付四海[1]2003年在《氨基胍对糖基化蛋白损伤血管内皮功能的保护作用及其机制》文中研究说明糖尿病是严重危害人们健康的常见病。糖尿病易并发动脉粥样硬化和高血压等血管并发症，并已成为糖尿病病人死亡的重要原因。已知糖基化终末产物在糖尿病血管并发症的发生发展中起着重要的作用。糖基化终末产物是高糖血症时体内蛋白质经非酶糖基化形成的共价化合物。它除了通过与其受体相互作用产生氧化应激，损伤血管内皮细胞以外，还可直接灭活一氧化氮(NO)，促进粘附分子表达和血管平滑肌细胞增殖，从而导致血管病变。大量研究表明，糖尿病动物和病人血中糖基化终末产物含量明显升高，并伴有血管内皮依赖性舒张功能的损害。将正常动物血管暴露于外源性制备的糖基化终末产物，也能产生与糖尿病相似的血管舒张功能损害。氨基胍作为糖基化终末产物形成抑制药，对糖尿病血管并发症具有防治作用，但氨基胍防治糖尿病血管并发症的机制并不完全清楚。近年来研究发现，氨基胍保护血管内皮不仅与其阻止糖基化终末产物形成有关，而且还与抗氧化作用密不可分。因此，探讨氨基胍对糖基化蛋白所致血管内皮损害的影响及其机制，对阐明糖尿病血管并发症的发生机制及其临床防治都具有十分重要的意义。内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非对称二甲基精氨酸（ADMA）升高是动脉粥样硬化等多种心血管疾病内皮功能不全的重要原因。近年来我室和国外其它实验室研究表明，糖尿病动物和 2型患者糖尿病病人血中内源性NOS抑制物 ADMA明显升高，并伴有血管内皮依赖性舒张功能的损害和糖基化终末产物的形成增加。然而，氨基肌能否直接对抗己形成的糖基化终末产物对血管内皮的损害作用以及氨基肌对血管内皮功能的保护作用是否与内源性NOS抑制物ADMA有关，均未见文献报道。因此，本实验通过制备外源性糖基化牛血清白蛋白从离体和在体两个层次分别探讨氨基肌对糖基化牛血清白蛋白所致的大鼠血管内皮功能不全的保护作用及其机制。 第一章氨基肌对糖基化蛋白体外孵育大鼠血管所致内皮功能损害的保护作用目的 探讨糖基化终末产物形成抑制药氨基肌对外源性制备的糖基化终末产物损伤大鼠离体胸主动脉环内皮依赖性舒张功能的影响及其机制。方法 采用外源性制备的糖基化牛血清白蛋白孵育大鼠离体胸主动脉环60 min诱导血管内皮损伤，观察氨基肌对糖基化牛血清白蛋白所致的血管内皮依赖性舒张反应损伤是否具有保护作用。结果 外源性糖基化牛血清白蛋白明显抑制乙酚胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张反应，但并不影响硝普钠诱导的内皮非依赖性血管舒张反应。用氨基肌u0－500 pmol·L‘）预孵育血管环 15 min，再与糖基化牛血清白蛋白共同孵育 60 min，呈浓度依赖性降低糖基化终末 11 产物对血管内皮依赖性舒张反应的抑制c此外，氧自由基清除剂超氧化物歧化酶＊ dismutase，SOD 200 U·ml“‘）也能完全取消糖基化终末产物的抑制作用，并与 5 00 p＊·L’氨基肌的保护作用相似。氨基肌600 pd·L”’）亦能完全逆转S①抑制剂二乙基二硫氨甲酸酯（ iethyldithiocarbamate，DETC，10 p＊l＠ L”‘）诱导内源性氧自由基产生所致的血管内皮依赖性反应损害。结论 氨基肌能取消糖基化终末产物所致大鼠离体胸主动脉环内皮依赖性舒张反应的抑制，氨基肌的这种保护作用可能与其抗氧化作用有关。
付四海, 熊燕, 付云峰, 郭征[2]2003年在《氨基胍对糖基化蛋白损伤大鼠血管内皮功能的影响》文中指出目的 探讨糖基化终末产物形成抑制药氨基胍对外源性制备的糖基化终末产物损伤大鼠离体胸主动脉环内皮依赖性舒张功能的影响及其机制。方法 采用外源性制备的糖基化牛血清白蛋白孵育大鼠离体胸主动脉环 60min诱导血管内皮损伤 ,观察氨基胍对糖基化牛血清白蛋白所致的血管内皮依赖性舒张反应损伤是否具有保护作用。结果 外源性糖基化牛血清白蛋白明显抑制乙酰胆碱诱导的内皮依赖性血管舒张反应 ,但并不影响硝普钠诱导的内皮非依赖性血管舒张反应。用氨基胍 (50～ 50 0 μmol·L- 1 )预孵育血管环 1 5min ,再与糖基化牛血清白蛋白共同孵育 60min ,呈浓度依赖性降低糖基化终末产物对血管内皮依赖性舒张反应的抑制。此外 ,氧自由基清除剂超氧化物歧化酶 (superox idedismutase,SOD ;2× 1 0 5U·L- 1 )也能完全取消糖基化终末产物的抑制作用 ,并与 50 0 μmol·L- 1 氨基胍的保护作用相似。氨基胍 (50 0 μmol·L- 1 )亦能完全逆转SOD抑制剂二乙基二硫氨甲酸酯 (diethyldithiocarbamate,DETC ;1 0 μmol·L- 1 )诱导产生内源性氧自由基所致的血管内皮依赖性反应的损害。结论 氨基胍能取消糖基化终末产物所致大鼠离体胸主动脉环内皮依赖性舒张反应的抑制 ,氨基胍的这种保护作用可能与其抗氧化作用有关
贾贺[3]2017年在《2型糖尿病大鼠脑损伤改变及氨基胍干预的脑保护作用的研究》文中提出背景:2型糖尿病作为一种慢性疾病,极易并发微血管病及多种系统病变,尤其是脑血管及中枢神经损伤,目前研究较多的在糖尿病并视网膜病变及肾脏病变,但对于2型糖尿病造成的脑血管重塑以及神经损伤在脑神经元形态结构及突触改变方面研究甚少,其病理过程仍不十分清楚,对此方面的干预治疗目前仍无突破性进展,缺乏有效的治疗措施。因此,明确2型糖尿病脑损伤机制并寻找有效的糖尿病神经保护药物,干预糖尿病引起的脑血管及脑神经元损伤,仍是当今医学的研究热点及难点。一些研究表明氨基胍在延缓2型糖尿病各种并发症治疗中都显出良好的疗效,推测其在糖尿病脑保护中具有潜在的治疗价值,但其保护机制尚未阐明。目的:本实验建立2型糖尿病大鼠模型,旨在研究2型糖尿病并发的大脑病变导致神经功能障碍的病理过程及机制,观察2型糖尿病大鼠脑血管重塑,脑神经元树突、树突棘的变化以及相关因子尤其是EGFL7、Spinophilin等在其过程中的调控作用,并研究氨基胍干预的影响,探讨2型糖尿病脑损伤的神经病理变化,及氨基胍干预可能的神经保护作用及作用机制,为临床研究和药物治疗提供一定的实验依据。第一部分2型糖尿病大鼠行为学改变及氨基胍干预的影响研究方法:SD大鼠随机分为3组:对照组、模型组(糖尿病组)、治疗组(氨基胍干预组),模型组及治疗组建立2型糖尿病大鼠模型(高糖高脂饮食+STZ(30mg/kg)一次性腹腔注射),造模成功后治疗组给予氨基酸干预(日剂量均为150mg.kg~(-1.)),分别于12周、16周观察各组大鼠神经症状,计算卒中指数评分,通过Morris水迷宫评价大鼠学习记忆能力的行为学改变。研究结果:1.各组大鼠卒中指数评分与对照组相比,模型组及治疗组大鼠卒中指数显着增高(P<0.05或P<0.01),并随着时间延长,16周模型组大鼠卒中指数显着增高(P<0.05);与模型组相比,治疗组大鼠卒中指数显着降低(P<0.05)。提示2型糖尿病大鼠随着病程延长,脑血管损伤加重;经氨基胍干预后大鼠脑血管损伤较前恢复,神经功能得到改善。2.各组大鼠Morris水迷宫评价结果与对照组相比,模型组及治疗组大鼠潜伏期明显延长,穿越平台位置次数明显减少(P<0.05或P<0.01),表明模型组大鼠的学习记忆功能下降,出现一定程度的认知功能障碍;随着病程时间延长,模型组大鼠16周学习记忆障碍加重(P<0.05)。