论文摘要
第一部分NDVHN蛋白头-茎部连接区域的结构与功能背景新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是有包膜、不分节段的单股负链RNA病毒,属于副粘病毒科。该病毒科包含许多重要的人和动物致病病毒。腮腺炎病毒（mumps virus,MuV）、麻疹病毒（measles virus,MeV）、副流感病毒（parainfluenza viruses,PIVs）、犬瘟热病毒（canine distemper virus）、亨德拉病毒（Hendra virus,HeV）和尼帕病毒（Nipah virus,NiV）等是该病毒科的典型代表病毒。在感染靶细胞时,所有副粘病毒都需要将它们的病毒包膜与其宿主的靶细胞膜融合。在该过程中,大多数副粘病毒通过吸附蛋白和融合蛋白（fusion protein,F）的协同作用诱导膜融合发生。其中吸附蛋白根据其不同的功能和病毒来源可分为3类:血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）、血凝素蛋白（hemagglutinin,H）和G蛋白。HN蛋白同时具有受体识别活性和神经氨酸酶活性（neuraminidase activity,NA）,而H/G蛋白仅具有受体识别活性。此外,吸附蛋白还具有激活其同源F蛋白诱导细胞膜融合的功能。根据PIV5 HN1-117的结构和膜融合功能分析,研究人员首次提出了适用于PIV5病毒膜融合触发的“茎部暴露”模型,该模型现已扩展到其它副粘病毒。该模型认为在结合受体之前,HN、H或G蛋白的球状头部可以限制F蛋白靠近位于其茎部的F激活区。受体的结合导致吸附蛋白的四聚体球状头部的分子重排,会暴露HN、H或G蛋白茎部的F激活区域,使得F蛋白能与该区域相互作用并被其激活进行重新折叠,介导随后的膜融合发生。该模型得到了多项头部缺失的突变体分析研究的支持,即不含头部结构域的吸附蛋白仍可触发其同源F蛋白的激活,包括PIV5 HN1-117蛋白、MeV H1-122蛋白、NiV G1-167蛋白、MuV HN1-132蛋白和NDV HN1-123蛋白。但目前关于茎部激活还有许多有待解释的问题:为什么只有特定长度的茎部可以激活F?为什么去掉头部的茎部需要添加稳定基团才可以诱导膜融合?可能的解释是头部和茎部之间存在特定的区段,这一头茎部连接区域在吸附蛋白改变为膜融合诱导构象然后激活F蛋白进行膜融合时可能发挥重要作用。目的为了研究吸附蛋白头-茎部连接区域在膜融合激活中发挥的作用,本课题选取NDVHN蛋白为代表,对其头-茎部之间的连接区域（aa115-122）进行整区突变。分别检测了该连接区域突变后对全长HN及“去头”茎部HN1-123的促细胞融合活性及其他生物学功能的影响。以期阐明该连接区域对于HN蛋白的功能尤其促细胞融合功能的作用。方法1.NDV HN头-茎部连接区域的突变体的构建:选取来自hPIV1-4、PIV5、APMV6、HeV、NiV、SeV、MuV和MeV的吸附蛋白的序列分别与NDV HN的氨基酸序列进行比对,并将NDV HN的连接区（115-NGAANNSG-122）与其它副粘病毒吸附蛋白的对应序列进行替换来构建嵌合体。此外,还构建了该区段缺失的HN突变体。以上突变体均利用定点突变和菌内同源重组方法构建。2.突变体HN蛋白的真核细胞表达:将各突变体HN质粒转染BHK-21细胞,借助重组痘苗病毒提供的T7聚合酶,瞬时表达各突变体蛋白。3.突变体HN蛋白的表达效率检测:利用间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence assay,IIFA）定性观察各突变体蛋白的表达情况;利用流式细胞术（fluorescence-activated cell sorter,FACS）定量分析各突变体HN蛋白在细胞膜表面的表达效率。4.突变体HN蛋白的功能检测:利用Giemsa染色法和指示基因法测定各突变体HN蛋白的促细胞融合能力改变情况。通过R18标记的红细胞孵育共同表达突变体HN及F蛋白的BHK-21细胞,定性观察各突变体HN蛋白促半融合活性改变情况。