白庆荣[1]2004年在《利用RNA介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株》文中研究指明植物病毒病害是农作物生产中的重要病害,给农业生产造成巨大的损失。马铃薯 Y病毒(PVY)对马铃薯、烟草等重要经济作物危害十分严重,其侵染所造成的损失可达80%,尤其是马铃薯 Y 病毒坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝收。马铃薯X 病毒(PVX)单独侵染可使马铃薯产量损失 10%~20%,但是 PVX 在田间常常与其它病毒混合侵染,特别是马铃薯 Y 病毒与之混合侵染引起的病毒协生作用,在生产中造成的损失更为严重。RNA 介导的病毒抗性(RNA-Mediated Virus Resistance, RMVR)是近年来发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等优点,但也存在抗病谱窄的缺点。本实验室转化非翻译马铃薯 Y 病毒坏死株系的衣壳蛋白基因(PVYN-MCP)或者该基因不同长度的基因片段,均获得高度抗病的转基因植株,且证明这种抗病性为 RNA 介导的抗病性。此外,本实验室将马铃薯 Y病毒坏死株系的部分衣壳蛋白基因 3′ 端和 5′ 端 200bp 的基因片段设计成反向重复(IR)和正向重复(DR)序列,都获得不同比例的抗病转基因植株,但反向重复转基因获得抗性转基因植株比例高于转正向重复的转基因植株。 基于生产中存在的问题和本实验室的研究基础,本研究将非翻译马铃薯 X 病毒的衣壳蛋白基因(PVX-CP)和非翻译马铃薯 Y 病毒的衣壳蛋白基因(PVYN-CP)不同长度以不同顺序组成嵌合基因,构建植物表达载体;另外用 PVX-CP 和 PVYN-CP 的 3′ 端200bp 的基因片段以不同的连接顺序构建了基于 pFGC5941(dsRNA 植物表达载体)和pROKII 设计的 Hairpin 结构植物表达载体,转化烟草,以探索利用这一策略培育多抗病毒转基因植株的可行性,并寻找赋予 RNA 介导抗性的最短有效片段的长度,从而为今后进行植物多抗病毒育种奠定基础。研究结果和主要结论如下:1.非翻译 PVYN-CP 和 PVX-CP 以不同长度和顺序组成嵌合基因转化烟草的抗病性研究1.1根据本实验室已克隆的PVYN-CP的全长cDNA序列(804bp)和PVX-CP的全长cDNA序列设计了非翻译全长及 3′ 端部分基因片段的特异引物,以 PVX-CP 和 PVYN-CP 的cDNA 为模板,进行 PCR 扩增,得到相应的基因扩增产物,PCR 产物纯化后进行单酶切,用 T4 DNA 连接酶把相应的基因片段进行体外连接,双酶切纯化后,与用相同酶处理的克隆载体 pUC19 连接,热激法转化大肠杆菌 DH5α,筛选并获得重组克隆质粒pUCXY、pUCfXY、pUCYX 和 pUCfYX。序列测定表明,已成功克隆出嵌合基因 XY、 1
孙林[2]2016年在《基于miRNA和siRNA策略抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的研究》文中研究指明水稻是我国重要的粮食作物之一,种植面积约占粮食播种总面积的30%,产量接近粮食总产量的44%。稻米品质好,价值高,是我国主要的商品粮食,亦是发酵工业的重要原料。水稻病害是限制水稻进一步提高产量和品质的主要瓶颈之一。水稻条纹叶枯病(Rice stirp disease)和水稻黑条矮缩病(Rice black-streaked dwarf disease)是在水稻生产中普遍发生的、危害严重的病毒病害。发病严重时,感病植株死亡,最终导致水稻产量明显降低,甚至绝产;即使存活到成熟,也表现为生长严重受阻,对水稻生产造成严重损失;并且两种病毒病均是由灰飞虱持久性传播的,在田间,这两种病害可以同时发生,加重发病症状,对水稻生产造成更加严重的危害。RNA沉默(RNA silencing)是一种广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生物中,由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)引发的,通过序列特异性的相互作用来抑制基因表达的现象,被认为是真核生物阻止病毒、转座子等外来核酸的入侵,维持生物基因组稳定性的重要防御机制。