与模型组相比,各时间点治疗组潜伏期显着缩短、穿越平台位置次数明显增加(P<0.05),表明氨基胍干预后2型糖尿病大鼠的学习记忆能力有所恢复,神经功能有所改善。第二部分2型糖尿病大鼠脑血管重塑及氨基胍干预的保护作用及机制研究方法SD大鼠随机分为3组:对照组、模型组(糖尿病组)、治疗组(氨基胍干预组),分别于12周、16周电镜下观察各组大鼠海马区脑血管重塑过程中内皮细胞变化,采用免疫组化方法测定海马区脑血管密度CD34表达变化及脑血管内皮细胞EGFL7的表达变化,用流式细胞仪LSRII检测海马区脑血管内皮细胞ROS的含量变化,采取ELISA法测定海马区脑血管内皮细胞炎症因子TNF-α和VEGF的水平变化,探讨2型糖尿病脑血管重塑的病理机制及氨基胍干预对糖尿病脑保护的作用及机制。研究结果1.脑血管透射电镜观察结果对照组:血管管腔规则,内皮细胞内核仁形态正常,清晰可见,染色质分布均匀,基底膜结构清晰。模型组:12周大鼠脑血管管腔变形,血管内皮细胞肿胀,细胞核少见,细胞内染色质聚集;基底膜结构不清晰。16周大鼠脑血管均可见不同程度管腔变形、塌陷,血管形态不规则,血管内皮细胞肿胀,细胞核基本不见,细胞内染色质大片聚集,胞浆内可见空泡样变性;基底膜肿胀增厚,结构不清晰。治疗组:各时间点治疗组大鼠脑血管呈现部分血管形态不规则,内皮细胞肿胀程度较轻,细胞内染色趋向均匀,核仁可见或不可见,胞浆内无空泡改变;基底膜肿胀不明显,结构尚清晰。2.脑血管内皮细胞CD34免疫组化表达结果与对照组相比,模型组和治疗组CD34表达均显着增加(P<0.05或P<0.01);模型组内比较,随着病程进展,16周CD34表达较12周显着增加(P<0.05);与模型组相比,治疗组各时间点CD34表达均显着减少(P<0.05)。3.脑血管内皮细胞EGFL7免疫组化表达结果对照组脑血管内皮细胞中未见EGFL7阳性表达,与对照组相比,模型组和治疗组EGFL7表达均显着增加(P<0.05或P<0.01);模型组内比较,随着病程进展,16周EGFL7表达较12周EGFL7表达显着增加(P<0.05);与模型组相比,治疗组各时间点EGFL7表达均显着减少(P<0.05)。4.脑血管内皮细胞ROS含量检测结果与对照组相比,模型组和治疗组脑血管内皮细胞ROS含量均显着增加(P<0.001或P<0.01);模型组内比较,随着病程进展,16周ROS含量较12周显着增加(P<0.05);与模型组相比,治疗组各时间点ROS含量均显着减少(P<0.01)。5.脑血管内皮细胞TNF-α/VEGF水平检测结果与对照组相比,模型组和治疗组脑血管内皮细胞TNF-α/VEGF水平均显着增加(P<0.01);模型组内比较,随着病程进展,16周TNF-α/VEGF水平较12周显着增加(P<0.05/P<0.01);与模型组相比,治疗组各时间点TNF-α/VEGF水平均显着减少(P<0.01/P<0.001)。第叁部分2型糖尿病大鼠神经元树突、树突棘变化及氨基胍干预的保护作用及机制研究方法SD大鼠随机分为3组:对照组、模型组(糖尿病组)、治疗组(氨基胍干预组),分别于12周、16周用快速灌注的Golgi染色法银染各组大鼠脑神经元,光镜下观察统计各组大鼠海马区锥体神经元树突分支、长度及树突棘密度的变化,采用免疫组化方法测定各组大鼠海马区神经元树突棘素(Spinophilin)的表达变化,探讨2型糖尿病脑神经损伤的病理机制及氨基胍干预对糖尿病脑保护的作用及机制。研究结果1.树突分支及长度的结果与对照组相比,12周、16周模型组及治疗组大鼠海马区锥体神经元树突分支、长度均显着减少(P<0.05)。模型组16周组树突分支、长度较12周组显着减少(P<0.05),说明树突分支、长度随着糖尿病病程进展逐渐减少。与模型组比较,治疗组树突分支、长度显着增加(P<0.05)。2.树突棘密度测定结果与对照组相比,12周、16周模型组及治疗组大鼠海马区锥体神经元树突棘密度均显着减少(P<0.05)。模型组16周组树突棘密度较12周组显着减少(P<0.05),说明树突棘密度随着糖尿病病程进展逐渐减少。与模型组比较,治疗组树突棘密度显着增加(P<0.05).3.树突棘素(Spinophilin)免疫组化结果与对照组相比,12周、16周模型组及治疗组大鼠海马区神经元内Spinophilin的表达显着减少(P<0.05),模型组随着时间延长呈现显着递减的趋势(P<0.05);与模型组比较,治疗组Spinophilin的表达显着增多(P<0.05)。研究结论1.2型糖尿病可造成大鼠不同程度的卒中表现及学习记忆能力下降的行为学障碍,并随病程进展进行性加重。2.氨基胍干预可改善2型糖尿病大鼠卒中指数,改善大鼠学习记忆能力,改善神经功能。3.2型糖尿病大鼠存在脑血管重塑,表现为血管内皮细胞肿胀、管腔变形狭窄、基底膜增厚、染色质聚集等,并出现增生的毛细血管,但增生的血管是病理的。4.2型糖尿病大鼠脑血管重塑过程是由多因子多环节参与的慢性病理过程,EGFL7、ROS、TNF-α、VEGF、及CD34的表达改变均参与及影响脑血管重塑过程。5.2型糖尿病大鼠脑神经元树突及树突棘呈现损伤性改变,树突棘素表达下调,进而影响神经功能,是糖尿病并发脑神经损伤的病理机制之一。6.氨基胍干预对2型糖尿病大鼠脑保护作用是通过抑制EGFL7、VEGF表达上调,减少ROS及炎症因子TNF-α的产生等途径,改善糖尿病脑血管重塑过程中血管内皮损伤及血管病理增生,发挥脑保护作用。7.氨基胍干预对2型糖尿病大鼠脑保护作用是通过改善脑神经元树突形态结构,上调树突棘素的表达调控树突棘的密度及形态改善突触功能等途径实现。
姜洪[4]2013年在《氢气抗糖基化终末产物对内皮细胞凋亡的影响及机制研究》文中研究表明背景与研究目的糖尿病是一种常见的代谢性疾病，主要表现为机体胰岛素相对或者绝对不足，导致血糖水平持续性增高。目前全球2型糖尿病患者已超过1.5亿人，而且预计在未来20年内病例数还将成倍数增长态势，全球医疗负担也会因为这一数值的显着提高而明显增加[1]。不论是1型还是2型糖尿病，随着长期高血糖水平病程的逐渐进展，均可以造成不同程度的，不同靶器官的并发症，其中以心血管病变最为常见，也最具威胁性。血管并发症是导致糖尿病患者死亡的主要原因。其中，高血压，肥胖症，动脉粥样硬化，血脂代谢异常，糖尿病肾病亦是患者预后不良的重要危险因素。在糖尿病的发生发展过程当中，血管内皮的损伤和内皮功能障碍是糖尿病重要的早期病理表现。从细胞层面来讲，内皮细胞代谢异常则是早期内皮功能受损的基本原因,伴随着内皮细胞的不断凋亡和功能受损，随之而来的则是内皮功能障碍[2.3]。晚期糖基化终末产物(AGEs)是以体内大分子物质如脂肪，蛋白质，核酸和还原性糖(葡萄糖，果糖，戊糖)为原料，在生理环境中通过发生非酶促反应，生成的稳定共价键产物。这种非酶促反应称之为---Maillard(美拉德)。1953年Hodge等学者提出了美拉德反应，该反应主要包括如下叁部分：1.初级反应阶段。还原糖的羰基与氨基之间进行加成，加成物迅速失去分子水转变为希夫碱。2.经环化形成相应的取代醛基胺，经重排后转成有反应活性的产物，其中最熟知的是糖基化血红蛋白和果糖胺。3.果糖胺等又经过一系列复杂的分解和化学重排反应最终形成了AGEs类黑精色素。AGEs一旦形成就是不可逆的，并且其具有较强的交联性和较低的溶解性。