第一部分输入性登革病毒Ⅲ型及Ⅳ型全基因组测序及分子特征分析第二部分调控HAV拮抗IFN-β诱导的miRNA筛选及机制研究

论文摘要

背景近年来,国际旅游的频繁引起的输入性登革病毒（Dengue Virus,DENV）感染已成为我国的公共卫生问题。尽管自2000年以来,我国云南已经有零星的输入性登革病例的报道,但来自老挝的输入性DENV-3及来自泰国的DENV-4的全基因组序列及分子特征尚未见报道。目的分析两株输入性登革病毒株的全基因组序列及分子特征。方法病毒株的分离采用C6/36蚊子细胞系,病毒的鉴定及血清型分型采用逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR）,DENV-3的全基因组测序采用Sanger二代测序法,利用高通量测序法对DENV-4测序。通过NCBI-BLAST进行序列的相似性分析,多序列比对采用DNASTAR的Lasergene 7中的MegAlign模块,采用MEGA7以最大似然法构建基于E基因和完全编码序列的系统进化树,重组事件采用RDP4软件分析。结果老挝输入的登革病毒为登革病毒Ⅲ型,命名为YNPE3株;YNPE3株全长10,627个核苷酸,开放阅读框编码3390个氨基酸,它与来自印度的DENV-3株（JQ922556.1,KU216209.1,KU216208.1）享有较高的核苷酸相似性为 98.6%-98.8%;进化分析显示YNPE3株为基因型Ⅲ,并且同老挝及印度的DENV-3基因型Ⅲ有较近的亲缘关系;泰国输入的登革病毒为登革病毒Ⅳ型,命名为2013JH285株;2013JH285株基因组具有10,772个核苷酸,并且与2013年泰国的分离株CTI2-13具有99.0%的核苷酸和99.7%的氨基酸相似性。进化分析表明2013JH285株属于DENV-4的基因型Ⅰ,并与泰国的分离株CTI2-13亲缘关系较近。重组分析显示2013JH285株起源于DENV-4的基因型间重组。结论本部分工作首次报道了自云南省分离的两株从老挝及泰国输入的DENV-3、DENV-4的全基因组序列及分子特征,为进一步的登革疾病监测以及我国云南省DENV-3、DENV-4的流行病学和进化研究提供基础。背景:甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）在体外增殖培养时不产生细胞病变效应,而且抑制了细胞固有免疫中IFN-β的生成从而建立起持续性感染,这提示甲肝病毒在漫长的进化过程中已形成了逃逸宿主免疫应答的策略。诸多研究已从蛋白层次上阐明了 HAV拮抗宿主细胞IFN-β诱导的分子机理。微小RNA（microRNA,miRNA）作为一类基因表达的调控分子,广泛参与了包括病毒和细胞互作的多种生理和病理过程的调控。然而,miRNA是否介导了 HAV对IFN-β诱导的拮抗尚未阐明。目的:从RNA层面探讨miRNA在HAV病毒拮抗宿主细胞IFN-β诱导中的作用及机制。方法:以甲型肝炎病毒减毒活疫苗毒株H2株为研究对象,以人胚肺二倍体细胞KMB17为感染模型。首先通过miRNA芯片实验构建HAV病毒感染KMB17细胞后miRNAs的差异表达谱,并用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitativereal-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）验证芯片实验的结果。然后利用生物信息学预测miRNAs的靶基因,并从参与细胞内IFN-β诱导信号调控的角度出发从上调的miRNAs中筛选与调控IFN-β诱生相关的候选miRNAs。表型上,通过功能缺失和功能获得实验筛选出抑制IFN-β生成进而促进HAV复制的效应miRNA。机制上,对筛选到的效应miRNA进行靶基因预测、双荧光素酶报告基因系统鉴定miRNA的靶基因,在HAV感染细胞模型中通过qPCR和蛋白免疫印迹实验确定miRNA的靶基因。结果:miRNA芯片实验筛选到457个HAV诱导失调的miRNAs。以RIG/MAVS、TLR这两类RNA病毒在细胞内的IFN-β诱导信号通路中的关键接头蛋白为差异表达miRNA的潜在靶基因为筛选标准,共筛选到13个可靶向IFN-β诱导信号通路关键接头蛋白的miRNAs。通过qRT-PCR验证筛选发现,当过表达hsa-miR-146a-5p后,过表达组IFN-β的表达量是对照组的0.5倍（P<0.01）,HAV的拷贝数是对照组的2.2倍（P<0.05）。当抑制hsa-miR-146a-5p后,抑制组IFN-β表达量是对照组的2.9倍（P<0.05）,HAV的拷贝数是对照组的0.6倍（P<0.001）,这些结果表明hsa-miR-146a-5p促进了 HAV对宿主细胞IFN-β信号通路的拮抗。进一步的靶基因预测显示,TRAF6（TNF receptor associated factor 6）是 hsa-miR-146a-5p 在 IFN-β 诱生信号通路中的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,hsa-miR-146a-5p与野生型质粒pMIR-TRAF6-3’UTRI共转染组的荧光信号均显著衰减（P<0.0001）,分别是pmirGLO对照质粒组,mi-nc与野生型质粒pMIR-TRAF6-3’UTRI共转染组的0.26倍、0.30倍,表明TRAF6是 hsa-miR-146a-5p 的靶基因;同时,当过表达 hsa-miR-146a-5p 后,TRAF6 在 mRNA水平及蛋白表达水平均显著减少（P<0.05,P<0.01）,分别是对照组的0.64倍、0.55倍;当沉默hsa-miR-146a-5p后,TRAF6在mRNA水平及蛋白水平均显著增多（P<0.05）,分别是对照组的3.5倍、2.85倍。这些结果表明:hsa-miR-146a-5p在转录水平抑制了 TRAF6的表达。结论:HAV感染细胞后诱导了 hsa-miR-146a-5p表达上调,被诱导的hsa-miR-146a-5p在转录水平抑制了 TRAF6的表达进而抑制了 IFN-β诱导信号通路。这些发现为进一步认识小RNA病毒和宿主细胞相互作用机制提供了新的思路。