其中,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)是沉默RNA的最主要组成部分。利用RNA干扰技术培育抗病毒的转基因植物是目前常用的一种抗病毒基因工程策略,通常称为RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance,RMVR)。其中,利用人工合成microRNA(artificial miRNA,amiRNA)的RNA介导病毒抗性策略培育抗病毒转基因植物取得了很大进展,具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特点,被认为是一种具有较大应用价值的植物抗病毒基因工程策略。此外,随着对RNA介导的病毒抗性的不断研究,利用RNAi策略防治病毒病已经不止局限于培育获得高病毒抗性的转基因植物。目前,有研究表明,给传毒昆虫介体饲喂dsRNA,可以使昆虫介体失去传毒能力。这种防控病毒病的方法主要是切断植物病毒的传播途径,不需要产生转基因植物就可以达到防治病毒的目的,更加具有生物安全性。本研究以水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)为实验材料,利用嵌合人工miRNA策略,培育获得了具有较高抗病水平且能够稳定遗传的双抗RSV和RBSDV转基因水稻新材料;以灰飞虱和RSV为实验材料,利用RNA沉默技术,对可能参与昆虫介体传播病毒的相关蛋白进行了功能验证,在此基础上,利用RNAi对昆虫体内的传毒相关蛋白进行基因沉默,阻断昆虫对病毒的传播,减轻病毒对作物的危害。双抗病毒转基因水稻新材料的获得,为我们进一步将现代生物技术与传统育种技术相结合培育抗病毒水稻新品种奠定了基础;介体传毒相关蛋白的鉴定,为我们进一步高效地利用rna沉默技术控制病毒病的危害提供重要依据。主要研究结果和结论如下:(1)基于amirna策略培育双抗rsv和rbsdv转基因水稻新材料基于amirna抗病毒策略,选取水稻内源的osa-mir528作为前体,利用wmd网站设计靶向于rsv及rbsdv的cp基因及其3′-utr区上的有效amirna;然后选择了分别靶向于rsv和rbsdv的cp基因中间片段、3′端、3′-utr区域的3个amirna(分别命名为amir-rsvm,amir-rsv3,amir-rsvu和amir-rbsdvm,amir-rbsdv3,amir-rbsdvu)。利用重迭pcr(overlappcr)将其替换掉osa-mir528自身的mirna有效片段;然后嵌合连入改造好的pcambia1300表达载体,获得了能同时靶向于rsv和rbsdv的3个amirna前体二聚体植物表达载体(pamir-m,pamir-3和pamir-u)。将构建好的3个植物表达载体导入农杆菌eha105,瞬时侵染本生烟验证其有效性,3d后amirna的northern分析结果表明,构建好的amirna植物表达载体在侵染的本生烟体内能有效地表达,产生成熟的amirna,并下调靶基因的表达。5′-rlm-race实验表明,amirna能精确介导靶基因序列的剪切。通过农杆菌介导的基因转化方法转化临稻10愈伤组织,经除草剂ppt筛选和pcr检测,分别获得含有pamir-m,pamir-3和pamir-u的t0代转基因植株为35株、37株、48株;转基因植株内,各类改造后的pre-amirna均能被识别,并表达产生成熟的amirna。t0代转基因植株经过连续自交,结合除草剂抗性检测和pcr鉴定,获得t2代植株。t2代转基因植株病毒抗性鉴定结果显示,各转基因株系都表现出了对rsv和rbsdv的不同程度的抗性,包含pamir-m,pamir-3和pamir-u的转基因株系对rsv的抗病率分别为29.52%,44.14%和54.17%;对rbsdv的抗病率分别为26.66%,36.04%和45.83%。对获得的转基因植株进行southern和northern杂交分析,结果表明,外源基因以不同的拷贝数整合到了水稻基因组中。在转基因植株中靶病毒rna的下调是由初级的amirna介导所诱发的,并且沉默可以通过sirna途径向双边延长,初级的amirna和次级的sirna共同介导转基因植株对病毒的抗性。遗传稳定性分析表明转基因和其介导的病毒抗性能在转基因植株中稳定遗传。