此外，AGEs还具有产生和激活ROS的能力[61]，这些特点也是其损伤血管的重要理化因素。AGEs的产生和糖尿病患者血糖水平以及高血糖暴露的时间成正相关，患者血糖水平越高，暴露高血糖的时间越久，AGEs的产生和堆积就越多。此外，局部微环境的氧化应激也是加速AGEs形成的重要因素之一[62.63]。在正常机体中，葡萄糖的糖基化反应较低。然而，在糖尿病患者体内，持续性的高血糖和局部微环境的氧化应激加速了AGEs产生和堆积。血液循环中堆积的AGEs可进行性损害血管内皮[65]。国外研究者发现，胰岛素可通过清除AGEs来保护内皮细胞功能，胰岛素通过IRS以及PI-3K通路提高机体产生NO的能力，从而提高机体对葡萄糖的转运和利用，减少AGEs的产生和保护内皮功能。此外，胰岛素还可以提高内皮细胞清道夫受体的含量，从而加速AGEs的清除。另外，蓄积在体内的AGEs低密度脂蛋白(LDL)可以形成AGEs-LDL共价化合物，形成AGEs-LDL后，LDL在体内的循环清除受阻，LDL在循环中的比例升高，致体内脂质水平明显增加，加重内皮氧化损伤。此外，血管内皮的基质成分含有胶原蛋白，它们与循环中的还原性糖发生共价结合以后可以使胶原蛋白交联，从而使血管内皮内环境受到破坏。同时，血管内皮的AGEs还能够激活单核巨噬系统，使得它们在对AGEs发生吞噬作用的同时分泌大量的细胞因子，刺激血管内皮发生氧化，应激，变形，增生，增殖，凋亡等一系列病理反应，恶化内皮功能，最终导致动脉粥样硬化，甚至血管完全闭塞。在糖尿病患者当中，持续升高的血糖状态极易导致AGEs的过量产生[4]。我们课题组的前期研究也发现，AGEs可以加快血管内皮细胞的凋亡和内皮功能不全的病理进程；在AGEs诱导的细胞当中，其细胞间活性氧(ROS)水平较对照组是明显升高的，而且同时，这种升高的细胞间ROS水平反过来进一步刺激AGEs的不断生成，形成“氧化应激-AGEs”的恶性循环[6.7]。因此，如何清除AGEs或减少这些AGEs的产生似乎可以成为减少糖尿病并发症的治疗策略之一。但是，AGEs一旦在血管内皮生成共价键，其就如一团黏着的基团，很难清除。那么，如果能够拮抗由AGEs介导的血管内皮功能损伤，则理论上也能预防或者延缓血管内皮损伤-动脉粥样硬化的进程[8]。所以，探寻一种拮抗AGEs介导的内皮细胞氧化应激以及凋亡的治疗策略有望成为防治糖尿病并发症的潜在切入点。传统的抗氧化应激的制剂包括维生素C，维生素E，β胡萝卜素，超氧化物歧化酶等。由于结构和效价关系的限制，这些天然抗氧化剂的抗氧化作用较弱且作用可逆，组织穿透能力差，而且其循证学研究的结果多为阴性。另外，在已经发生氧化应激反应的细胞当中多半有代谢和功能障碍，其自身合成分泌抗氧剂的能力差。为此，寻求一种新型的，有效的，安全的，穿透力强，靶向性高的抗氧剂是拮抗机体氧化应激反应延缓动脉粥样硬化的潜在突破口之一。氢气是一种无色，无味，无臭具有一定还原性的易燃气体。过去许多学者认为氢气是一种生理性惰性气体，不会与机体生命物质发生生理生化反应。但也有极少数的科学家认为氢气是一种具有还原性的气体。发表在1975年《Science》杂志上的一篇文章报道，在皮肤鳞状细胞癌动物模型中，连续呼吸8个大气压97.5%氢气两周，可以有效治疗鳞状细胞癌，并且研究者认为其机制可能与氢气的抗氧化作用有关[9]。之后又有实验研究发现，呼吸高压氢气能够治疗肝脏寄生虫感染引起的肝炎，并提出氢气的抗炎作用机制可能与氢气和羟自由基反应有关[10]。虽然上述研究为引起学者的广泛关注，但Ohsawa等2007年发表在《Nature》上的一篇文章提出，缺血再灌注和炎症所致的急性氧化应激可以导致严重的组织损伤。研究者通过建立大脑缺血再灌注的氧化应激大鼠模型，在非高压的条件下，应用吸入氢气作为治疗干预，结果发现氢气能够通过抗氧化作用减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。文中还讨论到，氢气可能具有选择性的抗氧化作用，也即氢气只于与·OH和ONOO-发生反应，而并不与其它具有生理活性作用的活性氧发生生物化学反应，如O2-·、H2O2和NO·等。氢气的这种温和还原性的优点，使得它在抗氧化作用的同时对机体内部必须的生理反应过程影响极小。另外，和生理活性氧O2-·、H2O2和NO·相比，·OH和ONOO-等氧自由基的氧化性明显高于生理活性氧，而这也使得还原性比较温和的氢气只与这些强自由基的发生中和反应。除了这些特点外，氢气的高物理扩散性又是其独特的优势[11]。随后，日本科学家Hayashida等在Ohsawa等研究的基础上，在大鼠心肌梗死缺血再灌注模型中证实吸入氢气能够有助于心梗再灌注后心功能的恢复，减少心肌梗死面积，并预防心室结构重构。实验再次证实了氢气到达治疗靶点的高效性和高通透性[12]。2010年，Chen CH等学者在大鼠局灶脑缺血过程中，吸入氢气2小时能够降低基质金属蛋白-9活性并减小脑缺血面积[13]。2012年，中国学者Ge等在大鼠动物模型中发现吸入氢气可以减轻短暂脑缺血诱导的认知功能障碍，其可能的机制为氢气可以拮抗氧化应激作用从而减少神经细胞的死亡[14]。同年，Zhan Y学者等在Crit Care Med杂志发表关于吸入氢气治疗的实验研究成果。他们在130余只硬膜下出血脑损伤的大鼠模型中发现吸入氢气2小时可以明显减轻脑水肿和血脑屏障损伤[15]。同时在分子研究层面证实，氢气可以减轻大脑脂质，核酸，蛋白质的氧化损伤。正如德国学者Hardeland对该研究的评论，吸入氢气可能是将来医学领域一种颇有前景的治疗策略[16]。不仅如此，除了吸入氢气，科学家们还利用氢气扩散特点制备成富含氢的溶液并探究其治疗作用。最开始是由Sun等学者提出假设富含氢的生理盐水是否依然具有抗氧化应激作用。他们在大鼠的心梗模型中通过注射富氢生理盐水的方法对心梗后的大鼠进行干预，结果发现富氢生理盐水仍然具有有效抗氧化应激，减少心肌死亡，改善心功能的治疗作用[17]。同期还有中国学者们发现富氢生理盐水对小肠的缺血再灌注损伤也有保护作用，并同时可以改善小肠的收缩功能[18.20]。另外Chen等在大鼠实验中发现，富氢生理盐水在急性胰腺损伤中能减轻氧化应激，减少胰腺细胞死亡，有意思的是，富氢生理盐水还能促进胰腺腺泡细胞的增生[21]。因为富氢生理盐水的制备过程并不复杂，而且有使用方便，便于运输，实用等特点，一时间将富氢生理盐水作为治疗制剂研究其治疗作用的研究迅速成为热点，相应的研究结果均提示富氢溶液作为医疗制剂的诱人前景[22.30]。尽管如此，人们对氢的抗氧化作用的具体分子生物学机制还未能深入研究。前面我们提到，AGEs可以诱导血管内皮的氧化应激反应，从而刺激内皮细胞增生，炎症细胞侵润，凋亡，内皮功能障碍，血管粥样硬化的系列病理改变。氢能否通过抑制AGEs诱导的氧化应激，产生内皮保护作用有待实验进一步证实。基于此，我们课题组设计了“氢气抗AGEs诱导的内皮凋亡及其机制”这课题，对我们的课题假设进行初步证实。材料和方法SD大鼠购自于第叁军医大学动物室，用于主动脉内皮细胞的原代培养。富含氢气的培养基被应用于模拟高氢气的环境。Real-time PCR和分光光度测定KIT用于抗氧化应激酶SOD和GSH-PH基因和蛋白表达量检测， DCF-DA作为荧光探针运用流式细胞仪检测细胞内的活性氧(ROS)水平；Annexin V-APC凋亡检测试剂盒和TUNEL染色法被用于内皮细胞凋亡的检测,蛋白印迹分析(WB)用于检测Bcl-2(凋亡抑制蛋白)和Bax(凋亡促进蛋白)比率分析于说明内皮细胞凋亡水平。