRSA可能具有一定保护作用。对于MSSA所致脓肿,MAP-P31.1注射组脓肿数量或大小明显少于其余各组,提示MAP-P31.1有抑制MSSA型脓肿的形成；而对于MRSA所致脓肿,anti-S.aureus组脓肿数最多呈弥散分布,其余各组集中在边缘；抗MAP-P31.1 IgG组脓肿数或面积虽然低于正常IgG和抗S.aureus IgG组,但与NS组比较无显着差别,提示抗MAP-P31.1IgG对MRSA所致脓肿无明显抑制作用。上述结果提示,对MAP-P31序列改造虽然显示了一定的效果,如抗血清的体外杀菌活性,但对MRSA体内攻击仍不能形成有效的保护。
蒋小滔[8]2009年在《交叉反应性抗脂多糖单克隆抗体的制备及鉴定》文中提出脓毒症是ICU病人最常见的死亡原因,尽管其医疗投入巨大,严重脓毒症的死亡率还是居高不下,可达25%-30%,而脓毒症休克的死亡率则更高,达到了40%-70%。脓毒症可由多种病原微生物感染引起,包括革兰氏阳性(G~+)菌、革兰氏阴性(G~-)菌和真菌等等,而其中G~-菌感染是最重要的一种,占总发病人数的40%以上。脂多糖(LPS)是G~-菌细胞壁的重要组成成分,也是G~-菌感染脓毒症中最主要的毒力因子和抗原成分。所以在G~-菌感染引起的脓毒症的诊断与治疗中,LPS是一个重要的靶点。目前尚无LPS拮抗剂用于临床应用或进入临床观察,但有证据显示,预存抗LPS抗体与败血症的发生、大样本住院肿瘤患者、烧伤、外科手术等因感染死亡的病人数呈负相关,即对LPS诱发的病理进程有明确的保护作用。动物实验显示针对LPS的单克隆抗体(mAb)对实验性脓毒症动物模型具有良好的保护作用。所以,抗LPS的mAb有可能成为治疗G~-菌感染诱发的脓毒症的一种新制剂。LPS由叁部分组成:O特异性抗原,也叫O抗原或体抗原,位于G~-菌细胞壁的最外面,由一长链多糖构成;核心寡糖,是一由大约10个左右的单糖组成的寡糖;类脂A。所以,脂多糖是一结构十分复杂、具有多种异质性的生物大分子,而且属于胸腺非依赖抗原(TI)抗原。与蛋白质等胸腺依赖(TD)抗原不同,TI抗原不能诱导抗体亲和成熟,也不能诱导免疫记忆,所以按常规的免疫方法很难产生高亲和力、交叉反应性抗LPS的mAb。为解决此难题,一个可行的方法就是用分子模拟技术,即用蛋白质、多肽来模拟LPS的抗原结构,从而将多糖类TI抗原转变为多肽类TD抗原,提高抗原的免疫原性。那么,筛选出能够模拟LPS抗原结构的多肽就成为其中关键的一步。噬菌体展示技术是一种用于筛选和改造功能性短肽和蛋白质强有力的生物技术,广泛应用于免疫学和分子生物学领域。事实上,噬菌体展示技术早已成功的应用于多糖表位的模拟肽筛选,如对脑膜炎奈瑟球菌A、B、C叁种血清型的荚膜多糖的模拟肽筛选。这些结果说明,用噬菌体展示技术可以筛选出模拟多糖抗原表位的模拟肽,从而将TI抗原转变为TD抗原,诱导强而有力的记忆性免疫应答,制备出高亲和力、交叉反应性抗LPS的mAb。所以,本课题的主要研究思路是:利用噬菌体展示技术筛选并合成模拟LPS保守抗原表位的多肽,将其抗原表位的化学性质由脂多糖改变为短肽,由此使TI抗原改变为TD抗原;然后将多肽与适当的载体进行交联,用交联物作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备具有高亲和力、广泛交叉反应性的抗LPS的mAb。最后对其在动物体内、外的保护活性进行初步探讨。本课题组在前期工作中,以具有交叉保护活性的抗鼠伤寒沙门氏菌多克隆抗体为配基成功的从噬菌体环七肽库中筛选到四个可模拟LPS表位的保守序列,其免疫原性和抗原性已通过一系列实验得以证实。其中一个模拟肽经加入延长序列被命名为13L,我们的前期实验显示,用13L交联蓝载体(BC)作为免疫原免疫BALB/c小鼠后,可以诱导小鼠产生针对G~-菌感染和内毒素休克的保护作用。以这些实验结果为依据,本实验选择13L作为候选模拟肽,交联BC后免疫BALB/c小鼠,制备抗LPS的单克隆抗体。本研究包括以下两个部分:一、抗脂多糖单克隆抗体的制备及鉴定模拟肽13L的筛选与合成按照本课题组以前建立的方法进行,现简述如下:以大肠杆菌LPS L2630为配体用亲和层析法从抗鼠伤寒沙门氏菌兔血清中纯化出抗LPS的多克隆抗体;以纯化的多克隆抗体为配体从环七肽库中筛选出模拟LPS抗原表位的多肽,其中的一个亲和力较强的多肽被命名为L7;为了增加L7的结构稳定性,我们在其氨基酸序列两侧各加入两个额外的氨基酸,并命名为13L,然后交由生物公司进行合成。