(2)介体传毒相关蛋白的鉴定及干扰基因的表达对介体传毒的影响以已报道的灰飞虱体内与RSV互作的蛋白基因NCuP作为候选基因,设计引物,利用RT-PCR克隆得到目的基因。利用qRT-PCR技术,研究灰飞虱NCuP在介体的不同发育阶段的表达特性,发现其在灰飞虱的整个发育过程中均有表达,但不同发育时期的表达是存在差异的,1龄若虫的NCuP表达量最高,随着昆虫的生长其表达量逐渐降低。qRT-PCR检测RSV的侵染对不同龄期灰飞虱NCuP表达的影响,结果显示,带毒灰飞虱体内的NCuP的表达水平明显高于无毒灰飞虱体内的NCuP的表达水平,初步表明NCuP可能参与了RSV在介体内的繁殖传播。体外合成NCuP的dsRNA,饲喂带RSV的灰飞虱,利用qRT-PCR检测靶基因及病毒基因在昆虫体内的表达情况,结果显示,饲喂dsNCuP的灰飞虱体内NCuP的表达水平和RSV的积累水平均有显着降低,推测NCuP可能参与了RSV在介体内的繁殖。对饲喂dsNCuP的灰飞虱进行获毒率和传毒率的检测发现,对照组的获毒率和传毒率分别为41.44%和68.33%,而饲喂dsNCuP的灰飞虱的获毒率和传毒率分别为28.89%和23.89%。表明,干扰灰飞虱体内的NCuP的表达可以显着降低灰飞虱的获毒率和传毒率。
谢雪迎[3]2014年在《嵌合基因结构对发夹RNA介导的病毒抗性的影响及双抗转基因水稻新材料的培育》文中研究表明RNA沉默广泛存在于生物体中,通过阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性；小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性(RNA-mediated virus resistance, RMVR)是RNA沉默的一种重要表现形式。在PTGS所引发的RNA降解过程中,因外源基因转录产物与入侵病毒基因同源或部分同源,侵入细胞的病毒基因被RNA降解系统识别并随着外源基因RNA一同被降解。RNA介导的病毒抗性具有高效且持久的病毒抗性,同时其生物安全性也相当稳定。在涉及RNA沉默的相关研究中,siRNA的有效性可能受到靶序列的结构影响。本研究以马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)基因和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)衣壳蛋白(coat protein, CP)基因,马铃薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制子基因(2b)为靶序列,构建了不同嵌合基因发卡RNA (hairpin RNA, hpRNA)结构的植物表达载体,转化烟草,进行病毒抗性鉴定,系统性地比较不同嵌合基因结构对RNA介导的病毒抗性的影响；进而以水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)和水稻条纹病毒(Ricestripe virus, RSV)衣壳蛋白基因为靶序列,构建了包含两种病毒CP基因的嵌合基因hpRNA表达载体,转化获得了双抗RSV和RBSDV的水稻新材料。研究的主要结果和结论如下：(1)不同嵌合基因发卡结构和功能基因差异对RNA介导的病毒抗性的影响根据已克隆的PVY CP基因、HC-pro基因和CMV CP基因、2b基因全序列,设计并合成构建嵌合基因单发夹植物表达载体所需引物。通过PCR扩增,获得长度为300bp的各基因3'端cDNA片段,分别插入克隆载体pUC19,获得嵌合基因片段；进一步PCR扩增,获得正向和反向的嵌合基因片段和内含子片段；将扩增的片段酶切,分别连入植物表达载体pROK Ⅱ中,构建了嵌合基因单发夹的hpRNA结构的植物表达载体pDCPSH和pHC2bSH。根据已克隆的PVY CP基因、HC-pro基因和CMV CP基因、2b基因全序列,设计并合成构建嵌合基因双发夹植物表达载体所需引物。通过PCR扩增,获得长度为300bp的各基因3'端cDNA片段和内含子片段；将PVY CP基因和HC-pro基因及内含子片段插入克隆载体pBSK中,获得含PVY CP基因和IC-pro基因的发卡结构cDNA；将CMVCP基因和2b基因及内含子片段插入克隆载体pT-EASY,获得含CMVCP基因和CMV2b基因的发卡结构cDNA；酶切回收两个发卡结构cDNA,连接于植物表达载体pROK Ⅱ中,构建了嵌合基因双发夹的hpRNA结构的植物表达载体pDCPDH和pHC2bDH。