首页> 正文

法布雷病GLA基因新突变的鉴定及致病机制研究

2020-12-08阅读(559)

法布雷病GLA基因新突变的鉴定及致病机制研究

论文摘要

法布雷疾病（Fabry disease;FD）,是因GLA基因编码的α-半乳糖苷酶A缺失或完全丧失而导致的糖鞘脂类底物积累的先天性X连锁隐性遗传病。其发病症状随底物在患者体内积累部位的不同而异。男性患者发病严重,女性多为携带者且症状较轻。本课题为了进一步研究GLA基因突变导致FD的分子机制,构建了GLA野生型及突变体的细胞模型,并对新发突变位点进行了致病性研究,同时对突变体的结构及功能做了详细分析。1.首先对5个FD先证者进行了GLA基因的Sanger测序,确定突变位点分别为:c.119C>A、c.101A>G、c.680G>C、c.801+1G﹥A和c.280T﹥C,分析各个突变的研究进展,发现c.801+1G﹥A和c.280T﹥C两个突变位点为新发突变。因此,本研究主要围绕GLA基因突变c.801+1G﹥A和c.280T﹥C的致病机制进行研究。2.利用qRT-PCR技术检测患者血液中GLA基因mRNA的表达量。与正常人相比,患者体内GLA基因的表达量都有所下调且含有c.801+1G﹥A突变的患者下调更多。由于c.801+1G﹥A突变位点位于Intron 5第一位,可能影响前体mRNA的剪接。利用RT-PCR技术检测患者体内GLA基因的转录本。研究表明,患者体内除正常转录本外,还存在一个分子量较大的转录本,经测序分析,该转录本是在Exon 5和Exon6之间插入了36 bp的Intron 5所致;为了进一步阐明剪接异常是否由该突变导致,我们利用minigene技术转染HEK293T细胞来研究该突变对minigene基因转录的影响,结果在mRNA水平和蛋白水平均证明c.801+1G﹥A突变可以引起GLA基因mRNA的异常剪接。3.利用生物信息学、生物化学及细胞生物学的方法对突变体蛋白的结构和功能做进一步研究。通过序列同源性比对发现,这两个突变位点在不同物种中都高度保守;同源建模分析蛋白质的三级结构发现,c.801+1G﹥A（p.L268IfsX3）突变导致GLA酶活性区域严重受损,部分Domain 1（氨基酸残基269-330）及全部Domain 2（氨基酸残基331-429）的结构丢失;c.280 T﹥C（p.C94R）突变紧邻酶活性位点D92和D93,可能影响该酶与底物的结合,而且突变导致C94与C52形成的二硫键断裂,影响了蛋白质结构的稳定性。4.构建GLA-WT及GLA-MT的真核表达载体,通过细胞转染,免疫荧光技术检测发现,GLA c.801+1G﹥A突变体蛋白在细胞质内形成聚集体,并且呈斑点状不均匀分布。另外,与GLA-WT转染的细胞相比,c.801+1G﹥A突变体可以加速细胞衰老;c.280 T﹥C突变体在细胞内的定位虽无明显改变,但可导致细胞核发生皱缩;α-半乳糖苷酶酶活性分析显示,与GLA-WT相比,这两个突变体的酶活性均发生下调,且GLA c.801+1G﹥A突变体的酶活性下降更为显著。综上所述,本研究以法布雷患者血液为研究材料,利用Sanger测序技术检测到两个GLA基因的两个新发突变,应用生物信息学、分子生物学、生物化学及细胞生物学手段找到基因突变引起患者发病的分子机制,该研究成果将进一步丰富Fabry disease突变数据库并为FD的临床精确诊断提供理论依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 引言
  •   1.2 法布雷疾病（Fabry disease;FD）
  •     1.2.1 FD概述
  •     1.2.2 FD临床症状
  •     1.2.3 FD临床诊断
  •     1.2.4 FD治疗策略
  •   1.3 α-半乳糖甘酶（GLA）
  •     1.3.1 GLA概述
  •     1.3.2 GLA基因突变
  •   1.4 本研究的目的及意义
  • 第二章 法布雷病相关基因GLA新突变位点的鉴定
  •   2.1 引言
  •   2.2 研究对象与材料
  •     2.2.1 研究对象
  •     2.2.2 实验试剂
  •     2.2.3 仪器设备
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 基因组DNA的提取
  •     2.3.2 利用Sanger测序技术鉴定GLA突变位点
  •   2.4 实验结果
  •   2.5 讨论与分析
  • A和c.280T>C致病机制的研究'>第三章 GLA新发突变c.801+1G>A和c.280T>C致病机制的研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料与仪器
  •     3.2.1 细胞系及试剂
  •     3.2.2 仪器设备
  •     3.2.3 试剂配制
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 感受态细胞的制备
  •     3.3.2 血液mRNA的提取和反转录
  •     3.3.3 RT-PCR技术检测患者体内GLA基因的异常转录本
  •     3.3.4 GLA-minigene载体的构建
  •     3.3.5 细胞培养及转染
  •     3.3.6 细胞总RNA的提取及反转录
  •     3.3.7 Western Blot
  •     3.3.8 实时荧光定量PCR
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 GLA基因突变对患者体内mRNA表达量的影响
  • A突变对患者体内mRNA表达量的影响'>      3.4.1.1 c.801+1G>A突变对患者体内mRNA表达量的影响
  • C突变对患者体内mRNA表达量影响'>      3.4.1.2 c.280T>C突变对患者体内mRNA表达量影响
  •     3.4.2 c.801+1G﹥A突变对患者体内mRNA剪接的影响
  •     3.4.3 minigene技术证明c.801+1G﹥A突变影响GLA基因的剪接
  •   3.5 讨论与分析
  • 第四章 突变位点对蛋白质结构和功能的影响
  •   4.1 前言
  •   4.2 实验材料与仪器
  •     4.2.1 细胞系及试剂
  •     4.2.2 仪器设备
  •     4.2.3 试剂配制
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 GLA突变位点的序列保守性及三级结构同源建模分析
  •     4.3.2 免疫荧光实验检测突变体蛋白在细胞内的定位
  •     4.3.3 β-半乳糖甘酶染色检测细胞的早衰
  •     4.3.4 α-半乳糖甘酶酶活性的测定
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 GLA基因突变对蛋白质结构的影响
  • A突变对蛋白质结构的影响'>      4.4.1.1 c.801+1G>A突变对蛋白质结构的影响
  • C突变对蛋白质结构的影响'>      4.4.1.2 c.280T>C突变对蛋白质结构的影响
  •     4.4.2 GLA基因突变对蛋白质定位及细胞表型的影响
  • A突变对蛋白质的定位和细胞表型的影响'>      4.4.2.1 c.801+1G>A突变对蛋白质的定位和细胞表型的影响
  • C突变对蛋白质定位的影响'>      4.4.2.2 c.280T>C突变对蛋白质定位的影响
  •     4.4.3 GLA基因突变对α-半乳糖甘酶活性的影响
  • A突变对酶活性的影响'>      4.4.3.1 c.801+1G>A突变对酶活性的影响
  • C突变对酶活性的影响'>      4.4.3.2 c.280T>C突变对酶活性的影响
  •   4.5 讨论与分析
  • 总结与展望
  • 参考文献
  • 攻读学位期间取得的研究成果
  • 致谢
  • 个人简况及联系方式