利用红细胞吸附（hemadsorption,HaD）实验定性定量检测各突变体HN蛋白的受体识别活性的改变情况。利用NA试剂盒检测各突变体HN蛋白的NA活性的改变情况。5.HN1-123突变体的构建及其促细胞融合功能检测:选择HN蛋白全长水平促细胞融合功能改变明显的突变体蛋白,构建其相应的头部缺失的HN1-123蛋白的突变体,用Gimesa染色和指示基因方法测定其促细胞融合能力的情况。6.Western Blot方法检测各突变体HN蛋白的多聚体的情况和各HN1-123突变体蛋白的N119位点的糖基化修饰情况。7.统计学方法:采用Student’s-t检验对突变体和野生型（wild type,wt）HN蛋白的功能数据进行比较分析,P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.成功构建了 11个嵌合突变体质粒。根据所替换片段的病毒来源进行命名:ChihPI V1、ChihPI V2、ChihPIV3、ChihPI V4、ChiPI V5、ChiAPM V6、ChiHeV、ChiNiV、ChiSeV、ChiMuV、ChiMeV。2.IIFA和FACS结果显示,各嵌合体HN均成功表达于转染的细胞膜表面,约为wt HN蛋白表面表达效率的81.8%～1 14.1%。与wt HN相比,差异无统计学意义（P>0.05）。3.嵌合体蛋白的功能检测结果:HaD的检测结果显示,除ChiMeV的受体识别活性减弱为wt HN蛋白的72.7%（P<0.05）外,其余各嵌合体的受体识别活性约为wt HN水平的86.9%～l 12.1%,差异无统计学意义（P>0.05）;NA功能的检测显示,各嵌合体的NA功能波动不大,约为wt HN水平的98.1%～105.4%。相比于受体识别活性和NA活性,促细胞融合功能改变明显。指示基因法定量检测结果显示 ChihPIVl、ChihPIV2、ChiPIV5、ChiSeV 和 ChiMeV 的促细胞融合能力分别下降为wt HN的29.4%、42.4%、30.1%、42.7%和27.1%,镜下观察到形成合胞体的数量相对变少,体积也变小。半融合观察结果也显示这些嵌合体导致的R18染料转移的荧光减弱。相反,ChiAPMV6与ChiHeV则表现出升高的促细胞融合能力,镜下观察到更多更大的合胞体。同时R18染料转移的荧光更强。其余嵌合体则维持了与野生型HN蛋白相当的促细胞融合能力（P>0.05）。4.成功构建了 1个缺失突变体质粒,命名为Del115-122。IIFA和FACS结果显示Del115-122成功表达于转染的细胞膜表面,约为wt HN蛋白表面表达效率的84.9%。与wt相比,差异无统计学意义（P>0.05）。功能检测结果:Del 115-122突变体的促细胞融合能力完全丧失,但是受体识别活性及NA功能分别为wt HN的109%和96.1%,差异无统计学意义（P>0.05）。5.HN蛋白的多聚化检测结果显示,各突变体对HN蛋白的多聚化及其稳定性产生了一定程度的影响。非还原状态下各突变蛋白的单体电泳条带所占比例存在一定的差异。加入DTT后的电泳结果显示,突变体ChihPIV1、Chi hPIV4、Chi PIV5、ChiMuV和Del115-122仍保留了部分二聚体形式,提示这些突变体对DTT还原断裂二硫键作用显示出较高的抗性。6.成功构建了 4个头部缺失的HN1-123蛋白的嵌合体。与HN1-123相比,HN1-123的嵌合体促细胞融合能力改变的情况分成了两组:头部缺失后的嵌合体Chi PIV5和ChiMeV的促细胞融合能力仍显示减弱,几乎丧失合胞体形成能力;头部缺失的嵌合体Chi APMV6和Chi HeV,促细胞融合活性变化不明显（P>0.05）。7.N119位点糖基化修饰检测结果显示,HN1-123蛋白的嵌合体氨基酸序列的替换导致了 N119位点糖基化修饰情况的改变。该位点糖基化的丢失,对HN1-123嵌合体蛋白的细胞表面表达产生了影响。