将构建的4个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株,共得到转pDCPDH, pHC2bDH、 pDCPSH和pHC2bSH的T0代转基因植株各111株、108株、106株和104株。用荧光定量PCR和Northern杂交对目的基因进行转录分析,发现转化嵌合基因双发夹结构载体的转基因植株中目的基因的转录与转化嵌效率和基因单发夹结构载体的转基因植株没有明显差异,但是前者经剪切获得的siRNAs明显多于后者。抗病性分析发现pDCPDH, pHC2bDH、 pDCPSH和pHC2bSH的转基因植株,对PVY和CMV同时表现抗性的植株比例分别为63.25%、37.98%、47.08%和25.78%,转pDCPDH的株系抗病效率为最高,而转pHC2bSH为最低,两者相差近3倍,表明靶向病毒的CP基因双发卡结构具有更好抗病效果。转基因植株的Northern杂交分析发现,转基因在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA积累量明显低于同类型的感病植株,抗病性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的siRNA积累量的分析发现植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。转基因植株的Southern杂交结果证明外源基因已整合到烟草基因组中。对T1代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的低拷贝抗性转基因植株的后代遵循孟德尔遗传分离规律,并且表现很强的抗病毒侵染能力(抗病率均达到95%以上),说明由hpRNA介导的病毒抗性在T1代植株中能够稳定遗传。(2)双抗RBSDV和RSV转基因水稻的培育水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)是目前水稻生产中广泛存在并且危害严重的两种病毒病,培育双抗RBSDV和RSV的水稻品种能够有效降低水稻生产中由病毒病引起的生产损失。以已克隆的RBSDV CP和RSV CP基因全长的cDNA为模板,设计并合成3'端、中间和5'端序列的引物,经PCR扩增获得大小为300bp的正向和反向的片段,通过酶切分别连入植物表达载体pCAMBIA1300UNB中,获得了发卡RNA(hpRNA)结构的瞬时表达载体p1300-RBSDV3'、p1300-RBSDV-M p1300-RBSDV5、p1300-RSV3、p1300-RSV-M和p1300-RSV5'。经瞬时侵染本生烟验证其有效性。Northern杂交显示,6个瞬时表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且RBSDV CP基因和RSVCP基因中间序列下调靶基因的表达最为显着。因此,我们选择RBSDV和RSV的CP基因中间序列为靶序列,借助克隆载体pUC19和pBSK,分别构建了嵌合基因单发卡和嵌合基因双发夹的植物表达载体：p1300SH和p1300DH。将构建的2个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌EHA105。利用农杆菌介导的转化方法,转化临稻10号,经除草剂PPT筛选和PCR检测,获得转p1300DH和p1300SH的To代转基因植株各30株和45株。自交结实获得T1代株系,每个载体的T1代转基因株系各选取50棵抗PPT的转基因植株,分别用来自山东济宁的带毒灰飞虱接种RBSDV和RSV,按每株6头,接入2-3d龄带毒灰飞虱若虫(3头若虫携带RBSDV病毒,另3头若虫携带RSV病毒)。病毒抗性的检测结果显示：有8个p1300DH的转基因株系和8个p1300SH的转基因株系,植株的感病率都在6%以下,远远低于转野生型株系的感病率,表现为抗性株系；两个载体其余株系的感病率都在12%以上,表现为中抗和染病株系。统计结果显示,转化p1300SH和p1300DH的转基因株系中抗病株系的比率分别为17.78%和26.67%,表明转化嵌合基因双发卡结构的转基因植株的抗病效率明显高于转化单发卡结构转基因植株。