由于短肽分子量过低而不具备免疫原性,遂将其与蓝载体通过交联剂EDC的作用而进行交联,将交联物13L-BC作为本次实验的免疫原。用13L-BC免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,共免疫7次,免疫程序如下:第1次免疫,将13L-BC与福氏完全佐剂(CFA)充分乳化后,小鼠足垫、皮下多点注射,1mg/ml,100μl/只,3周后进行第二次免疫;第2-5次免疫,将13L-BC与福氏不完全佐剂(IFA)充分乳化后,小鼠足垫、皮下多点注射,1mg/ml,100μl/只,每次间隔2周;第6次免疫,将煮沸处理过的大肠杆菌O111:B4和鼠伤寒杆菌直接行小鼠腹腔注射,5×10~6CFU/只;第七次免疫,2周后,小鼠眼眶静脉采血并包被L2630和L7261用间接ELISA检测血清中抗LPS抗体的滴度,抗体滴度高的小鼠再尾静脉注射10μg L2630加强免疫一次。3天后,处死小鼠,取其脾细胞与NS-1细胞融合制备杂交瘤,用L2630和L7261进行复合筛选,对双阳性孔进行克隆化。连续叁次克隆化100%阳性后,扩大培养杂交瘤细胞,收集杂交瘤细胞行小鼠腹腔注射制备腹水,用亲和层析法从制备的腹水中纯化单克隆抗体。共融合3次,融合率在60%-100%之间,阳性率在1%-5%之间。通过筛选、克隆化最后获得一株能稳定分泌抗LPS抗体的杂交瘤细胞,命名为SMU-3A8。包被L2630检测SMU-3A8的腹水效价和纯化抗体效价,结果分别为1:1×10~6和8ng/ml。经IgG亚类鉴定试剂盒鉴定,SMU-3A8的亚类为IgG2a。用间接ELISA、WesternBlot、Dot-ElISA、免疫荧光和流式细胞术显示SMU-3A8可以和四种商品化的LPS反应,即大肠杆菌O111∶B4型LPS(L2630)、大肠杆菌O127∶B8型LPS(L3880)、鼠伤寒沙门氏菌LPS(L7261)和肠炎沙门氏菌LPS(L6761),其亲和力分为4.9×10~8L/mol、1.6×10~7L/mol、4.2×10~8L/mol和1.5×10~7L/mol。并可以和七种G~-菌(大肠杆菌O111∶B4,大肠杆菌O127∶B8,鼠伤寒沙门氏菌,福氏痢疾杆菌,绿脓假单胞菌,结肠炎耶尔森菌,鼠疫耶尔森菌)的超声上清及细菌全菌反应,但不能和金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、变形杆菌等G~+菌反应。说明SMU-3A8是具有广泛交叉反应活性的抗LPS单克隆抗体。二、抗脂多糖单克隆抗体的体内、外保护活性在第一部分实验中,我们已成功的制备了一株能与多种商品化LPS和G~-菌具有交叉反应性的单克隆抗体SMU-3A8。我们用补体依赖细胞毒试验和SMU-3A8对LPS刺激单核细胞产生NO的影响来检测其体外活性;用SMU-3A8对致死量G~-菌感染小鼠存活率的影响以及对内毒素休克小鼠存活率的影响来检测其体内活性,具体过程如下:1.补体介导的细胞毒试验细菌37℃振荡培养5小时后,室温8000rpm,离心10分钟,用无菌PBS洗涤叁次并调整细菌浓度为10~4CFU/ml。然后按体积1∶1的比例加入倍比稀释的SMU-3A8(初始浓度10μg/ml),转入到96孔培养板中,180μl/孔,加入豚鼠血清,20μl/孔,设不加抗体及不加补体的空白对照组。37℃反应1小时后,每孔取出10μl用无菌PBS稀释20倍至终体积200μl,然后均匀涂布于LB平板上,37℃过夜培养,计数形成的细菌集落。结果显示,在补体存在的情况下,SMU-3A8并不能对金葡菌、大肠杆菌、鼠伤寒菌和痢疾杆菌构成杀伤作用。2.SMU-3A8对LPS刺激单核巨噬细胞产生NO的影响小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7为本实验的靶细胞。用完全培养基调整细胞浓度为10~6个/ml,加入到24孔培养板中,500μl/孔。然后同时加入终浓度为10μg/ml的L2630和倍比稀释的SMU-3A8,设同型对照和空白对照。37℃培养24小时后,收集上清,用NO检测试剂盒检测上清中NO的浓度。结果显示,在较高浓度下(≥10μg/ml)SMU-3A8对L2630刺激RAW264.7产生NO有一定的抑制作用,如在10μg/ml时,其抑制率为20%左右。3.SMU-3A8对细菌感染和内毒素休克小鼠模型的保护作用参照本课题组以前建立的G~-菌感染和内毒素休克动物模型,并做了适当调整,作为本次实验的动物模型。G~-菌过夜培养后用无菌PBS调整浓度,BABL/c小鼠腹腔注射,使其在4-7天时,死亡率为100%。