结论NDV HN头-茎部之间的较低电子密度连接区（aa115-122）对HN蛋白的促细胞融合功能的发挥至关重要,其序列改变可以影响促细胞融合功能,但NA活性和受体识别活性的改变不明显。该连接区域的突变体可能通过影响HN蛋白的多聚体的形成、多聚体的稳定性及茎部4HB的结构。第二部分NDV F蛋白DⅠ-DⅡ连接区域的结构与功能背景新城疫疾病（Newcastle disease,ND）是发生于鸡群中的烈性传染性疾病,其暴发可造成养禽业的经济损失。目前世界范围内仍有ND暴发的报道,而且在接种过疫苗的鸡群中也分离出了 NDV的毒株,这些证据提示当前的疫苗策略并非完全有效,新型疫苗的研发仍有必要。NDV介导的膜融合过程是该病毒感染靶细胞及进行组织内播散的关键步骤,其机制的进一步阐明可以为研发新型疫苗或者治疗性药物奠定理论基础。NDV感染细胞通过识别和结合宿主细胞表面的受体进而启动膜融合来完成。这一膜融合过程主要通过HN和F蛋白之间的相互作用介导。其中HN蛋白结合受体后传递激活信号到F,后者主要通过不可逆的构象改变完成膜融合过程。NDVF蛋白是I型跨膜糖蛋白,以三聚体形式存在。最初,F蛋白合成为无活性前体F0,随后被细胞内的蛋白酶切割成由二硫键连接的F1-F2复合物。F1亚基从N-末端到C-末端含有多个重要结构域,包括融合肽（fusion peptide,FP）、两个疏水性七肽重复结构域（heptad repeat regions,HR）-HRA和HRB、跨膜区（transmembrane domain,TM）和胞内尾部（cytoplasmic tail,CT）。在膜融合触发时,HRA形成三聚体形式的卷曲螺旋,其呈伸展状态后可介导FP插入邻近的靶细胞膜,从而形成瞬时融合中间体。随后,HRB以反向平行方向与HRA卷曲螺旋结合,形成六聚螺旋束（6-helix bundle,6HB）,将靶细胞膜和邻近细胞膜拉近并融合在一起。除了上述关键结构域外,在HRA和HRB 之间存在约250个氨基酸残基,被划分为三个结构域（DⅠ、DⅡ、DⅢ）和两个连接区（DⅠ-DⅡ连接区域和HRB连接区域）。这些非结构化的连接区域在不同的结构域之间起着柔性“铰链”的作用,在膜融合的过程中可能参与了构象转换过程。本课题组先前的研究显示hPIV3 F的DI-DII连接区域引入突变后造成了 F蛋白膜融合能力的减弱甚至丧失。但是目前尚不清楚NDV F的该连接区域引入突变后是否也存在类似的效应。目的为了探讨该连接区域在NDV F蛋白所诱导的细胞膜融合中发挥的作用,并与hPIV3 F DI-DII连接区域的研究进行对比,探讨该连接区域在不同F蛋白中的功能是否存在差异,以期为膜融合机制的解释提供线索。方法1.NDV F蛋白DI-DII连接区域的定位:将NDV F与hPIV3 F蛋白的氨基酸序列进行比对,定位与hPIV3 F DI-DII连接区域相对应的区域。2.F蛋白突变体的构建:采用定点突变和菌内同源重组的方法构建该区域的点突变体。3.F蛋白突变体的表达效率检测:采用真核表达体系通过瞬时转染表达各突变体蛋白,通过IIFA和FACS检测各突变体蛋白的细胞表面表达情况。4.F突变体蛋白与HN共同表达时的膜融合能力检测:采用Giemsa染色法和指示基因法检测各突变体蛋白膜融合功能的改变情况。此外还通过R18染料转移法对F突变体蛋白介导的半融合活性进行定性观察检测。5.F突变体蛋白单独表达时的融合能力检测:采用Giemsa染色法观察各突变体蛋白单独表达时合胞体的形成情况。6.F突变体蛋白的剪切活化情况:通过Western Blot检测各突变体蛋白的剪切活化情况。7.统计学方法:采用Student’s-t检验对突变体和wt F蛋白的功能数据进行比较分析,P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.氨基酸序列比对显示NDV F蛋白DI-DII连接区位于aa376-381。并成功构建了 12 个点突变体（E376A、E376K、G377A、G377S、A378D、L379A、L3791、T380A、T380V、T380P、T381A 和 T381P）。