T1代抗性株系的Southern杂交显示,外源基因以不同拷贝数整合于水稻的基因组中；T1代转基因株系的Northern杂交分析表明,抗病性与RNA积累量呈负相关,证明病毒抗性是由RNA介导的；对接种病毒的转基因植株的siRNA积累量分析发现,植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。选取Southern检测呈1-2谱带的T1代抗性植株SH1、 SH15、 SH27、 DH12、 DH14、 DH19、 DH23进行T2代遗传分析。结果表明,转基因及其介导的抗性可以稳定遗传至T2代,并且获得DH14和DH19两个不再发生分离的纯合体株系。
艾涛波[4]2010年在《amiRNA介导抗性转基因烟草植株的抗病性分析》文中研究说明近年来,人工合成的microRNA(amiRNA)的应用为植物抗病育种提供了新的途径。microRNA(miRNA)是一类由核基因编码的,转录后在细胞质中经一系列剪切而形成的小RNA,它能指导靶基因的剪切或翻译抑制来调控基因的表达。amiRNA技术是在内源基因沉默机制上发展起来的,利用该策略,设计特异的amiRNA就可以使靶基因发生高效的基因沉默。理论上讲,运用该策略也能用于培育抗病毒的转基因植株。本研究中,利用拟南芥的叁个内源的miRNA前体(pre-miR159a,pre-miR167b和pre-miR171a)为骨架,设计特异的amiRNA,分别靶向马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)编码沉默抑制子的HC-Pro基因和马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)编码沉默抑制子的TGBp1/p25(p25)基因,并对所得的T1代转基因植株进行抗病性分析。主要实验结果如下:1)分别培育了叁类针对PVY和PVX病毒的转基因植株,每类植株由不同的改造后的前体转化而来。Northern blot结果表明,叁类转基因植株均能产生amiRNA,但效率不同,其中pre-miR159a植株的效率最高。2)病毒接种实验证明,叁类转基因植株都具有一定的病毒抗性。ELISA和荧光定量PCR分析表明,植株的抗病性与amiRNA的表达量呈正相关。3)5′RLM-RACE实验证明,amiRNA能准确的指导靶序列的剪切。对接种后的转基因植株的Northern blot分析表明,病毒RNA的含量与amiRNA的表达水平呈负相关。4)不同株系的病毒接种实验表明,所得的amiRNA转基因植株对其所针对的病毒具有广谱的抗性,但其抗性水平受到靶序列的影响。5)表达pre-amiRNA二聚体的转基因植株能同时产生两类amiRNA,并能介导对PVX和PVY的双重抗性。6)对单抗植株的T2代进行抗性分析表明,混合接种时不发生协同效应,且其抗性具有可遗传性。
朱常香[5]2005年在《烟草病毒的检测和防治新技术研究》文中认为烟草病毒病是全世界烟草栽培区发生普遍,危害严重的一大类病害。目前世界上已报道发现的侵染烟草的病毒达47 种,我国有17 种。在田间,常表现为多种病毒混合侵染,给烟草生产造成重大损失,重病田减产20～50%,夏烟减产70%以上。对病毒病的快速检测和监控技术是病毒病防治的基础性工作,可提高病毒病防治的针对性和时效性;而植物抗病毒基因工程的发展,特别是RNA 介导的病毒抗性策略的提出,为植物病毒病的防治提供了新的途径。围绕着烟草病害的防治,本研究进行了两方面的探索。其一,分离、提纯马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、马铃薯X 病毒(PVX)、烟草环斑病毒(TRSV),克隆了6 种病毒的外壳蛋白(CP)基因,并进行了序列分析,首次明确了PVY、PVX 和CMV 山东分离物在分类学上的归属地位。制备了不同病毒的抗体和酶标抗体,建立了以点免疫结合技术(DIBA)为基础的快速、多元的病毒检测体系,对山东烟草病毒病进行了初步调查,明确了主要病毒种类。其二,RNA 介导的病毒抗性策略应用于烟草病毒病防治的研究。在已获得不同抗病类型的转非翻译PVY-CP 基因烟草的基础上,研究了RNA 介导的病毒抗性遗传及外源基因的整合方式与RNA 介导的病毒抗性产生的关系,明确了RNA 介导的病毒抗性可稳定地遗传;揭示了转基因的结构对于诱发病毒抗性产生可能起关键的作用,并进而设计了发夹结构DNA 进行了验证。