结果1.AGEs可以诱导内皮细胞凋亡并且呈浓度依赖性，HRM组和正常对照组的细胞凋亡水平无显着差异。AGEs组细胞凋亡水平明显高于正常对照组和HRM组，加入HRM能够明显抑制AGEs所诱导的细胞凋亡。2.流式细胞仪分析法检测发现，加有AGEs的内皮细胞(AGEs组)其细胞间ROS水平较正常对照组明显升高，且升高的水平成浓度依赖关系。但HRM组细胞ROS水平和正常对照组比较我显着差异。在AGEs+HRM组中发现细胞间ROS水平较AGEs组明显降低，并和正常对照组相似。3.抗氧应激检测显示：在mRNA方面，AGEs能显着降低SOD mRNA的表达水平，而且这中降低与AGEs呈浓度相关性。而HRM干预后能够明显改善AGEs对SODmRNA表达的抑制作用。另外，在酶活性比较方面，AGEs对内皮细胞SOD和GSH-PX这两种抗氧化酶的酶活性均成抑制效应，而HRM干预则能改善AGEs的这种不良效应。4.凋亡蛋白水平检测发现AGEs组Bcl-2表达量较正常对照组明显下降，而Bax蛋白表达量较对照组明显增加，Bcl/Bax蛋白表达量比例在改组明显下降，提示AGEs明显诱导内皮细胞凋亡。在AGEs+HRM组中，Bcl/Bax蛋白表达量比例较正常对照组无明显下降，提示HRM能够拮抗由AGEs诱导的细胞凋亡。结论1. AGEs可以诱导内皮细胞凋亡和氧化应激并且呈浓度依赖性.2. HRM能够拮抗由AGEs诱导的细胞凋亡和氧化应激，起作用可能通过提高SOD和GSH-PH以及Bcl-2(凋亡抑制蛋白) Bax(凋亡促进蛋白)比率并降低ROS水平发挥抗氧化应激和抗凋亡作用.
王琼[5]2014年在《氨基胍与Baicalein对糖尿病大鼠脑血管重塑的影响》文中指出目的通过观察氨基胍与Baicalein对糖尿病大鼠脑血管内皮超微结构以及CD34，EGFL-7表达的影响，探索氨基胍与Baicalein对糖尿病大鼠脑血管重塑的影响。方法48只SD大鼠随机分为氨基胍组(A组)、Baicalein组(B组)、糖尿病组(D组)、对照组(C组)4组，对照组给予普通饮食喂养；氨基胍组、Baicalein组、糖尿病组3组采用高脂高糖饮食联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法建立糖尿病大鼠模型，造模成功后，氨基胍组、Baicalein组分别给予氨基胍溶液、Baicalein溶液灌胃，剂量均为150mg/(kg.d)，对照组、糖尿病组给予相等剂量生理盐水灌胃，16周后，透射电镜下观察各组大鼠脑血管内皮超微结构变化，免疫组织化学法检测各组大鼠脑组织CD34、EGFL-7蛋白的表达。结果1.透射电镜下观察，对照组大鼠脑血管内皮基底膜及周围组织结构正常，糖尿病组大鼠血管管腔狭窄、变形，血管周围可见有大量的水肿液，基底膜结构不清晰，氨基胍组、Baicalein组均有类似于D的病理改变，但其程度较D组减轻。2. CD34免疫组化结果：与对照组相比，糖尿病组、氨基胍组、Baicalein组CD34蛋白的表达均明显减少（P<0.05）；与糖尿病组相比，氨基胍组、Baicalein组CD34蛋白的表达均明显增多（P<0.05）；Baicalein组与氨基胍组比较，CD34蛋白的表达无明显统计学差异（P>0.05）。3.EGFL-7免疫组化结果：与对照组相比，糖尿病组、氨基胍组、Baicalein组EGFL-7的表达均明显增加(P<0.05)，与糖尿病组比较，氨基胍组、Baicalein组EGFL7表达明显降低（P<0.05），Baicalein组与氨基胍相比，无明显统计学差异（P>0.05）结论糖尿病大鼠存在脑血管重塑，氨基胍与Baicalein可以抑制糖尿病脑血管重塑，具有保护血管和神经保护作用。
葛喜珍[6]2003年在《卵巢切除大鼠主动脉晚期糖化终末产物和血脂的变化及大豆异黄酮的干预作用》文中研究说明女性进入更年期后，由于卵巢机能衰退，雌激素水平下降，内分泌失调，引起脂代谢紊乱，从而诱发或加重动脉粥样硬化，使冠心病(CHD)的发生和死亡率明显增加。绝经后的动脉粥样硬化是包括各种因子在内的多因素之间交叉作用的结果。目前，国内外大量研究证明，晚期糖化终末产物（AGEs）在动脉粥样硬化的发生发展中起了不容忽视的作用，AGEs能启动或加重动脉粥样硬化。因此AGEs与衰老、动脉粥样硬化的密切关系正日益引起学术界的关注。AGEs生成路径复杂，主要与糖代谢紊乱、氧化反应、自由基的发生有关。女性进入更年期雌激素水平下降，是否能促进AGEs水平升高及其在主动脉积累？AGEs与绝经妇女脂代谢紊乱之间是否存在一定相关性？此方面的研究尚未见报道。有研究表明，卵巢切除大鼠骨组织AGEs水平明显升高，故本实验借助卵巢切除模型，模拟绝经后状态，重点观察AGEs水平的变化及其在主动脉累积情况，并探讨AGEs与脂代谢的关系。实验选择AGEs特异性抑制剂氨基胍作为对照，探讨AGEs在卵巢切除大鼠动脉损伤中的病理意义，以期阐明绝经妇女冠心病发生率增高的部分病理机制。流行病学调查结果表明，长期食用大豆的东亚人群中，心血管疾病、妇女更年期综合症等疾病的发生率明显低于西方。大量实验研究证明这与大豆中的异黄酮密切相关，因此大豆异黄酮在防治老年退行性疾病方面倍受世人瞩目，但确切的作用机制目前尚不完全明确。《食物本草》对大豆“补肾”作用加以描述，《别录》谓其“下瘀血”。《中药大辞典》记载大豆中的异黄酮具有类雌激素作用。祖国医学认为，动脉粥样硬化的发生与“痰浊"、“血瘀 ”有关，属于“痰”、“瘀”的范畴，其病机多与肝肾两虚，脾失健运，痰浊内生，脉络瘀阻有关。研究发现补肾中药多含黄酮类植物雌激素，后者是补肾方药发挥作用的主要成分之一。本研究利用大豆异黄酮的类雌激素作用，从补肾入<WP=5>手，解决“痰”、“瘀”问题，使脉络通畅，达到标本兼治的作用。研究发现黄酮类，如水飞蓟宾能抑制AGEs的形成，大豆异黄酮对AGEs的影响尚未见报道。本研究在阐明卵巢切除对大鼠晚期糖化终末产物和血脂影响的基础上，观察大豆异黄酮对大鼠主动脉保护作用及其机制，为合理分析和评价大豆异黄酮对绝经妇女心血管系统保护作用的意义与应用提供依据。第一部分 卵巢切除对大鼠主动脉晚期糖化终末产物和血脂的影响目的：探讨卵巢切除对大鼠晚期糖化终末产物和血脂的影响。方法：选用6月龄SD雌性大鼠20只，随机分为假手术组（sham）、卵巢切除组（OVX）。去除双侧卵巢3个月2周后，所有大鼠禁食24小时，股动脉放血处死大鼠，取血清用于AGEs、血脂及相关生化指标的测定。取主动脉弓及部分胸主动脉行连续切片，HE染色，观察其病理形态学的变化；其余主动脉用于组织AGEs测定。结果：1．主动脉形态学变化假手术大鼠主动脉壁各层结构完整，内膜光滑，中膜平滑肌细胞排列整齐。卵巢切除大鼠主动脉局部内膜不完整，内皮有脱落，表面有单核细胞粘附现象；主动脉弹性纤维紊乱，局部内膜明显增厚，有脂质沉积；平滑肌细胞数目增多，排列紊乱，细胞核肿胀，有向内膜迁移的迹象。2．血脂的变化与假手术组比较，卵巢切除组大鼠血清甘油叁脂（TG）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）、氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）均明显升高，高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）明显降低（P<0.05或P<0.01）。