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酶切基因组构建CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库及验证

2020-12-02阅读(962)

酶切基因组构建CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库及验证

论文摘要

基因编辑作为生物工程中重要技术之一,在基础研究、临床治疗、遗传育种、生态多样性等方面得到广泛的应用。新型人工核酸内切酶CRISPR/Cas9系统的出现,大大提高了基因编辑的效率。CRISPR/Cas9系统在基因功能缺失方面表现出高效、精准的编辑作用。同时CRISPR/Cas9系统应用过程中的易操作性、低成本性等优势,也使得CRISPR/Cas9系统可以作为基因敲除文库的基础技术,支撑全基因组高通量的筛选工作。目前,依赖人工设计、合成guide RNA并构建guide RNA文库的建库策略,已实现小鼠、人等物种的基因组敲除文库的构建。然而大规模高通量合成过程中,人工操作与成本是不可忽略的。同时guide RNA设计受到物种基因组注释程度的严重制约,对于注释程度低的物种,所设计的基因组范围的guide RNA覆盖度大受影响。设计一个高效、非合成的高覆盖度guide RNA文库的建库策略,对于CRISPR/Cas9系统介导的敲除文库的构建至关重要。目前已有报道关于利用酶处理方式进行文库构建的建库策略,但研究中仍存在一些问题尚待解决,包括敲除文库搭载体系、guide RNA片段来源、筛选应用局限性等。针对这些存在的问题,以及合成型CRISPR/Cas9敲除文库构建策略的局限性,设计并提出新的CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库的构建策略——“酶切—三级文库法”构建全基因组敲除文库。根据TypeII型限制性内切酶与TypeIIS型限制性内切酶的特性,通过利用生物核酸作为原材料,依靠限制性内切酶识别位点的特点,通过酶处理DNA的方式获得可以用于作为guide sequence的DNA片段,并构建对应的敲除文库。这一策略的提出,既避免了guide RNA设计过程中受生物信息注释程度的影响,同时避免合成guide RNA的工作,以生物体內源核酸作为guide RNA,大大减少了建库成本。本策略可以应用于任一物种——仅需提取该物种基因组,这样的通用型建库策略,为各个物种的研究工作提供建库策略,并依靠获得的敲除文库,对各个物种生物学进程机制相关基因挖掘,并揭示生物学进程背后的分子机制。本论文设计的“酶切—三级文库法”构建策略如下:（1）一级文库f.MspI文库的构建。对基因组进行MspI消化,其识别位点CCGG中包含guide RNA相关的PAM序列CGG,消化产物连入去磷酸化的f.MspI vector中,构建成功的载体特点为:MspI消化产物的DNA片段两端连入载体后,与两端相邻的载体上具有MmeI与MlyI识别位点,这样的载体文库构成了一级文库f.MspI文库;（2）生物素化PCR扩增。利用生物素标记引物对f.MspI文库进行扩增,获得f.MspI文库中关键区并加以生物素标记;（3）MmeI内切酶处理及特异片段回收。对生物素化的PCR产物进行MmeI消化,MmeI在识别位点下游20bp处对DNA进行切割,获得基因组来源的20bpDNA片段,酶切产物利用3%琼脂糖凝胶电泳分离并回收150bp与75bp两条片段;（4）磁珠吸附与MlyI内切酶处理。对回收的特异片段进行吸附,利用MlyI进行酶切处理,将20bpDNA片段与f.MspI vector来源的多余DNA切割分离,处理后上清进行MlyI失活处理;（5）二级文库PAM-F文库的构建。