论文目录

第一部分输入性登革病毒Ⅲ型及Ⅳ型全基因组测序及分子特征分析

摘要

Abstract

前言

第一章登革病毒Ⅲ型的全基因组测序及特征分析

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、结果与分析

（一）病毒分型鉴定及测序

（二）基因组特征分析

（三）进化分析

三、讨论

四、小结

第二章登革病毒Ⅳ型的全基因组测序及特征分析

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、结果与分析

（一）病毒分型鉴定及测序

（二）基因组特征分析

（三）进化分析

（四）重组事件分析

三、讨论

四、小结

第三章第一部分工作总结

参考文献

第二部分调控HAV拮抗IFN-β诱导的miRNA筛选及机制研究

摘要

Abstract

前言

第一章 HAV感染KMB17细胞miRNA差异表达谱分析

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、结果与分析

（一）各组样品RNA质控信息

（二）HAV感染KMB17细胞诱导的miRNAs差异表达谱

（三）调控HAV拮抗IFN-β诱导的miRNA筛选

三、讨论

四、小结

第二章调控HAV拮抗IFN-β诱导的候选miRNAs验证

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、结果与分析

（一） qRT-PCR数据的处理

（二）结果

三、讨论

四、小结

第三章 hsa-miR-146a-5P调控HAV拮抗IFN-β诱导的分子机制

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、结果与分析

（一） qRT-PCR数据的处理

（二）结果

三、讨论

四、小结

第四章第二部分工作总结

参考文献

附录

附录Ⅰ 英文缩略词

附录Ⅱ 补充表

附录Ⅲ 主要试剂的配制

附录Ⅳ 主要构建质粒的测序图谱

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 莫玲

导师: 胡凝珠

关键词: 输入性,分子特征,系统进化,甲肝病毒,天然免疫,诱导

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 北京协和医学院

分类号: R373

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000540

总页数: 93

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