3．血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量的变化 与假手术组比较，卵巢切除大鼠血清MDA明显升高，SOD明显降低（P<0.05或P<0.01）。4．血清NO的变化与假手术组比较，卵巢切除组大鼠血清NO水平显着降低（P<0.01）。5．血清和主动脉AGEs及血糖的变化<WP=6>与假手术组比较，卵巢切除组血清和主动脉AGEs明显升高（P<0.01）。各组大鼠血糖差异无显着性（P＞0.05）。6．主动脉AGEs与血清OX-LDL呈直线正相关，相关性系数r=0.941（P<0.01）。小结：卵巢切除大鼠除存在明显的脂质代谢紊乱外，血清和主动脉中存在AGEs显着升高的现象。卵巢切除大鼠主动脉AGEs与血清OX-LDL含量存在明显正相关，提示AGEs水平升高与脂代谢紊乱密切相关。卵巢切除大鼠主动脉出现动脉粥样硬化的早期损伤。第二部分 大豆异黄酮对卵巢切除大鼠晚期糖化终末产物和血脂的影响目的：探讨大豆异黄酮对卵巢切除大鼠晚期糖化终末产物和血脂的影响。方法：选用6月龄SD雌性大鼠30只，随机分为卵巢切除组（OVX）、卵巢切除+氨基胍组(OVX+AG)和卵巢切除+大豆异黄酮组（OVX+ISO）。去除双侧卵巢2周后治疗3个月，实验结束时，所有大鼠禁食24小时，股动脉放血处死大鼠，取血清用于AGEs、血脂及相关生化指标的测定。取主动脉弓及部分胸主动脉行连续切片、HE染色，观察大豆异黄酮对卵巢切除大鼠主动脉形态学的影响；其余主动脉用于组织AGEs测定。结果：1．主动脉形态学变化与卵巢切除组比较，大豆异黄酮治疗组主动脉病理损伤得到明显改善，内皮较完整，单核细胞粘附现象明显减少；无明显的内膜增生现象，平滑肌细胞排列较整齐，未见明显的细胞增生。氨基胍组与卵巢切?
杨敏[7]2007年在《黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究》文中认为糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)重要的微血管并发症之一,也是导致慢性肾功能不全的主要原因。目前DN的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效的治疗手段。因此,积极地寻找有效方法治疗DN对于延长患者寿命,提高生活质量具有重大意义。本论文从文献综述、理论和实验研究叁方面加以探讨,实验研究方面选用了体现益气行血、消症化积治法的黄芪卫矛合剂,重点观察其对单侧肾切除合并注射链脲佐菌素DN大鼠模型肾脏内皮细胞损伤的干预作用。1文献研究:就近年来现代医学对于DN的发病机理、治疗用药、研究方法;中医药防治DN作用机制进展;内皮细胞和DN关系;实验性DN动物模型的建立及研究方法等方面研究动态进行了较为系统的总结和综述。2理论研究:在中医理论指导下,结合现代研究成果,对消渴病肾病的病名、病机理论进行了阐述,认为消渴病肾病是以肾元亏虚、气阴两伤为本,气血瘀滞、痰湿内停为标,久病入络、肾生症瘕为发病关键;初步阐明了微型症瘕假说与肾脏内皮细胞损伤机制的相关性,确立了“益气行血、消症散结”为DN基本治法,为消渴病肾病的研究思路及治法提供了理论依据。3实验研究:目的:观察黄芪卫矛合剂对实验性糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预作用及机制。方法:采用单侧肾切除加链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射建立糖尿病肾病动物模型,随机分为模型组(M)、黄芪卫矛合剂治疗组(H)、科素亚治疗组(K),另设假手术组为空白对照组(F)。0、4、8、12周动态观察大鼠一般状态、体重、尿量、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂、24小时尿蛋白定量、肾功能的变化,光镜观察肾小球及肾小管间质形态学和肾小管周围血管(PCT)网改变;采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen)含量,硝酸还原酶法检测肾组织一氧化氮(NO)含量;放射免疫法检测内皮素-1(ET-1)的含量;采用Western-blot的方法测定肾组织中肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)的蛋白表达。结果:①黄芪卫矛合剂能显着降低DN大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白,并具有降低血清胆固醇(TC)、甘油叁酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)而调节脂代谢的作用,与模型组比较有显着差异(P<0.05,P<0.01);能够降低DN大鼠升高的血清BUN和Scr,与模型组比较有显着差异(P<0.05);降低实验性DN大鼠24小时尿蛋白排泄量,与模型组比较有极显着差异(P<0.01)。提示黄芪卫矛合剂对实验性DN大鼠具有良好的调节糖、脂代谢作用,并具有减少尿蛋白排出、保护肾功能的作用。尤其在降糖、调脂、改善肾功能方面疗效优于科素亚组。其降低24小时尿蛋白的作用不如科素亚,但差异无统计学意义(P>0.05)。病理形态观察显示:模型组光镜下可见肾小球基底膜增厚,系膜区弥漫性增宽,细胞外基质(ECM)增多,肾小管纤维化。经黄芪卫矛合剂治疗后,上述病理改变有显着减轻,提示其对DN大鼠肾脏具有保护作用。科素亚对肾小球也有一定保护作用。②ELISA结果表明:糖尿病肾病大鼠血清LN和Ⅳ型胶原的合成和分泌明显增多,揭示了DN大鼠肾脏受到一定程度损害。在抑制肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原方面,黄芪卫矛合剂和科素亚皆能明显降低造模后LN和Ⅳ型胶原(与模型组相比P<0.05),在降低Ⅳ型胶原方面黄芪卫矛合剂优于科素亚组,但在降低LN方面两组之间差异不显着(P>0.05)。表明黄芪卫矛合剂能减少肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原,是其防治DN的作用机制之一。③硝酸还原酶法检测表明糖尿病肾病模型组NO含量显着降低,放射免疫法检测显示其ET-1水平比假手术组显着升高,提示DN大鼠NO与ET-1的平衡失调,内皮功能紊乱,揭示了DN大鼠肾脏损害进一步发展。中药黄芪卫矛合剂和科素亚能明显提高NO含量,降低ET-1水平,与模型组比较差异均有显着性统计学意义(P<0.05,P<0.01),两组之间比较差异不显着。提示黄芪卫矛合剂能显着改善糖尿病肾病模型所造成的NO表达减少和ET-1释放增多,从而发挥对肾脏内皮细胞的保护作用。表明黄芪卫矛合剂能显着改善糖尿病肾病大鼠模型所致NO的降低和ET-1增高,一定程度恢复二者的平衡紊乱、改善肾脏内皮功能,在此方面与科素亚比较作用相接近。④采用Westernblot蛋白印迹方法检测各组大鼠肾组织HGF和TGF-β1蛋白表达,研究结果显示:模型组大鼠肾组织中TGF-β1蛋白表达较假手术组明显升高(P<0.05),而HGF蛋白表达较假手术组明显降低(P<0.05),黄芪卫矛合剂和科素亚治疗后可明显下调TGF-β1蛋白表达,上调HGF蛋白表达,以调节HGF和TGF-β1的动态平衡,进一步抑制肾脏内皮细胞损伤,促进肾组织修复。结论:本课题中黄芪卫矛合剂采用“益气行血、消症散结”之法,针对DN“微型症瘕”病机设立,可有效防治糖尿病肾病,其作用机理可能是通过降糖、调脂、降低DN模型大鼠尿蛋白,减轻肾组织病理损伤,抑制细胞外基质主要成分LN和Ⅳ型胶原的合成,调节内皮细胞相关细胞因子NO和ET-1,HGF和TGF-β1的动态平衡发挥作用。其中,部分检测结果显示黄芪卫矛合剂优于科素亚,可能与中药多环节、多靶点治疗作用有一定关系。
