樊耀敏薛挥陈博婷
西北大学医院陕西西安７１００６９基金项目:陕西省攻关项目(２００７K１４－２).
【摘要】目的:研究酒精、内毒素、酒精和内毒素共刺激引起RAW２６４．７(小鼠单核巨噬细胞)细胞活化的信号传导通路.方法:不同浓度的酒精、内毒素、酒精联合内毒素刺激RAW２６４．７细胞２４h、４８h前后,应用间接免疫荧光法观察NF－κB、IκBα位置.结果:经酒精、内毒素、酒精联合内毒素刺激后Caspase３活性较空白组升高(P＜０．０５);凋亡率随酒精、内毒素浓度的升高而升高(P＜０．０５).结论:RAW２６４．７细胞经酒精、内毒素、酒精联合内毒素刺激后NF－κB入核,TNF－α分泌升高,细胞凋亡增加.cSN５０抑制RAW２６４．７细胞被刺激后的NF－κB核转位、TNF－α分泌和细胞凋亡.【关键词】cSN５０;RAW２６４．７;核因子－κB;细胞凋亡cSN５０blocksNF－κBtranslocation,inhibitionofendotoxin,alcohol－inducedRAW２６４．７cellapoptosis【Abstract】ThepurposeofAlcohol,endotoxins,alcoholandco－stimulationofendotoxinRAW２６４．７(mousemacrophagemonocyte)cellactivationsignaltransductionpathＧways．Alcoholconcentrationofdifferentmethods,endotoxins,alcoholcombinedwithendotoxinstimulateRAW２６４．７cells２４h,around４８h,indirectimmunofluorescenceobＧservedNF－κB,IκBαposition．ResultsAfteralcohol,endotoxin,alcoholcombinedwithinternalLPSCaspase３increasedactivitythanthecontrolgroup(P＜０．０５);theapoptosisrateincreasedwithalcohol,increasestheconcentrationofendotoxinincreased(P＜０．０５)．ConclusionRAW２６４．７cellstreatedwithalcohol,endotoxin,alcoholcomＧbinedwithinternalafterLPSNF－κBintothenucleus,TNF－αsecretionincreased,increasedapoptosis．cSN５０inhibitionRAW２６４．７cellswerestimulatednucleartranslocaＧtionof【KNeyFw－oκrBds,】TNF－αsecretionandapoptosis．cSN５０;RAW２６４．７;Nuclearfactor－kappaB;Cellapoptosis【中图分类号】R３９【文献标识码】B【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０５４５－０２
酒精性肝病在我国有些地方已成为第二大肝病[１].而内毒素LPS诱导的炎症反应、细胞因子及细胞凋亡的作用起关键作用.材料和方法一、实验材料内毒素(细菌脂多糖)为Sigma公司产品,NF－κBP５０、IκBα为Santacroz公司多抗,ELISA试剂盒购自深圳晶美生物试剂公司,Caspase３分光光度试剂盒购自南京凯基,cSN５０、CN５０由美国VanderbiltUniversity馈赠.二、方法１RAW２６４．７细胞按酒精、内毒素、酒精联合内毒素、酒精＋内毒素＋cSN５０(阳性组)、酒精＋内毒素＋CN５０(阴性对照组)、空白分为六组.２ELISA１０００rpm离心收集上清,按照ELISA试剂盒操作说明测定TNF－α浓度.取测定结果差别较大的三个浓度作后续实验.３分光光度计收集对数生长期细胞,用Caspase３试剂盒自带试剂及说明提取蛋白,Bradford法测定其中的蛋白浓度,依据使用说明操作,酶标仪或分光光度计(１００μl的比色皿)在λ＝４０５nm或４００nm测定其吸光值.４流式细胞仪收集经各浓度酒精、内毒素,酒精联合内毒素加cSN５０、酒精联合内毒素加CN５０处理２４、４８h后的细胞,及时上流式细胞仪(FACS)分析.５间接免疫荧光FITC染色为绿色,当P５０活化进入核内,绿色荧光表明P５０被激活,胞浆有绿色荧光表明IκBα位于胞浆内.６Western＝Blotting依据核浆蛋白提取试剂盒操作说明提取核浆蛋白Bradford法蛋白定量.用Western印迹法检测免疫沉淀物中的目的蛋白质量.