2.IIFA和FACS的检测结果显示,各突变体F蛋白均可在细胞表面表达,表达效率为wt F水平的82.8%～1 06.7%。各突变体组与wt F相比,差异无统计学意义（P>0.05）。3.除突变体E376K、T380V和T381A外,其余突变体蛋白的膜融合能力均出现显著改变。Giemsa染色结果显示,突变体G377A、L379I、T380A和T381P在其同源HN蛋白共同表达时形成的合胞体不仅体积变小,而且数量也减少。尤其是突变体T380A和T381P,几乎完全丧失了形成合胞体的能力。而突变体E376A、G377S、L379A和T380P形成的合胞体比wt F的更多和更大。指示基因法的定量结果基本与合胞体观察结果吻合。G377A、L379I、T380A和T381P突变体F蛋白的膜融合水平为wt F蛋白的44%、41.9%、18.8%和29.9%。突变体E376A、G377S和A378D的膜融合水平升高至wt F蛋白的142.7%、167.3%和130.8%。突变体L379A和T380P的膜融合能力增加显著,约为wt F水平的2.5倍。突变体E376K、T380V和T381A的膜融合水平分别为wt F蛋白的99.1%、110.3%和90.8%,差异无统计学意义（P>0.05）。半融合活性检测的镜下观察结果几乎与Giemsa染色一致。合胞体形成能力降低的突变体（即G377A、L379I、T380A和T381P）也显示出较弱的R18染料转移。相反,膜融合能力增强的突变体E376A、G377S、A378D、L379A和T380P具有较强的R18荧光转移。4.在不存在HN的条件下,突变体G377S、A378D、L379A和T380P蛋白能够在BHK-21细胞中产生合胞体,尽管这种融合活性水平远低于HN和wt F共同表达时的膜融合活性水平。而将其在Vero细胞系上单独表达时,无法观察到合胞体。5.Westem Blot显示,各突变体均能被有效切割活化。此外突变体G377S、A378D、L379A和T380P在F0蛋白泳带的上方检测到一条较慢迁移率条带。结论NDV F蛋白DⅠ-DⅡ连接区域对该蛋白的膜融合活性具有重要作用,该连接区内的点突变G377S、A378D、L379A和T380P可以在一定程度上改变或减弱F蛋白介导的膜融合对于同源HN的依赖性。表明该连接区域可能在膜融合过程中参与了重要的构象转换。第三部分NDV F蛋白结构域DⅢ/DⅠ交界处的保守氨基酸的功能研究背景NDV F蛋白的HRA和HRB结构域之间约有250个氨基酸。晶体学解析结构将其进一步划分为三个不同的结构域,从N末端到C末端分别为DⅢ、DⅠ和DⅡ,主要构成F蛋白的头部。NDV与hPIV3的F蛋白的晶体结构顶视图比较发现,二者F蛋白的头部关键结构域形状大致相同,但排列方位存在一定区别。这种方位的不同可能对应着两种病毒融合前后F蛋白构象的转变不同。进一步的分析认为DⅠ、DⅡ和DⅢ结构域的排列不同所导致的方位不同,可能与各结构域之间的连接区域的性质有关。DⅢ和DⅠ结构域在氨基酸一级序列上直接相连,不存在类似DⅠ-DⅡ连接区域的非结构化的过渡区段。研究发现这两个结构域的交界处存在许多关键氨基酸。同时有研究认为该区段的氨基酸是构成F蛋白头部径向通道的关键区域,对于FP的“锚定”起到重要作用。通过对F蛋白进行氨基酸序列比对,本研究发现这一连接区域附近存在一些保守位点,推测这些保守氨基酸可能对F蛋白的功能有重要影响。目的对结构域DⅢ和DⅠ交界处的保守氨基酸进行功能分析,定位DⅢ和DⅠ结构域交界处对蛋白功能重要的关键保守氨基酸位点。方法1.NDV F DⅢ和DⅠ结构域交界处的保守位点的定位:选取NDV、hPIV3和PIV5的F蛋白进行氨基酸序列比对来定位保守位点。2.保守位点的空间位置展示:通过同源建模构建NDV F蛋白的融合前结构,在此NDVF蛋白的融合前构象上来展示各保守位点的位置。3.保守位点的突变体构建和表达:采用点突变和菌内同源重组的方法构建各丙氨酸突变体,借助重组痘苗系统在真核细胞内瞬时表达各突变体蛋白。4.F突变体蛋白膜融合能力检测:采用Giemsa染色法和指示基因法检测各突变体F蛋白对膜融合功能的影响。