沈红胜, 许惠琴, 陆春红, 戴国英, 徐康[8]2016年在《山茱萸环烯醚萜苷类成分对AGEs诱导HUVEC损伤的保护作用》文中研究说明目的探讨山茱萸环烯醚萜苷类特征成分马钱苷、莫诺苷对糖基化终末产物(AGEs)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方法体外培养HUVEC,用马钱苷、莫诺苷(终浓度分别为100、10、1μmol·L-1)预孵1 h后,再加入AGEs(200 mg·L-1)刺激,并设氨基胍为阳性对照,孵育24 h后,采用MTT法检测马钱苷、莫诺苷对HUVEC增殖率的影响;采用试剂盒检测细胞上清液中一氧化氮(NO)、内皮素(ET-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1);采用Western blot法检测HUVEC中糖基化终末产物受体(RAGE)、核转录因子(NF-κB)的蛋白表达。结果山茱萸环烯醚萜苷类特征成分马钱苷、莫诺苷能抑制AGEs导致的HUVEC损伤,与空白对照组比较,模型组细胞RAGE、NF-κB蛋白表达上调(P<0.01),ET-1、MCP-1、VCAM-1分泌增加(P<0.01),NO水平降低(P<0.01)。马钱苷、莫诺苷给药组能不同程度地下调RAGE、NF-κB蛋白表达,减少ET-1、MCP-1、VCAM-1分泌,升高NO水平,与模型组比较差异具有显着性(P<0.05~0.01)。结论山茱萸环烯醚萜苷类特征成分马钱苷、莫诺苷对AGEs导致的HUVEC损伤具有明显的保护作用,其作用机制为下调RAGE蛋白表达,抑制RAGE受体相关NF-κB信号通路发挥抗炎作用,从而改善内皮细胞功能。
刘丽媛[9]2010年在《晚期糖基化终末产物对糖尿病大鼠主动脉结构和功能的影响及机制探讨》文中认为实验背景及目的糖尿病是一种全身性疾病,其中血管病变是它主要的并发症。以往的研究表明,糖尿病时组织中非酶糖化普遍存在,过度的非酶糖化和糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)的堆积对机体组织结构,尤其是大血管内皮,有广泛的损害。近年来,随着对AGEs导致血管病变研究的相继开展,对AGEs致血管损伤的认识也日渐深入。本实验旨在观察和探讨在饮食和链脲菌素(streptozocin, STZ)联合诱导的糖尿病大鼠身上,晚期糖基化终末产物(AGEs)对主动脉血管结构和功能的影响及氨基胍(Aminoguanidine,AG)、缬沙坦(Valsartan,VT )的保护作用。本实验主要包括以下内容:建立糖尿病大鼠模型并检测模型是否成功建立,观察AGEs在不同实验组大鼠主动脉内皮沉积的情况,观察AGEs、氨基胍、缬沙坦对大鼠主动脉舒缩功能的影响,观察AGEs、氨基胍、缬沙坦对大鼠主动脉结构的影响。方法建立糖尿病大鼠动物模型,并给予氨基胍、缬沙坦作为干预因素,采用免疫组化及ELISA法检测AGEs在大鼠主动脉内皮沉积的情况,用离体动脉血管环技术研究大鼠主动脉血管反应性的改变,利用电镜技术对大鼠主动脉组织超微结构的改变进行观察,利用Western blot的方法对大鼠主动脉中eNOS蛋白表达进行定量检测。实验结果:1.免疫组化及ELISA结果显示:糖尿病大鼠主动脉AGE含量增多,多存在于主动脉内皮组织;糖尿病大鼠给予氨基胍干预后可以减少主动脉AGEs的生成;给予缬沙坦干预不能影响糖尿病大鼠主动脉AGEs水平。2.动脉环实验结果显示:糖尿病大鼠对NA (noradrenalin,去甲肾上腺素)的缩血管反应都明显增强,而对Ach(Acetylcholine,乙酰胆碱)的舒张血管反应明显减弱;给予氨基胍、缬沙坦干预的糖尿病大鼠则可以减轻上述的这种变化,即降低对NA的敏感性,提高对ACh的敏感性。3.主动脉超微结构显示:糖尿病大鼠主动脉内皮组织的超微结构出现病理性改变,而氨基胍、缬沙坦干预的糖尿病大鼠主动脉内皮组织的超微结构较前者有改善。4.Western blot检测结果显示:糖尿病大鼠主动脉组织中eNOS蛋白表达减少;氨基胍、缬沙坦能够增加主动脉组织中eNOS蛋白表达。结论糖尿病大鼠主动脉AGEs的含量增多,损伤了主动脉的结构和功能,氨基胍能够减少AGEs的沉积,缬沙坦没有减少AGEs的沉积,但两种药物均对糖尿病大鼠主动脉的结构和功能起到了保护作用。
许帅[10]2017年在《基于AGEs-RAGE加味桃核承气汤防治T2DM大血管病变大鼠的实验研究》文中研究指明文献研究:随着经济的发展、环境的改变、人们工作节奏的加快、生活方式的改变以及人口老龄化的加速,糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成为影响人类健康最重要的慢性非传染性疾病。在众多DM并发症中,DM大血管病变,包括冠状动脉、脑动脉、下肢动脉病变,是DM最主要的致死致残并发症。研究指出,DM患者患上大血管病变的风险比非DM患者增加2-4倍,75%的DM患者最终死于DM大血管病变诱发的心脑血管事件。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是DM大血管病变的主要病理表现,早期发现AS,并使用相应药物进行干预,对延缓AS进展、改善患者预后、降低心脑血管终点事件十分重要。然而,目前西医学对于早期筛查AS尚缺乏敏感性和特异性高的检验学指标,在药物治疗方面亦存在消化道出血、横纹肌溶解等副作用,因此亟需寻找一种更安全、更高效的药物以用于临床。目前认为晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)的过多生成,AGEs-RAGE途径的激活是DM大血管病变的重要发病机制,许多实验与临床研究证实AGEs水平与DM大血管病变具有显着相关性,但目前仍缺乏相应的循证证据支持。中医学虽无DM大血管病变之统称,但可散见于"胸痹"、"真心痛"、"眩晕"、"晕厥"、"中风"、"痴呆"、"偏枯"、"痹症"、"脱疽"、"痰饮"、"瘀血""厥证"等病名,古今医家数千年以来对治疗此类疾病积累了丰富的经验。熊曼琪教授是广州中医药大学首席教授,基于消渴病"气阴两虚,瘀热互结"的病机,熊教授在《伤寒论》桃核承气汤基础上开发出加味桃核承气汤以用于临床,并取得良好疗效。前期研究已发现,加味桃核承气汤具有降糖、调脂、改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞,改善众多DM并发症的作用。