在此基础上,以烟草上危害最为严重的PVY、CMV和TMV 为材料,克隆并构建了包含3 种病毒部分CP 基因的发夹结构DNA 的植物表达载体,转化烟草,首次培育获得了抗3 种病毒转基因烟草。研究结果将为烟草病毒病的防治提供理论依据和技术支持,具有很好的理论和应用价值。具体研究结果如下:1. 烟草病毒的检测新技术研究—烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用1.1 病毒的分离从山东感病的烟草和马铃薯上,分离纯化了马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)、马铃薯X 病毒(PVX-SD1)、烟草花叶病毒(TMV-SD1)、烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)、黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)和烟草环斑病毒(TRSV-SD1)等6 种烟草上常见的病毒。1.2 病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析
白建芳[6]2010年在《百合双价抗病毒载体的构建及遗传转化的研究》文中提出百合病毒病能导致切花品质低下、种球退化严重,可给百合种植业带来较大的危害,目前已成为亟待解决的世界性难题。目前,RNA介导的病毒抗性研究为百合的抗病毒工程提供了有力的理论基础。本研究首先从感染了百合无症病毒(LSV)和百合斑驳病毒(LMoV)的百合叶片中分别提取总RNA,并以此为模板利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别扩增出439 bp的LSV CP基因和376 bp的LMoV CP基因片段。然后利用重迭延伸PCR技术获得LSV-LMoV融合的基因片段。应用Gateway基因克隆技术将此LSV-LMoV融合基因片段,通过BP反应克隆到入门载体pDONR201,再通过LR反应将目的片段反向重复亚克隆到植物表达载体pH7GWIWG2 (Ⅱ),获得了抗病毒植物表达载体pH7GWIWG2 (Ⅱ) -LSV-LMoV。为了研究表达载体在转基因百合体内的表达情况,本文建立了转基因百合的LSV-LMoV实时定量PCR检测方法。首先利用基因克隆技术,对百合常用的4个内参基因Actin、18s rRNA、EF-1α-1和EF-1α-2分别进行了克隆,然后利用实时定量PCR技术对他们的表达量进行检测。Rotor-gene软件的分析结果表明,Actin基因在不同百合品种的不同组织中表达都比较稳定,确定其可以作为定量分析的内参基因。以“索邦”和“白天堂”百合的无菌子球鳞片为转化受体材料,根癌农杆菌EHA105为转化菌株,潮霉素基为筛选标记基因。利用RNA介导的病毒抗性的机制,将植物表达载体pH7GWIWG2 (Ⅱ)-LSV-LMoV对百合苗进行了遗传转化。利用RT-PCR及实时定量PCR技术对78株“索邦”,和69株“白天堂”转基因百合进行检测,结果表明,转化的“索邦”百合中有17株为阳性苗,“白天堂”百合中有6株为阳性苗,据此确定获得了RNA介导的百合抗性植株,但对病毒的抗病能力有待进一步研究。
律凤霞[7]2008年在《RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用》文中提出烟草病毒病是世界各烟草产区普遍发生的一类主要病害,也是其它农作物的主要侵染毒源,其种类多,危害严重。生产中常以选用抗病品种作为主要防治手段,但抗病品种存在抗性单一、抗性资源狭窄等局限,不能持久、有效地控制病毒危害。RNA干涉技术为病毒病害的防治开拓了一条新机制。本试验依据RNAi机制,以TMV复制酶基因部分序列为靶序列,经反向重复连接构建到含35S超强启动子的表达载体,转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌LBA4404中,完成植物双元表达载体系统构建。经叶盘法转化获得11株转基因烟草苗。经人工接毒验证,其中7株对TMV具有免疫级抗性。初步证实了RNAi在增强植物抵抗病毒能力方面的显着效果。试验主要内容包括:1.