此外还通过R18染料转移法对突变体F蛋白介导的半融合活性进行定性观察。5.F突变体蛋白的表达检测:IIFA和FACS检测突变体蛋白的细胞表面表达情况。6.F突变体蛋白的切割活化情况:通过Western Blot法检测各突变体蛋白的切割活化情况。7.统计学方法:采用Student’s-t检验对突变体和wt F蛋白的功能数据进行比较分析,P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.通过序列比对,确定了 NDV F DⅢ和DⅠ结构域交界处的8个保守位点分别用丙氨酸替换得到如下突变体:I269A、I274A、D277A、Q286A、V287A、P290A、L295A、N297A。在同源建模得到的F蛋白的融合目前构象中展示这些保守位点的位置发现,L295和N297位于蛋白结构的表面,其余位点位于结构内部。2.Giemsa染色观察结果显示,除Q286A和N297A外,其余突变体的合胞体形成能力均表现出不同程度的减弱。突变体蛋白I274A、P290A和L295A仅有个别极小的合胞体被观察到,而突变体D277A和V287A无法观测到合胞体。突变体I269A形成的合胞体与wt F和HN蛋白质产生的合胞体相比个数变少。突变体Q286A产生的合胞体明显大于wt F产生的合胞体,而N297A对合胞体的形成几乎没有影响。3.指示基因法的定量数据和镜下所见的合胞体形成能力相吻合。数据显示,突变体I269A内容混合能力减弱,仅保留wt F水平的57.1%。突变体I274A和L295A的内容物混合水平降低至较低水平,约为wt F的21.9%和24.2%。另有3个突变体D277A、V287A和P290A,其内容物混合能力几乎检测不到,分别为wt F的5.6%、7.8%和3.0%。突变体Q286A产生的膜融合活性约为wt F水平的1.6倍,而突变体N297A显示出近似wt F蛋白的内容物混合水平,约为wt F的97.7%。4.半融合活性观察结果显示,荧光染料的转移分布情况与合胞体的形成情况有关。除Q286A和N297A外,各突变体还导致了半融合能力的缺陷。膜融合能力几乎丧失的突变体I274A、D277A、V287A、P290A和L295A仅观察到极少量的红色荧光,几乎与阴性对照水平相似。突变体I269A显示出较弱的荧光。然而,突变体Q286A显示出比wt F更强的荧光,突变体N297A则与wt F水平相似。5.IIFA和FACS结果显示,突变体Q286A、L295A和N297A的表达与wt F相比,差异无统计学意义（P>0.05）。I269A和P290A的表达减弱,只有wt F的三分之一。I274A、D277A和V287A几乎无法检测到表达。6.Western Blot检测结果显示,除I274A、D277A和V287A外,其余各突变体均可以被有效切割活化,同时存在F0和F1形式的F蛋白。突变体I269A和P290A的蛋白总表达量较细胞表面表达水平有所增加,提示其存在胞内转运障碍。结论NDV F蛋白的DIII和DI结构域附近的保守氨基酸对F蛋白的折叠、转运及膜融合功能均起到关键作用。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 迟苗苗
导师: 王志玉
关键词: 新城疫病毒,蛋白,头茎部连接区,膜融合,融合蛋白,连接区,保守氨基酸,蛋白折叠与转运
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 山东大学
基金: 国家自然科学基金(81672011,81271806),山东大学交叉培育项目(2015JC044)
分类号: R373
DOI: 10.27272/d.cnki.gshdu.2019.000011
总页数: 164
文件大小: 17538K
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标签：新城疫病毒论文; 蛋白论文; 头茎部连接区论文; 膜融合论文; 融合蛋白论文; 连接区论文; 保守氨基酸论文; 蛋白折叠与转运论文;