三、统计学处理采用SPSS１５．０统计软件包,计量资料以x±s表示,并EXCEL软件作图,两组间比较用t检验,组间比较用单因素方差分析,以P＜０．０５确定为具有统计学意义.结果１ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNFα)活性１)经酒精、内毒素、酒精联合内毒素刺激后２４h、４８hTNFα明显升高,呈剂量依赖性,与空白对照相比有显著差异(见图１图２图３).２)cSN５０处理组较对照组CN５０２４h(３７．００±０．２０比５６．００±０．４０)、４８h(６．００±０．２０比１９．００±０．３０)TNFα显著降低,统计学有明显差异(p﹤０．０１)(图４).
２Caspas３活性１)细胞Caspase３活性随酒精、内毒素、酒精联合内毒素浓度的变化而变化.２)cSN５０＋酒精３０mM＋内毒素１００ng/ml与阴性对照CN５０＋酒精３０mM＋内毒素１００mg/ml分别作用RAW２６４．７细胞２４、４８小时,２４小时cSN５０与CN５０相比Caspase３活性明显下降(P＜０．０５).３流式细胞仪检测细胞凋亡率１)不同浓度酒精、内毒素作用２４h、４８h凋亡率随浓度升高而升高,酒精以３０mM４８h凋亡率最高,内毒素组２４h１００ng/ml最高,各组与空白对照组相比有显著性差异(p＜０．０５).２)酒精＋内毒素＋cSN５０与酒精＋内毒素＋CN５０相比作用４８h凋亡率明显下降,有明显统计学意义(p﹤０．０５).４间接免疫荧光观察NF－κB核转位结果(１)空白组(图９,图１２)荧光镜观察见NF－κB位于胞浆;经不同浓度酒精(图１０,图１３)、内毒素刺激(图１１,图１４)４、４８h后见有部分转移至核内.
讨论酒精导致肠道通透性增加,内毒素入血后与血中的内毒素结合蛋白(LBP)结合,转运至肝脏,与肝脏定居的单核巨噬细胞Kupffer细胞表面的LPS受体CD１４相互作用并经TLR４介导,激活细胞内的应激反应转录因子如NF－κB,后者进入细胞核,引起多种细胞因子如TNF－α的过量表达,TNF－α进一步
作用于肝细胞引起肝细胞凋亡.在静止细胞中,NF－κB结合IκB蛋白,以无活性状态存在于胞浆中.NF－κBNLS区被覆盖,阻止NF－κB由胞浆向胞核转移而使其处于失活状态.在外界信号刺激下,IκB被某些激酶磷酸化而导致泛素化和依赖于２６S蛋白酶体的降解,使NF－κB自由进人细胞核,启动相关基因转录.用酒精、内毒素、酒精联合内毒素刺激RAW２６４．７细胞后,使胞浆NF－κB活化,IκB降解,活化的NF－κB入核并与相应的靶基因结合,诱导炎症介质和细胞因子如TNF－α等过量表达,TNF－α是导致肝细胞损害的主要细胞因子,同时它也可以与RAW２６４．７细胞表面的TNFR１结合,诱导其凋亡,自动调节RAW２６４．７细胞的应激反应能力.cSN５０作为一种穿膜的前炎症转录因子(SRTFs)抑制物,竞争性抑制NF－κB核转位,抑制了TNF－α的表达,明显减轻RAW２６４．７细胞凋亡.
参考文献[１]历有名,陈卫星,虞朝辉,等,浙江省酒精性肝病流行病学概况[J].中华肝脏病杂志;２００３;１１:６４７－６４９.