失活处理的MlyI产物——20bp基因组来源的DNA片段连入PAM-Fv4.0载体中,获得对应的二级文库PAM-F文库;（6）三级文库lenti文库的构建。利用EcoRI与KpnI将PAM-F文库中U6-gRNA区域连入lentiCRSIPRv2载体中,获得对应的三级文库lenti文库。首先针对质粒pEGFP-C1构建其对应的敲除文库,以用于验证“酶切—三级文库法”构建策略可行性。质粒pEGFP-C1经MspI消化后构建对应的一级文库f.MspI文库,利用生物素化PCR扩增关键区域,同时对其进行MmeI内切酶消化,切割产生靶向pEGFP-C1质粒的20bpDNA片段;利用链霉亲和素包被的磁珠吸附带有20bp片段的DNA片段,此时DNA片段固定端是载体来源序列,另一端游离端为20bp基因组来源序列。利用MlyI对体系进行酶切处理,将20bpDNA片段释放至上清液中,以用于二级文库构建。将20bpDNA片段连入PAM-Fv4.0载体中,获得对应的PAM-F文库,并将U6-gRNA区域连入lentiCRISPRv2载体中构建获得lenti文库,以用于后续筛选。通过病毒包装获取针对pEGFP-C1的敲除文库,用于稳定表达PKpG细胞系筛选。经病毒感染及筛选后发现,PKpG细胞系中出现EGFP阴性细胞,经流式细胞分析检测EGFP阴性率,经检测发现EGFP阴性细胞比例约为50%左右（50.8%±14.8%,47.4%±1.2%,48.2%±3.7%）,显著高于对照组与空白组。这证明针对pEGFP-C1构建的敲除文库能够用于后续实验筛选工作,进一步可以证明利用“酶切—三级文库法”构建策略的有效性。在针对pEGFP-C1构建敲除文库的过程中,针对策略中的实际实施情况与对应结果进行构建步骤的优化。包括添加接头的方式与构建三级文库二者之间的比较,关键限制性内切酶效率验证及针对不充分反应的调整,f.MspI文库载体优化构建,PAM-F文库相关载体的优化等,通过优化建库步骤,提高最终的建库效率。随后,根据“酶切-三级文库法”构建策略,针对小鼠、猪基因组进行全基因组敲除文库的构建,以验证本策略应用于全基因组敲除文库的构建效率。基因组DNA经MspI消化后构建对应的一级文库f.MspI文库,利用生物素化PCR扩增关键区域,同时对其进行MmeI内切酶消化;利用链霉亲和素包被的磁珠吸附生物素化的DNA片段,利用MlyI对体系进行酶切处理,释放20bpDNA片段。将20bpDNA片段连入PAM-Fv4.0载体中,获得针对小鼠、猪基因组的PAM-F文库,对获得的f.MspI文库以及PAM-F文库进行高通量测序。测序结果表明,获得的针对小鼠、猪基因组的guide RNA文库靶位点广泛分布于基因组中,包括编码区、非编码区、调控区以及基因间区域等。这说明依赖酶切-三级文库策略可以针对哺乳动物成功构建全基因组敲除文库。上述结果表明,“酶切—三级文库法”构建策略可以对不同物种进行CRISPR/Cas9介导的全基因组敲除文库的构建。相比较于此前的文库构建策略,本策略的优势在于:酶切—三级文库可以避免因物种生物信息不全导致的guide RNA设计受局限;建库过程中能够大大降低成本与操作量;同时本策略构建的敲除文库在基因组范围内覆盖度更高,这导致筛选结果来源多样,处编码区外,对非编码区以及顺式调控区同样存在靶向位点;此外利用本策略构建的guide RNA文库同样可以应用于表观修饰筛选过程。但同时,本文库构建策略仍存在不足以待后续优化:由于MspI的识别位点局限性,导致了基因组中其他PAM序列的遗漏。由于受到CRISPR/Cas9系统的局限性问题,导致对非编码区敲除效率低于编码区敲除效率。消化后的基因组复杂程度高,因此在构建f.MspI文库过程中,需对相关操作加以优化。在未来的工作当中,针对这些不足与问题,进行构建策略的进一步优化,以提出构建效率更高、操作更便捷、覆盖程度更高、应用范围更广的全基因组敲除文库构建策略。