BALB/c小鼠尾静脉直接注射LPS来制备内毒素休克模型,200μg/只,使其在12-36小时死亡率为100%。细菌或LPS注射2小时前,于小鼠尾静脉注射不同浓度的SMU-3A8,设同型对照和空白对照。观察并记录小鼠的存活情况。结果显示,SMU-3A8在高浓度时能将鼠伤寒感染小鼠的死亡率从100%降低到75%左右,对大肠杆菌,痢疾杆菌感染小鼠则没有保护作用。对本实验中的内毒素休克模型也没有保护作用。结论在本实验中,我们用模拟肽模拟LPS的抗原表位并将模拟肽与蓝载体交联作为免疫原,成功制备了一株具有交叉反应活性的抗LPS mAb SMU-3A8。ELISA,Dot-ELISA,Western Blotting,免疫荧光,流式细胞检测结果显示,SMU-3A8可以和四种商品化的LPS以及七种G~-菌反应,但不和G~+菌反应。体内、外保护实验显示,SMU-3A8可以减少L2630刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7产生NO的量,并可以提高鼠伤寒菌感染小鼠的存活率,具有一定的保护作用。据我们所知,还未有用模拟肽制备抗LPS mAb的报道,我们的实验为多糖等TI抗原的mAb制备提供了一个新策略。SMU-3A8具有交叉反应性和一定的保护活性,有可能成为LPS研究的一个重要的工具,在临床G~-菌感染的诊断和治疗中也可能会发挥一定作用。
俱雄[9]2016年在《大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析》文中指出大肠埃希菌为革兰氏阴性菌,广泛存在于自然界中,可引起人和动物感染,是一种重要的人畜共患病源菌。OmpC蛋白是大肠埃希菌主要的外膜蛋白,实验发现OmpC蛋白具有很好的免疫原性,能有效抵抗大肠埃希菌类疾病的感染,在疫苗上有很好的应用前景。本试验利用分子生物学方法构建了大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达菌株;采用正交试验设计优化OmpC重组菌株最佳培养条件及最佳蛋白诱导表达条件;包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶方法获得高纯度的OmpC蛋白;通过免疫小鼠获得多克隆抗体,并进行小鼠攻毒大肠埃希菌肠道致病菌的免疫保护作用研究;同时,对OmpC蛋白进行生物信息学分析与重组表位的设计。主要研究结果如下:(1)原核表达菌株的构建:利用分子克隆方法构建OmpC重组质粒,通过SDSPAGE蛋白电泳证实OmpC蛋白成功表达。(2)OmpC蛋白诱导表达条件优化:正交试验确定表达菌最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230r/min,装液量50mL;最佳的蛋白诱导条件为:加IPTG时菌液OD600值0.8,加IPTG终浓度0.3mmol/L,诱导时间8h,诱导温度32℃。(3)OmpC蛋白多克隆抗体制备:Westernblotting检测OmpC抗血清具有很好的特异性,ELISA法证实OmpC抗血清效价达到1:6400倍。(4)OmpC蛋白免疫原性分析:通过免疫小鼠OmpC蛋白,攻毒大肠埃希菌肠道致病菌,结果显示其免疫保护率达到63.64%。(5)OmpC蛋白生物信息学分析与表位疫苗设计:研究发现OmpC蛋白在不同种细菌间存在较高的同源性,可能具有交叉免疫保护作用;1-21位氨基酸可能为信号肽位置,无跨膜结构并定位于细胞膜外;存在5个优势B细胞表位,1个CTL表位,1个Th细胞表位;并重组拼接设计获得OmpC蛋白表位疫苗。
董洁, 高亚萍, 张杰, 柳川, 薛沿宁[10]2003年在《利用噬菌体肽库筛选脂多糖的模拟表位》文中研究指明目的 :利用噬菌体肽库获得脂多糖的模拟表位。方法 :用脂多糖免疫大耳白兔获得抗血清 ,从中纯化抗脂多糖的多克隆抗体。以纯化的抗体IgG为筛选靶分子 ,对噬菌体随机十二肽库进行亲和筛选。经 3轮筛选后 ,随机挑取 2 5个克隆测序 ,并进行噬菌体ELISA结合实验及脂多糖竞争抑制实验 ,以确定阳性克隆。结果 :获得 12种序列 ,ELISA实验结果显示其中 6个为阳性克隆 ,且经脂多糖竞争抑制实验进一步证实。结论 :获得了 6个脂多糖的模拟表位 ,为脂多糖抗原表位的研究及疫苗研究提供了线索。
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