目的基因靶序列的克隆首先对TMV 5种分离株复制酶基因序列进行BlastP序列比对,寻找保守序列,确定进行RNAi的靶序列,设计靶序列引物TMV-r1/TMV-r2。从黑龙江省烟草研究所试验场采集感染普通花叶病的烟草幼嫩叶片,提取TMV总RNA,经RT-PCR获得复制酶基因cDNA序列,应用靶序列引物TMV-r1/TMV-r2进行PCR扩增,产物连接到pMD18-T Simple Vector,转化到大肠杆菌中扩繁,获得RNAi靶序列。2.RNAi双元载体系统构建利用RNAi载体多克隆位点及目的序列边缘的相同酶切位点,采用酶切后连接方法,成功构建含TMV-r序列反向重复结构的中间载体(pUCCRNAi-TMV2)和表达载体(pC2300-35S-OCS-TMV)。经特异引物PCR扩增验证、限制性内切酶酶切验证,证实连接正确后经大肠杆菌扩繁,成功完成RNAi双元载体系统构建。3.农杆菌介导法转化烟草通过叶盘法,RNAi工程农杆菌侵染无菌烟草组培苗,通过添加卡那霉素的选择培养基,成功筛选出23株卡那抗性个体,将抗性转化植株移栽到温室培养。4.转基因烟草的分子生物学检测及抗性验证改良CTAB法提取抗性烟草DNA,分别以TMV-r1/TMV-r2引物、35S-A/35S-B引物对抗性材料进行常规PCR鉴定,确定了11株阳性转基因烟草苗。利用人工接种TMV进行转化材料的抗病性鉴定。结果表明:与转TMV复制酶全基因的阳性对照品种和非转化材料阴性对照相比,RNAi转基因个体的抗病性明显高于对照,其中7株达到免疫级水平。5.RNAi效果的荧光定量PCR分析选择表现免疫级抗性的转基因烟草苗4株,转TMV复制酶全基因苗1株,非转基因普通烟草苗3株,分别提取各自总RNA,经荧光定量PCR反应分析植株体内病毒复制酶基因mRNA拷贝数。分析结果证实:出现RNAi效果的转基因烟草中,病毒复制酶基因mRNA拷贝数明显低于其他对照品种,证实了RNAi转基因烟草对人工接种TMV的抗性源于RNAi引起的病毒基因转录产物mRNA的降解。为RNAi技术在抗病毒育种中应用提供理论依据。
罗静[8]2007年在《TuMV及其与CMV的嵌合片段对菜心和甘蓝的遗传转化》文中进行了进一步梳理十字花科包括白菜类、甘蓝类、芥菜类、萝卜类等重要的蔬菜作物。病毒病是危害十字花科蔬菜的主要病害之一。目前，人们主要通过常规育种，从优质的种质资源中导入抗性基因／簇，提高作物对病毒病的抗性。但传统育种由于育种周期长、抗性基因常与不良性状连锁、优良种质资源的匮乏，以及物种间生殖隔离等因素的限制，阻碍了育种进程的快速发展。因此，利用基因工程创造新的抗病毒种质资源为当今抗性育种的一条重要补充途径。本研究主要利用RNA干涉的原理，试图通过基因工程的手段得到能抗芜菁花叶病毒(TuMV)的菜心资源，以及同时抗芜菁花叶病毒和黄瓜花叶病毒(CMV)的甘蓝种质资源。利用芜菁花叶病毒CP基因构建成反向重复表达载体，再利用农杆菌介导法将其导入四九菜心，共获得13个PCR阳性转化株，遗传转化效率为2.2％。为了得到对芜菁花叶病毒和黄瓜花叶病毒双抗的甘蓝资源，首先进行了甘蓝再生体系的优化。对甘蓝下胚轴外植体的高效再生体系的优化结果表明，当选取5d苗龄的下胚轴，将其置于MS+6-BA1.0 mg／L+NAA 0.1mg／L的芽分化培养基中，并于培养基中附加AgNO_3 5.0mg／L时，可达到最佳的再生率。将含有TuMV的CP基因和CMV的2b基因组成的嵌合基因反向重复表达载体，利用农杆菌介导法将其导入甘蓝，PCR检测共获得10个阳性转化株，遗传转化效率为10.4％。进一步的病毒抗性检测正在进行之中，有望能获得双抗的优良甘蓝自交系材料，从而加速甘蓝的抗病毒育种进程。
李开东[9]2011年在《利用双T-DNA载体系统和RNAi培育抗水稻条纹病毒转基因水稻》文中提出双T-DNA载体系统是实现筛选完成后删除选择标记基因的一种简便可行的方式。为获得无选择标记抗水稻条纹病毒(RSV)的转基因水稻,本研究通过构建RNAi的双T-DNA植物高效表达载体,采用根癌农杆菌(EHA105)介导的方法转化水稻,经潮霉素抗性筛选、PCR检测及Southern、Northern杂交分析,获得了无抗生素标记的、高抗RSV水稻新种质,为水稻抗RSV育种奠定了基础。具体结果如下:1.