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张丽娟

    导师: 李平

    关键词: 法布雷,剪接突变,错义突变,三级结构,酶活性

    来源: 山西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,内分泌腺及全身性疾病

    单位: 山西大学

    分类号: R596;Q78

    DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000307

    总页数: 62

    文件大小: 4914K

    下载量: 66

    相关论文文献

    • [1].鼠肉瘤病毒致癌基因突变与非小细胞肺癌临床病理特征和预后的相关性分析[J]. 肿瘤基础与临床 2020(02)
    • [2].有关“基因突变”的几组概念辨析[J]. 生物学教学 2008(11)
    • [3].非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变236例分析[J]. 江苏大学学报(医学版) 2017(02)
    • [4].FLT3,NPM1,WT1,c-KIT基因突变在儿童急性髓细胞白血病的分布及临床意义[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志 2016(03)
    • [5].带你全面了解基因检测[J]. 抗癌之窗 2018(04)
    • [6].基因突变大部分是有害的吗?——对2011年上海生物卷第8题的讨论[J]. 中学生物教学 2011(10)
    • [7].基于生物学事实进行概念分步建构教学——以“基因突变”为例[J]. 中学生物教学 2016(23)
    • [8].丰富的探究活动打破沉默学习[J]. 中学生物教学 2017(16)
    • [9].调换座位和基因突变的关系[J]. 中学生物教学 2015(Z1)
    • [10].巧用实例及概念图突破“基因突变”中的知识要点[J]. 中学生物教学 2015(17)
    • [11].有关“基因突变”与“基因重组”的易混易错点探析[J]. 中学生理科应试 2018(04)
    • [12].基因突变的“新物种”[J]. 小学生导刊(低年级) 2018(05)
    • [13].5E教学模式在“基因突变”教学中的应用[J]. 考试周刊 2018(76)
    • [14].日本发现影响睡眠基因突变[J]. 科学大观园 2016(24)
    • [15].实验设计巧断遗传学(下)[J]. 求学 2017(09)
    • [16].神经元能够“挑选”父母基因[J]. 健康博览 2017(05)
    • [17].“基因突变”一节的参与式教学设计[J]. 新课程(下) 2017(03)
    • [18].是真的吗?[J]. 小学时代 2017(13)
    • [19].“基因突变和基因重组”复习导航[J]. 中学生理科应试 2017(Z1)
    • [20].患癌是“运气差”,但抗癌不能听天由命[J]. 晚晴 2017(07)
    • [21].“种啥收啥”那是童话里的事[J]. 祝你幸福(下旬刊) 2017(05)
    • [22].研究称修复基因突变会提升人的智力[J]. 科学大观园 2017(17)
    • [23].PNRP基因突变导致遗传型Creutzfeldt-Jakob病1例报告[J]. 家庭医药.就医选药 2016(08)
    • [24].基因检测可以告诉我们什么[J]. 今日中国 2017(09)
    • [25].基因突变什么的,还不是为了活下去[J]. 课堂内外(科学Fans) 2017(08)
    • [26].基因突变的原因及其影响[J]. 当代旅游(高尔夫旅行) 2017(08)
    • [27].基因突变并不是随机的[J]. 大科技(科学之谜) 2015(08)
    • [28].基因突变很普遍[J]. 大科技(科学之谜) 2014(09)
    • [29].美丽蓝眸源自1万年前基因突变[J]. 科学生活 2008(03)
    • [30].基因突变与中国原发性骨髓纤维化临床特征及预后[J]. 中国老年学杂志 2018(20)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    法布雷病GLA基因新突变的鉴定及致病机制研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6