朱章志教授认为,DM大血管病变临床表现复杂多变,其背后的病机随着疾病的进展而变化,大多数患者病机还具有"少阴阳虚"、"阳失健运"的特点,并据此对熊教授原创加味桃核承气汤作出了相应的配伍加减。为进一步研究各组方对防治DM大血管病变的可能机制,优化加味桃核承气汤的组方配伍,本研究以AGEs-RAGE途径、氧化应激为研究切入点,借助动物实验,运用多种现代科学手段加以评估,以期进一步发掘加味桃核承气汤的临床效能。循证研究:目的:AGEs的生成过多,AGEs-RAGE途径的激活是DM大血管病变的重要发病机制,已有多个研究发现DM大血管病变患者的血清AGEs水平与单纯DM患者(指未发现DM并发症的患者)、健康人群相比存在显着差异,但至今尚未有循证医学上的证据。因此,本研究拟采用Meta分析的方法,根据初定的纳入排除标准,检索国内外相关文献,并对纳入文献的数据进行合并分析,以探讨AGEs与DM大血管病变的相关性,从而为AGEs未来的临床应用提供一定的循证支持。方法:根据初定的纳入排除标准,以"晚期糖基化终末产物"、"糖尿病大血管病变"、"冠心病""、"脑卒中"、"糖尿病足"、"下肢动脉病变"、"动脉粥样硬化"、"AGEs"、、"coronary heart disease"、"diabetic macroangiopathy"、"atherosclerosis"、"diabetic foot"、"cerebral apoplexy"检索国内外数据库关于AGEs与DM大血管病变、单纯DM患者以及健康人群的文献,筛选出要纳入的文献后,从中提取文献的一般特征及相关纳入指标,并使用RevMan 5.3统计软件对纳入指标进行Meta分析。最后根据Meta分析的结果对AGEs与DM大血管病变的相关性进行分析推理,对其中存在异质性的部分使用敏感性分析等手段处理,并借助漏斗图对文献进行发表偏倚评估。结果:共纳入14个研究,1290例患者,其中DM大血管病变患者338例,单纯DM患者607例,健康人群345例,Meta分析结果表明,AGEs-CML方面,DM大血管病变患者较单纯DM患者、健康人群显着升高(P<0.01),且经过敏感性分析后结果稳定;AGEs方面,DM大血管病变患者较健康人群显着升高(P<0.01),DM大血管病变患者经敏感性分析后较单纯DM患者显着升高(P<0.01)。结论:以AGEs-CML为代表,DM大血管病变患者血清AGEs-CML水平较单纯DM患者、健康人的存在显着差异,其机制可能为DM大血管病变患者AGEs生成过多,激活AGE-RAGE途径,引起下游一系列通路的氧化应激、炎症反应,从而破坏血管内皮细胞,影响血管内皮功能,促进AS的进展,最终发展为DM大血管病变。本次Meta分析从循证医学角度印证了 AGEs在DM大血管病变中具有一定的特异性升高,但受研究质量、异质性的影响,AGEs要成为一种特异性、敏感性指标用于DM大血管病变诊断、评估仍有待进一步大样本、高质量、多中心的临床研究、实验研究加以证实。实验研究:目的:立足朱章志教授对DM大血管病变的诊疗经验,对熊曼琪教授原创加味桃核承气汤进行配伍加减,进一步加减变化为中药2组(原创方改生大黄为熟大黄,倍芒硝)、中药3组(原创方入细辛,倍桂枝)。基于AGEs-RAGE途径及其下游的氧化应激通路,通过与中药1组(原创方)、西药组(氨基胍)作对比,借助动物实验、HE染色、QRT-PCR、IHC、电子显微镜、Western blotting、ELISA等现代医学手段,以探讨加味桃核承气汤防治T2DM大血管病变的可能作用机制,以期发掘加味桃核承气汤防治T2DM大血管病变的更优配伍组方及作用潜能,从而为临床应用提供一定的实验证据。方法:120只雄性SD大鼠经普通饲料适应性喂养1周后,按随机数字表法随机抽出10只大鼠作为正常组,该组继续使用普通饲料喂养,余下110只大鼠作为造模组改用高糖高脂饲料喂养6周。6周后进行预实验,预实验后确定STZ40mg/kg为造模剂量,隔日对剩余89只大鼠按40 mg/kg的剂量腹腔注射STZ造模,正常组则腹腔注射等量柠檬酸缓冲液,两次FPG稳定在11.1mmmol/L以上确立为T2DM成模大鼠,最后共成模74只。将成模大鼠按FPG水平分层,然后按分层情况进一步随机分为5组,其中模型组14只,中药1组15只、中药2组15只、中药3组15只,西药组15只。实施药物干预共8周。实验期间观察大鼠的一般情况,每隔4周测大鼠体重、摄食量、摄水量及尾尖FPG,实验结束时使用ELISA法检测FINS,计算Homa-IR;全自动生化分析仪检测HbAlc、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、CAT、GSH-Px等血糖血脂、氧化应激指标;ELISA法测胸主动脉AGEs的含量,光镜、电镜观察胸主动脉病理形态,IHC法观察胸主动脉AGEs的染色情况,Western blotting法检测各组大鼠胸主动脉ERK1/2蛋白的表达、RTQ-PCR法检测各组大鼠胸主动脉RAGEmRNA、eNOSmRNA、p47phoxmRNA的表达。结果:1、一般情况:正常组在实验全过程保持精神状况良好,皮肤嫩滑,毛色光亮,体重平稳上升,尿量、粪便量正常,无多饮、多食。模型组大鼠则出现明显多饮、多食、多尿、消瘦等症状,精神差,反应缓慢,毛发干枯,皮肤干燥,粪便量偏少偏硬。药物干预后,各药物干预组大鼠的精神情况、体征、体重、口干多饮等症状较模型组都得到不同程度的改善,但仍较正常组差。最终大鼠共死亡11只,其中模型组死亡4只,中药1组死亡3只,中药2组死亡2只,中药3组死亡1只,西药组死亡1只。死亡原因主要考虑糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高渗性昏迷、灌胃失误导致肺部感染等急性并发症。实验结束共71只大鼠完成实验,其中正常组10只,模型组10只,中药1组11只,中药2组12只,中药3组14只,西药组14只。体重、摄水量、摄食量方面,正常组体重随着时间迁移平稳增加,摄水量、摄食量则无明显变化;模型组体重则逐渐下降,摄水量、摄食量逐步增加;分析时间因素、干预因素、时间因素与干预因素的交互作用,各药物干预组差异均具有统计学意义(P<0.01);药物干预8周后,各药物干预组在增加体重、降低摄水量、降低摄食量方面均显着优于模型组(P<0.01),但较正常组仍较差(P<0.01),其中中药3组在增加体重、降低摄水量方面显着优于其余药物干预组(P<0.01),在摄食量改善方面与其他药物干预组相当(P>0.05),中药1组、中药2组在减少摄水量方面显着优于西药组(P<0.01)。2、糖脂代谢及胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),药物干预8周后,各药物干预组在FPG、HbAlc方面均显着低于模型组(P<0.01),但仍显着高于正常组(P<0.01),中药1组、中药2组、西药组较中药3组显着升高(P<0.01)。脂代谢方面,药物干预8周后,各中药干预组在TC、TG、LDL-C、HDL-C均无组间差异;TC、TG、LDL-C方面,各中药干预组较模型组TC显着降低(P<0.01),西药组较模型组则无明显差异(P>0.05);HDL-C方面,各中药干预组较模型组显着升高(P<0.01),西药组较模型组无明显差异(P>0.05)。