转基因柞蚕论文_刘丹梅

导读:本文包含了转基因柞蚕论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:柞蚕,转基因,载体,基因,丝素,酵母,蛋白。

转基因柞蚕论文文献综述

刘丹梅^[1]（2013）在《柞蚕新型转基因载体构建和精子介导转化研究》一文中研究指出柞蚕是我国特有的一种野外饲养的经济昆虫。相比于家蚕,柞蚕由于其种群和生长环境的特殊性使其在抗病害能力、耐气候变化能力等方面具有显着的优势,是不可替代的重要生物资源。因此,开展柞蚕转基因研究,对于了解柞蚕重要基因功能,通过转基因柞蚕育种技术改善柞蚕丝品质,提升柞蚕市场竞争,以及利用柞蚕作为生物反应器,开发柞蚕资源的新用途等都具有十分重要的意义。本文在前期研究的基础上,对柞蚕转基因载体进行了改造,优化了启动子、转座子和报告基因等重要的转基因元件,构建了新型的柞蚕双元转基因载体；利用荧光标记技术对精子介导途径进行了观察；克隆了人工拼接的蜘蛛拖牵丝基因片段,利用精子介导途径对柞蚕进行转基因研究,获得了报告基因整合和表达的初步证据。主要研究内容和结论如下：(1)通过染色体步移的方法扩增得到了全长为1927bp的柞蚕肌动蛋白A1启动子,其与家蚕肌动蛋白启动子核心区域同源率为92%,具有典型的真核生物启动子特征。通过对启动子功能区域的删除研究,确定了启动子的表达调控区域。发现A1启动子的F4片段具有较强的正向调控功能,可在转基因研究中作为强启动子调控柞蚕基因的表达,在TATA box上游可能存在抑制元件,对基因表达起到负向调节的作用。(2)利用Tail-PCR方法加长柞蚕丝素基因5’和3’端序列,并与GFP标记基因融合,构建了新的丝素基因同源表达框Fib-GFP。将上述表达框与A1驱动的红色荧光蛋白基因一同插入到piggyBac转座子两个重复序列之间,得到柞蚕基因转移载体pBac[Al-DsRed+Fib-GFP];利用柞蚕肌动蛋白A1启动子改造辅助转移载体,得到辅助载体pBacAlHelper。将Al-piggyBac表达框插入到包含反向重复序列的转移载体上,构建柞蚕双元基因转移载体pBac[Al-DsRed+Fib-GFP]-Al-piggyBac。通过对Sf9细胞进行转染实验,证明两种转移系统都能够正常工作,而且整合效率比较表明双元表达载体比转移载体与辅助质粒的双质粒载体系统具有更高的整合效率,具有在柞蚕个体转基因研究中应用的潜力。(3)利用FITC示踪技术研究了柞蚕精子与DNA吸附及转移途径,并建立柞蚕的精子介导转基因体系。将柞蚕精液与FITC标记的外源DNA混合后,荧光显微镜下检测到精子头部有荧光现象,表明柞蚕精子具有摄取外源DNA的能力。将FITC标记的外源DNA导入柞蚕雌蛾体内,在荧光显微镜下观察外源DNA进入雌性生殖系统的运动过程,证实了昆虫通过精子介导实现转基因的途径。利用精子介导将携带GFP基因的载体导入蚕卵,在蚕卵中观察到瞬时表达的绿色荧光,通过RT-PCR和Western blot检测结果证明绿色荧光蛋白基因可经精子介导实现转移和表达。(4)利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的蜘蛛拖牵丝蛋白基因(ASP)。将得到的拖牵丝蛋白基因(ASP)分别构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,成功实现了ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中的表达。(5)将蜘蛛拖牵丝蛋白基因(ASP)克隆至柞蚕双元基因转移载体上,利用精子介导法进行柞蚕转基因实验,经过分子鉴定,证明蛛丝与GFP融合基因在柞蚕丝腺中得到表达。(本文来源于《大连理工大学》期刊2013-06-01）