论文目录

  • 摘要
  • 英文摘要
  • 1 引言
  •   1.1 CRISPR/Cas9 系统
  •     1.1.1 CRISPR系统的发现
  •     1.1.2 CRISPR系统的结构
  •     1.1.3 CRISPR系统的类型
  •     1.1.4 CRISPR系统的作用机制
  •   1.2 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑
  •     1.2.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑原理
  •     1.2.2 CRISPR/Cas9 系统与哺乳动物基因编辑
  •     1.2.3 多途径介导的CRISPR/Cas9 系统的应用
  •     1.2.4 Cas9 变体及其应用
  •     1.2.5 CRISPR/Cas9 系统与传统基因编辑技术的比较
  •     1.2.6 CRISPR/Cas9 系统应用的局限性
  •   1.3 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库及应用
  •     1.3.1 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库
  •     1.3.2 CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库构建策略
  •     1.3.3 传统CRISPR/Cas9 系统介导的敲除文库构建方法的局限性
  •   1.4 非合成策略构建基因组敲除文库
  •     1.4.1 酶处理策略构建基因组敲除文库
  •     1.4.2 随机断裂处理策略构建基因组敲除文库
  •     1.4.3 非合成策略构建敲除文库的优势
  •     1.4.4 非合成策略构建敲除文库的待优化条件
  •   1.5 酶处理策略的相关限制性内切酶
  •     1.5.1 TypeIIS型限制性内切酶及其应用
  •     1.5.2 限制性内切酶MspI及其应用
  •   1.6 本研究的目的和意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验动物
  •     2.1.2 主要仪器设备
  •     2.1.3 限制性内切酶
  •     2.1.4 主要试剂及试剂盒
  •     2.1.5 常用试剂配制
  •     2.1.6 主要生物信息分析软件及网站
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 常规分子实验方法
  •     2.2.2 常规细胞实验方法
  •     2.2.3 酶切-三级文库策略构建敲除文库方法
  •     2.2.4 检测分析
  •     2.2.5 高通量测序数据分析
  • 3 结果与分析
  •   3.1 CRISPR/Cas9 系统介导的基因敲除效率验证
  •     3.1.1 PKpG细胞系的获得及特征鉴定
  •     3.1.2 针对EGFP的 guide RNA设计及载体构建
  •     3.1.3 EGFP基因敲除效率验证流程及效率检测
  •     3.1.4 短guide RNA对 EGFP基因敲除效率的影响
  •   3.2 酶处理策略构建CRISPR/Cas9 敲除文库的探索与优化
  •     3.2.1 酶切-接头法的敲除文库构建策略及建库初探
  •     3.2.2 限制性内切酶MmeI的反应条件
  •     3.2.3 酶切-三级文库法的敲除文库构建策略探索与优化
  •   3.3 酶切-三级文库法构建敲除文库——以pEGFP-C1 质粒为例
  •     3.3.1 敲除文库构建流程
  •     3.3.2 一级文库f.MspI文库的构建及检测
  •     3.3.3 二级文库PAM-F文库的构建及检测
  •     3.3.4 三级文库lenti文库的构建及检测
  •     3.3.5 针对pEGFP-C1 质粒的敲除文库验证流程
  •     3.3.6 针对pEGFP-C1 质粒的敲除文库效率的验证
  •   3.4 酶切-三级文库法构建敲除文库——以小鼠、猪基因组为例
  •     3.4.1 针对小鼠、猪基因组敲除文库的构建流程
  •     3.4.2 针对小鼠、猪基因组的f.MspI文库构建
  •     3.4.3 针对小鼠、猪基因组的PAM-F文库及lenti文库构建
  • 4 讨论
  •   4.1 酶切-三级文库建库策略的可行性分析
  •     4.1.1 建库结果分析
  •     4.1.2 建库策略的普适性分析
  •   4.2 酶切-三级文库策略的优势
  •     4.2.1 与合成策略比较
  •     4.2.2 与酶处理策略相关研究比较
  •     4.2.3 MspI介导的PAM定位优势
  •   4.3 酶切-三级文库策略的不足
  •     4.3.1 MspI识别位点的局限性
  •     4.3.2 对非编码区的敲除效率
  •   4.4 展望
  •     4.4.1 敲除文库的筛选应用
  •     4.4.2 待优化的建库策略
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 吕嘉伟

    导师: 刘忠华

    关键词: 文库,限制性内切酶,全基因组,反向遗传筛选

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 东北农业大学

    分类号: Q78

    总页数: 134

    文件大小: 10979K

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