以双元载体pCAMBIA1300为基础,加入高效表达的玉米泛素基因Ubi启动子;然后以pBI121中的Nos3′+T-DNA LB为模板,设计引物(在引物的两端加上合适的限制性内切酶位点,且在3′端加上T-DNA RB序列),PCR扩增得到含有Nos终止子+LB+RB的cDNA片段,进一步连接于重组载体中,获得含有双T-DNA的表达载体pCAMBIA1300DT。测序验证载体构建的准确性。继而以RSV的SP基因为模板,PCR克隆SP基因3′端400bp的cDNA片段,分别反向插入构建的双T-DNA的表达载体pCAMBIA1300DT中PLD基因内含子的两侧,构建了RNAi植物表达载体pDTRSVSP。2.将构建的植物表达载体pDTRSVSP利用冻融法导入农杆菌EHA105,转化水稻豫粳6号及抗虫、抗除草剂水稻新材料SK。经潮霉素筛选、PCR检测,分别获得豫粳6号转基因植株20株和SK转基因植株18株。PCR检测的结果表明hpt基因和SP基因的共转化率为44.7%。3.含hpt基因和SP基因的T0代转基因植株自交后,获得的T1代转基因株系,分子检测表明有13.08%的植株只含有SP基因;这些植株进一步自交,在T2代获得了无hpt基因、而SP基因纯合稳定的豫粳6号转基因株系6个、SK转基因株系5个。.4.对获得的11个仅含目的基因的T2代纯合株系进行RSV抗性鉴定,结果显示,有3个豫粳6号转基因株系和2个SK转基因株系表现为高抗,植株的感病率在5%以下。另外抗虫鉴定结果还显示,2个SK转基因株系仍高抗螟虫。5.对5个表现高抗株系的目的基因的Southern杂交结果显示,在所检测的株系中目的基因均以低拷贝整合。Northern杂交结果显示,在RNA上样量大致相等的情况下,抗性植株中RNA的积累量明显低于感病植株,转基因植株中可检测到siRNA,表明转基因植株的抗病性是由RNA介导的。
吴斌, 姜雅元, 马进, 朱常香, 温孚江[10]2011年在《利用RNA干扰技术培育双抗RSV和RBSDV的转基因水稻》文中研究指明利用RNA介导病毒抗性培育抗病毒的转基因植物是新发展起来的一种抗病毒基因工程新策略,它具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究分别以水稻条纹病毒(Rice strip virus,RSV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)全长衣壳蛋白(Coat protein,CP)基因为模板,通过PCR技术亚克隆获得RSV和RBSDVCP中间300bp的cDNA片段,拼接成嵌合基因,反方向插入双元载体pCAMBIA1300中,构建了植物表达载体pRSSD。将pRSSD通过冻融法导入农杆菌EHA105,采用农杆菌介导法转化水稻镇稻88和抗虫、抗除草剂水稻新品系SK,获得大量的转基因植株。初步的抗病检测表明,部分转基因水稻可显着抵抗RSV和RBSDV的侵染。
参考文献：
[1]. 利用RNA介导的病毒抗性培育双抗病毒转基因植株[D]. 白庆荣. 山东农业大学. 2004
[2]. 基于miRNA和siRNA策略抗水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的研究[D]. 孙林. 山东农业大学. 2016
[3]. 嵌合基因结构对发夹RNA介导的病毒抗性的影响及双抗转基因水稻新材料的培育[D]. 谢雪迎. 山东农业大学. 2014
[4]. amiRNA介导抗性转基因烟草植株的抗病性分析[D]. 艾涛波. 山东农业大学. 2010
[5]. 烟草病毒的检测和防治新技术研究[D]. 朱常香. 山东农业大学. 2005
[6]. 百合双价抗病毒载体的构建及遗传转化的研究[D]. 白建芳. 大连理工大学. 2010
[7]. RNA干涉技术在烟草抗TMV病毒育种中的应用[D]. 律凤霞. 黑龙江八一农垦大学. 2008
[8]. TuMV及其与CMV的嵌合片段对菜心和甘蓝的遗传转化[D]. 罗静. 首都师范大学. 2007
[9]. 利用双T-DNA载体系统和RNAi培育抗水稻条纹病毒转基因水稻[D]. 李开东. 山东农业大学. 2011
[10]. 利用RNA干扰技术培育双抗RSV和RBSDV的转基因水稻[C]. 吴斌, 姜雅元, 马进, 朱常香, 温孚江. 中国植物病理学会2011年学术年会论文集. 2011
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