IR方面,各药物干预组均较模型组显着降低(P<0.01),较正常组显着增加(P<0.01),各药物干预组间差异无统计学意义(P>0.05)。3、AGEs-RAGE途径,各造模组在药物干预8周后AGEs浓度较正常组显着增多(P<0.01),其中模型组增幅最多(P<0.01),中药1组较中药2组无明显差别(P>0.05),西药组、中药3组较中药1组、中药2组显着减少(P<0.01),中药3组较西药组无明显差异(P>0.05),免疫组化IOD值方面与胸主动脉AGEs ELISA检测含量结果变化一致,图像显示,AGEs在各组大鼠胸主动脉中呈棕黄色颗粒沉淀,其中,正常组可见散在稀疏棕黄色颗粒沉淀,染色较浅;模型组则在内皮层、平滑肌层、血管壁间质均可见大量棕黄色颗粒沉淀,染色极深;各药物干预组棕黄色沉淀染色较模型组浅,但较正常组深;中药3组、西药组较中药1组、中药2组、染色浅,其中中药3组棕黄色颗粒主要沉淀在内皮层,平滑肌层仅见稀疏、浅染棕黄色颗粒;中药1组、中药2组、西药组内皮层、平滑肌层均可见深染棕黄色颗粒沉淀,其中中药1组、中药2组较西药组棕黄色颗粒沉淀增多。RAGE mRNA方面,各药物干预组较模型组显着减少(P<0.01),中药1组较中药2组无明显差别(P>0.05),西药组较中药1组显着减少(P<0.01),中药2组、中药3组较西药组无明显差别(P>0.05)。4、氧化应激:各组在SOD、CAT、GSH-Px中的变化趋势,组间比较大致相同。正常组较各造模组显着升高(P<0.01),各药物干预组较模型组显着升高(P<0.01),中药3组较中药1组、中药2组、西药组显着升高(P<0.01),中药1组、中药2组较西药组无明显差异(P>0.05)。p47phox mRNA方面,各造模组在干预8周后仍较正常组显着升高(P<0.01),中药1组较模型组降低(P<0.05),中药2组、中药3组、西药组较模型组显着降低(P<0.01),中药3组较中药1组、中药2组、西药组显着降低(P<0.01)。5、内皮功能:在eNOS mRNA表达上,正常组较各造模组显着升高(P<0.01),模型组较各药物干预组显着降低(P<0.01),中药3组较中药1组、中药2组、西药组显着升高(P<0.01),中药1组、中药2组较西药组无明显差异(P>0.05)。在ERK1、ERK2表达上,各组组间比较及变化趋势相近,western blotting检测结果显示,正常组较各造模组显着降低(P<0.01),各药物干预组较模型组显着降低(P<0.01),中药1组、中药2组、中药3组较西药组显着降低(P<0.01),中药1组、中药2组较中药3组无明显差异(P>0.05)。6、胸主动脉病理形态:HE染色方面,正常组显示内皮层各细胞链接紧密,无脱落,无肿胀变性,无泡沫细胞形成,平滑肌层亦链接紧密,无异常增殖。模型组显示内皮层细胞脱落严重,细胞肿胀明显,可见泡沫细胞、巨噬细胞,平滑肌层结构紊乱,平滑肌细胞明显增殖,在内皮层可见纤维帽形成;中药1组、中药2组、中药3组、西药组病变情况较模型组减轻;中药1组显示内皮细胞脱落、肿胀,内皮层可见少量脂质沉积,少量泡沫细胞形成,平滑肌层细胞链接紊乱,可见细胞异常增殖,但未见纤维帽形成;中药2组显示内皮细胞稍肿胀,病变程度较中药1组稍减轻,未见明显泡沫细胞、纤维帽形成,平滑肌层可见细胞异常增殖,细胞链接不规律;中药3组显示内皮层细胞轻微肿胀,但各细胞间链接尚密切,未见明显泡沫细胞、纤维帽形成,病变程度较中药1组、中药2组、西药组减轻,平滑肌层亦未见明显异常增殖;西药组显示内皮层细胞稍肿胀,可见少量泡沫细胞形成,未见纤维帽形成,平滑肌细胞排列紊乱、松散。电镜结果显示,正常组胸主动脉各内皮细胞链接紧密,内皮细胞紧贴内皮下层,细胞膜完整光滑,细胞内各结构正常;模型组内皮细胞坏死并脱落,呈空泡样,细胞内各结构消失溶解;中药1组显示内皮细胞变性损伤,细胞膜破坏,细胞内结构模糊,并与内皮下层形成间隙;中药2组显示内皮细胞细胞膜损伤,但仍能清楚看到细胞核;中药3组显示内皮细胞水肿、损伤,损伤程度较中药1组、中药2组、西药组轻,细胞内各细胞器尚清晰;西药组显示内皮细胞细胞膜变性损伤较严重,细胞内各细胞器不清晰,但较模型组损伤程度轻。结论:在改善一般情况方面,加味桃核承气汤能够有效降低减少T2DM大血管病变大鼠摄水量、摄食量,并有效增加大鼠体重;血糖方面,加味桃核承气汤能够通过改善胰岛素抵抗、降低FPG、HbAlc起到平稳降糖的效果;血脂方面,加味桃核承气汤能通过降低TG、TC、LDL-C,升高HDL-C起到改善脂质代谢的效果;在保护大血管病变方面,加味桃核承气汤能够通过AGEs-RAGE途径,降低AGEs生成,降低受体RAGEmRNA的表达,从而抑制AGEs-RAGE系统,并通过增加血清SOD、CAT、GSH-Px水平,降低p47phox mRNA表达,修复机体抗氧化应激能力,最后通过增加eNOS mRNA,减少ERK1/2蛋白表达,起到改善内皮功能、减少血管平滑肌细胞异常增殖、延缓动脉粥样硬化进展的效果。此外,本次实验亦发现西药氨基胍虽能有效降低AGEs生成,但其延缓AS的作用较弱,说明DM大血管病变的机制仍然是多靶点的,今后仍需要大样本、多中心的实验研究进一步证实。另一方面,组间比较结果显示,中药3组相较于中药1组、中药2组、西药组能够更有效抑制AGEs-RAGE通路、修复抗氧化应激能力、更有效地延缓AS的进展,究其深入的中医学理论,中药3组较其余两组主要加强了"温运阳气"的作用,体现了 DM大血管病变的病机除气阴不足、瘀热互结外,还具有阳失健运的特点,这提示了今后中医药在治疗DM大血管病变过程中除注重既往的益气养阴、活血化瘀外,还应重视"温运阳气",这为中医药防治DM大血管病变奠定了重要的理论基础,有待今后临床与实验研究进一步证实。
参考文献：
[1]. 氨基胍对糖基化蛋白损伤血管内皮功能的保护作用及其机制[D]. 付四海. 中南大学. 2003
[2]. 氨基胍对糖基化蛋白损伤大鼠血管内皮功能的影响[J]. 付四海, 熊燕, 付云峰, 郭征. 中国药理学通报. 2003
[3]. 2型糖尿病大鼠脑损伤改变及氨基胍干预的脑保护作用的研究[D]. 贾贺. 郑州大学. 2017
[4]. 氢气抗糖基化终末产物对内皮细胞凋亡的影响及机制研究[D]. 姜洪. 第叁军医大学. 2013
[5]. 氨基胍与Baicalein对糖尿病大鼠脑血管重塑的影响[D]. 王琼. 郑州大学. 2014
[6]. 卵巢切除大鼠主动脉晚期糖化终末产物和血脂的变化及大豆异黄酮的干预作用[D]. 葛喜珍. 河北医科大学. 2003
[7]. 黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究[D]. 杨敏. 北京中医药大学. 2007
[8]. 山茱萸环烯醚萜苷类成分对AGEs诱导HUVEC损伤的保护作用[J]. 沈红胜, 许惠琴, 陆春红, 戴国英, 徐康. 中国药理学通报. 2016
[9]. 晚期糖基化终末产物对糖尿病大鼠主动脉结构和功能的影响及机制探讨[D]. 刘丽媛. 第四军医大学. 2010
[10]. 基于AGEs-RAGE加味桃核承气汤防治T2DM大血管病变大鼠的实验研究[D]. 许帅. 广州中医药大学. 2017
标签：药学论文; 糖尿病论文; 内皮细胞论文; 对照组论文; 主动脉粥样硬化论文; 糖尿病血管病变论文; 健康论文; 脑血管论文;