李文利^[2]（2003）在《柞蚕丝素基因转移载体的构建及转基因柞蚕的研究》一文中研究指出柞蚕是完全变态的绢丝类昆虫，生长至五龄后期合成并分泌一种丝素蛋白，约占蚕丝的80％。柞蚕丝素蛋白在结构上与家蚕不同，家蚕丝素蛋白是山两条多肽链通过二硫键连接而成，而柞蚕丝素蛋白是由一条多肽链构成的。因此，我们根据柞蚕丝素蛋白这一特点，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，并采用精子介导法进行转基因的研究。目前，国内外还未见有关这方面的研究报道。本文运用PCR、RLM-RACE等方法，克隆并分析了柞蚕丝素蛋白基因，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，利用同源重组的原理通过精子介导法对柞蚕丝素蛋白基因进行基因打靶，探讨了柞蚕转基因的可能性。主要研究内容和结果如下：利用PCR方法从柞蚕基因组中分离出丝素基因5’端与3’端部分片段。其中5’端片段长度为1330bp，它的5’端上游由CAAT box、TATA盒、prim transcript所组成。将其与家蚕、天蚕的相应序列进行比较发现，柞蚕与天蚕的同源率要远远高于家蚕的相应序列。用RLM-RACE方法确定了柞蚕丝素基因转录起始位点的第一个碱基位于ATG上游-27碱基处。从序列中可以看出：若转录起始点第一个核苷酸标为+1，则TATA盒位于-25处；CAAT盒位于-70处，符合真核生物的启动子特征。通过对启动子区域的删除分析，确定了该启动子的核心区域在ATG上游约260bp范围内。克隆的丝素基因3’端片段为1400bp，它包括13个多聚丙氨酸结构域和由100bp组成的3’端非编码序列(UTR)。它与另外一条已知的序列同源性非常高，其同源率为90％，在比较中还发现它缺失了一个重复序列，在获得的序列中共有5个Chi样与重组热点有关的序列。以克隆的柞蚕丝素基因5’和3’端片段作为同源重组序列，组建成柞蚕丝素基因转移表达载体pFG-1和pFG-2，将绿色荧光蛋白基因插入到该载体的相应位点。通过对五种昆虫细胞进行转染试验表明，在其中的樗蚕细胞(Sc)、草地贪夜摘要蛾细胞(S份)、HighFive细胞系中绿色荧光蛋白得到表达，由此可以证明该载体的构建是正确的。而在果蝇细胞系(S2)、Gv一1细胞系中没有发现有绿色荧光的细胞，说明该载体具有种属特异性。将构建的柞蚕丝素基因转移载体，采用精子介导的方法进行了转基因柞蚕研究。通过PCR检测发现有n.09%的蛾区表现为阳性，在其五龄幼虫期检测的阳性率为3.27%。将PCR检测阳性的幼虫经过进一步的Southern blot、Northern blot和Western blot检测，结果发现，在部分幼虫中绿色荧光蛋白基因(GFI，)己经整合到柞蚕染色体上并在丝腺内得到表达。(本文来源于《大连理工大学》期刊2003-08-01）

马礼金,庄楚雄,黄自然^[3]（1995）在《柞蚕抗菌肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析》一文中研究指出采用碱金属法（醋酸锂盐），以大肠杆菌－酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽Ｄ基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时还研究了转基因酵母的发酵条件，如温度、ｐＨ及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为１．１４ｍｇ／Ｌ培养液，杀菌活力为０．２１６单位。(本文来源于《蚕业科学》期刊1995年01期）

转基因柞蚕论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

柞蚕是完全变态的绢丝类昆虫，生长至五龄后期合成并分泌一种丝素蛋白，约占蚕丝的80％。柞蚕丝素蛋白在结构上与家蚕不同，家蚕丝素蛋白是山两条多肽链通过二硫键连接而成，而柞蚕丝素蛋白是由一条多肽链构成的。因此，我们根据柞蚕丝素蛋白这一特点，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，并采用精子介导法进行转基因的研究。目前，国内外还未见有关这方面的研究报道。本文运用PCR、RLM-RACE等方法，克隆并分析了柞蚕丝素蛋白基因，构建了柞蚕丝素基因转移表达载体，利用同源重组的原理通过精子介导法对柞蚕丝素蛋白基因进行基因打靶，探讨了柞蚕转基因的可能性。主要研究内容和结果如下：利用PCR方法从柞蚕基因组中分离出丝素基因5’端与3’端部分片段。其中5’端片段长度为1330bp，它的5’端上游由CAAT box、TATA盒、prim transcript所组成。将其与家蚕、天蚕的相应序列进行比较发现，柞蚕与天蚕的同源率要远远高于家蚕的相应序列。用RLM-RACE方法确定了柞蚕丝素基因转录起始位点的第一个碱基位于ATG上游-27碱基处。从序列中可以看出：若转录起始点第一个核苷酸标为+1，则TATA盒位于-25处；CAAT盒位于-70处，符合真核生物的启动子特征。通过对启动子区域的删除分析，确定了该启动子的核心区域在ATG上游约260bp范围内。克隆的丝素基因3’端片段为1400bp，它包括13个多聚丙氨酸结构域和由100bp组成的3’端非编码序列(UTR)。它与另外一条已知的序列同源性非常高，其同源率为90％，在比较中还发现它缺失了一个重复序列，在获得的序列中共有5个Chi样与重组热点有关的序列。以克隆的柞蚕丝素基因5’和3’端片段作为同源重组序列，组建成柞蚕丝素基因转移表达载体pFG-1和pFG-2，将绿色荧光蛋白基因插入到该载体的相应位点。通过对五种昆虫细胞进行转染试验表明，在其中的樗蚕细胞(Sc)、草地贪夜摘要蛾细胞(S份)、HighFive细胞系中绿色荧光蛋白得到表达，由此可以证明该载体的构建是正确的。而在果蝇细胞系(S2)、Gv一1细胞系中没有发现有绿色荧光的细胞，说明该载体具有种属特异性。将构建的柞蚕丝素基因转移载体，采用精子介导的方法进行了转基因柞蚕研究。通过PCR检测发现有n.09%的蛾区表现为阳性，在其五龄幼虫期检测的阳性率为3.27%。将PCR检测阳性的幼虫经过进一步的Southern blot、Northern blot和Western blot检测，结果发现，在部分幼虫中绿色荧光蛋白基因(GFI，)己经整合到柞蚕染色体上并在丝腺内得到表达。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。