RNA原位检测技术的开发及其在lncRNA检测中的应用

论文摘要

RNA表达具有高度异质性,准确检测RNA的表达丰度和空间位置能够了解不同时期细胞和组织中各基因动态表达情况,并可以更好地理解机体成分间的作用机制。本研究旨在开发一种利用双连接探针对目标基因的表达进行定量定位分析的新型单分子RNA原位检测技术,并更高效地应用构建空间基因表达谱。在锁式探针和滚环扩增的基础上,本研究主要创新在于设计新型探针-双连接探针,通过考察验证双连接探针的设计原则,测试比较检测效率,并将其应用到不同种类RNA的检测,建立了利用双连接探针基于滚环扩增的RNA原位检测的方法。首先以ACTB管家基因为模型,类比锁式探针检测反应,通过优化逆转录、双连接探针第一步连接和基于夹板的成环反应体系,建立基于双连接探针的RNA原位检测基本方法。比较双连接探针与锁式探针的方法,得出双连接探针检测效率高于锁式探针。然后将此方法扩展到其他mRNA的检测,以在细胞爬片和病理组织切片中检测KRAS和乳腺癌相关基因为例,考察方法的特异性和稳健性。而后将方法应用到癌细胞lncRNA的多重检测和mRNA与lncRNA的同时检测,再次证明方法的稳健性。检测lncRNA SNP位点时,通过改变探针设计、清洗条件、连接酶和反应体系,可使假阳性率降低到1%以下。本文通过双连接探针与锁式探针多次比较实验,验证本方法更加高效。同时又通过SNP位点的检测实验,实现了较高的单碱基识别特异性。此方法可以结合多种原位测序技术,实现在单细胞、单分子、单碱基水平上的RNA高度多重基因表达原位检测。由于原位检测结果与临床信息的一致性,本方法优化后有望成为应用于基础研究和临床诊断的新技术。

论文目录

摘要

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第1章引言

1.1 RNA原位检测的必要性

1.2 RNA原位检测方法

1.3 课题的提出

1.4 技术路线

第2章 RNA原位检测方法反应条件的优化

2.1 引言

2.2 实验材料和方法

2.2.1 细胞系

2.2.2 主要试剂和仪器

2.2.3 引物、探针的设计与合成

2.2.4 主要溶液的配制

2.3 反应条件的优化

2.3.1 细胞培养

2.3.2 双连接探针的磷酸化

2.3.3 细胞透化

2.3.4 原位逆转录

2.3.5 第二次固定

2.3.6 双连接探针的第一步连接

2.3.7 双连接探针的第二步连接

2.3.8 滚环扩增

2.3.9 检测

2.3.10 脱水封片

2.3.11 荧光显微镜拍照成像

2.3.12 图像分析与统计

2.3.13 原位逆转录条件优化

2.3.14 第一步连接体系的优化

2.3.15 夹板浓度

2.4 双连接探针与锁式探针的比较

2.5 结果

2.5.1 逆转录步骤的确定

2.5.2 第一步杂交体系的优化结果

2.5.3 夹板探针浓度的确定

2.5.4 双连接探针与锁式探针的检测效率比较

2.6 小结与讨论

第3章 mRNA的原位检测

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.3 mRNA原位检测

3.3.1 KRAS突变的原位检测

3.3.2 乳腺癌基因的原位检测

3.4 结果

3.4.1 KRAS突变检测结果

3.4.2 乳腺癌细胞系检测结果

3.4.3 乳腺癌病理切片检测结果

3.5 小结与讨论

第4章 lncRNA的原位检测

4.1 引言

4.2 实验材料和方法

4.3 检测lnc RNA的探针引物设计

4.3.1 不同靶位点及引物

4.3.2 双连接探针靶序列的不同长度

4.3.3 双连接探针无关序列的长度

4.4 lncRNA的多重检测

4.5 mRNA与 lncRNA的同时检测

4.5.1 HER2与HOTAIR

4.5.2 ESR1与DLEU

4.6 lncRNA SNP位点的检测

4.6.1 基本方法检测

4.6.2 两步连接的探索

4.6.3 针对第二步连接酶的清洗条件

4.6.4 双连接探针靶序列长度

4.6.5 检测MALAT1 不同SNP连接位点（Rs12793094）

4.6.6 第一步连接的甲酰胺浓度

4.6.7 夹板长度比较

4.7 优化方法检测SNP

4.7.1 检测 MALAT1 SNP Rs3200401

4.7.2 检测 CYTOR SNP Rs7657

4.8 对照实验

4.8.1 反应步骤阴性对照

4.8.2 靶序列scramble阴性对照

4.8.3 多重与单重检测

4.9 结果

4.9.1 不同靶位点及引物检测效率结果

4.9.2 双连接探针靶序列长度的影响

4.9.3 双连接探针的无关序列的影响

4.9.4 MALAT1、CYTOR、H19 检测结果

4.9.5 mRNA与相关lnc RNA的检测

4.9.6 lncRNA SNP的条件优化

4.9.7 优化方法的检测应用

4.9.8 对照实验结果

4.10 小结与讨论

第5章测序验证原位检测方法

5.1 实验材料

5.1.1 主要试剂和仪器

5.1.2 DNA提取

5.1.3 引物的设计与合成

5.2 实验方法

5.2.1 SNP位点PCR测序

5.2.2 RNA-seq

5.2.3 对应RNA-seq测序结果进行原位检测

5.3 结果

5.3.1 SNP测序结果

5.3.2 RNA-seq lncRNA测序结果

5.3.3 原位检测结果

5.4 小结与讨论

第6章总结与展望

6.1 课题总结讨论

6.2 存在问题及展望

参考文献

致谢

附录A 引物探针序列

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋博雅

导师: 柯荣秦

关键词: 原位检测,滚环扩增,双连接探针

来源: 华侨大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华侨大学

分类号: Q522

总页数: 144

文件大小: 4570K

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