拟南芥SNARE蛋白解聚因子SNAP的初步研究

论文摘要

囊泡运输参与细胞内蛋白质和脂类的分选和分泌,在生物体的生长发育、抵抗生物和非生物胁迫以及信号转导等方面扮演着重要角色。囊泡运输主要有出芽、移动、栓留和融合四个步骤,在最后一步融合过程中,SNARE蛋白扮演介导囊泡与靶膜充分接触继而融合的角色。目前发现拟南芥中共有64个编码SNARE蛋白的基因,参与植物生命活动的许多过程。酵母及哺乳动物中的研究显示,在SNARE蛋白介导膜融合后,SNARE蛋白四聚体由NSF/SNAP复合体介导解聚,如果这一过程出现异常,会对生物体造成致命的伤害。但是在植物的研究中,此生物学过程并未有相关报道,本研究以拟南芥为实验材料,对SNAP候选的三个成员（γ-SNAP,α-SNAP1和α-SNAP2,为方便起见,下文分别简称为GS、AS1和AS2）进行了初步分析。本研究的结果和主要结论如下:（1）GS组成型表达对GS genomic:GUS稳定转基因材料进行GUS染色分析,发现其为组成型表达。另外,在正常生长环境下未发现GS的功能缺失突变体与野生型有明显差异。（2）AS1可能是假基因我们获得多种AS1的编码序列（CDS）,这些序列都因为提前出现终止密码子而无法编码完整蛋白质;AS1 genomic:GUS稳定转基因材料没有GUS信号而ProAS1:GUS株系却有GUS信号;此外,拟南芥1135种生态型中有655种的AS1由于插入、缺失或者多核苷酸多态性（SNP）导致其编码提前终止或移码,据此我们认为AS1可能是假基因。（3）AS2组成型表达对AS2 genomic:GUS稳定转基因材料进行GUS染色分析,结果表明AS2组成型表达,在根和茎的分生组织区,以及雌雄配子中GUS信号较强。（4）as2胚囊发育异常由于AS2没有遗传突变材料,我们利用CRISPR/Cas9技术获得了AS2的突变株系。所有等位突变体自交均不能获得纯合突变体。角果分析发现as2/+的结实率只有50%左右。ProLAT52:GUS花粉授到野生型和as2/+去雄的柱头上,12小时后GUS染色,结果显示有接近一半的胚珠没有GUS信号,表明AS2突变的胚珠无法吸引花粉管导向。48小时的苯胺蓝染色也证明了as2胚珠不支持花粉管的导向及受精。对as2/+胚珠进行光切,发现部分胚囊在发育的3-III时期出现功能大孢子不能分裂的现象,而且没有中央大液泡的形成,到发育后期仍然不能形成野生型那样正常的胚囊结构（含有七细胞八核和中央大液泡）。这些结果说明,AS2功能缺失影响功能大孢子的分裂及液泡的形成,进而导致胚囊发育异常,不能吸引花粉管进行双受精,造成结实率降低。（5）as2花粉发育异常亚历山大染色,DAPI染色,以及SEM观察结果显示,as2/+中有大约一半花粉皱缩无活性。对as2/+的花药进行光切实验,结果显示部分花粉在发育的第11期开始出现胞质皱缩和大液泡不能碎片化的现象,最后成熟时完全干瘪。树脂切片的结果和光切的一致。这些结果说明,AS2功能缺失影响花粉第11期大液泡不能进行碎片化等,导致花粉的胞质萎缩降解,不能发育到成熟期。（6）AS2定位在胞质中构建AS2 CDS PAM位点同义突变的ProUBQ10:GFP-crAS2（CRISPR/Cas9-resistant AS2,crAS2）表达载体,以防Cas9的剪切,浸染as2/+,在T1获得了ProUBQ10:GFP-crAS2;as2植株,表明外源AS2能互补其纯合突变致死的表型。在ProUBQ10:GFP-crAS2稳定转基因株系的花粉和花粉管中,AS2定位在胞质中。初步研究发现,GS的功能缺失突变体与野生型没有明显差异;AS1可能是一个假基因;AS2对于植物配子体发育发挥关键作用,缺失AS2导致雌雄配子体发育严重缺陷。但是AS2如何影响植物的生长发育,其作用的分子机制如何,还有待进一步深入研究。

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Abstract

1 前言

1.1 囊泡运输

1.1.1 胞吞

1.1.2 胞吐

1.1.3 囊泡运输的主要步骤

1.1.4 SNARE介导囊泡与靶膜融合

1.1.4.1 SNARE蛋白结构

1.1.4.2 植物SNARE蛋白分类

1.1.4.3 植物SNARE蛋白的定位及功能

1.2 NSF/SNAP复合体介导SNARE蛋白复合体解聚

1.3 拟南芥雌雄配子体的发育

1.3.1 拟南芥雄配子体的发育

1.3.2 拟南芥雌配子体的发育

1.4 CRISPR/Cas9 技术在植物基因组学研究中的应用

1.5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料及生长条件

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 酶及生化试剂

2.1.4 PCR引物

2.2 实验方法

2.2.1 突变体鉴定

2.2.1.1 植物基因组DNA提取

2.2.1.2 植物总RNA的提取（试剂盒法）

2.2.1.3 反转录

2.2.1.4 普通PCR扩增检测

2.2.2 CRISPR/Cas9 构建敲除突变体

2.2.3 克隆载体构建

2.2.3.1 目的基因扩增

2.2.3.2 PCR产物胶回收（试剂盒法）

2.2.3.3 TOPO连接反应

2.2.3.4 大肠杆菌转化

2.2.3.5 DNA序列测定

2.2.3.6 质粒DNA小提（试剂盒法）

2.2.3.7 点突变片段构建

2.2.4 表达载体构建

2.2.4.1 LR反应

2.2.4.2 质粒DNA酶切鉴定

2.2.5 农杆菌介导拟南芥遗传转化

2.2.5.1 根癌农杆菌GV3101 感受态细胞制备与转化

2.2.5.2 拟南芥栽培及转化

2.2.5.3 拟南芥转基因植株筛选和鉴定

2.2.6 qRT-PCR

2.2.6.1 引物设计及合成

2.2.6.2 反应条件及结果分析

2.2.7 扫描电子显微镜观察

2.2.8 树脂切片

2.2.9 激光共聚焦扫描显微镜观察及图像处理

3 结果

3.1 拟南芥SNARE蛋白解聚因子SNAP成员分析

3.1.1 SNAP蛋白结构域预测

3.1.2 SNAP进化树分析

3.2 GS组织表达模式分析和突变体鉴定

3.2.1 GS组织表达模式分析

3.2.2 GS T-DNA插入突变体的鉴定

3.3 AS1 可能是假基因

3.3.1 AS1 有多个转录本

3.3.2 AS1 在拟南芥Col-0 生态型中可能是假基因

3.3.3 AS1 在拟南芥655 种生态型中可能是假基因

3.4 AS2 影响雌雄配子体发育

3.4.1 AS2 组成型表达

3.4.2 利用CRISPR/Cas9 技术构建AS2 的突变体

3.4.3 as2/+结实率降低

3.4.4 as2 胚囊发育异常

3.4.5 as2 花粉发育异常

3.4.6 as2 的功能互补

3.4.7 AS2 定位在胞质中

3.4.8 AS2 敲低植株的获得

4 讨论

4.1 GS的功能有待探索

4.2 AS1 可能是假基因

4.3 AS2 影响雌雄配子体发育

5 结论

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 宋明磊

导师: 张彦

关键词: 囊泡运输,配子体发育

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山东农业大学

分类号: Q943

总页数: 74

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