吴立柱, 赵宝存, 齐志广, 葛荣朝, 马闻师[1]2006年在《小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)的亚细胞定位及功能鉴定》文中进行了进一步梳理目的对小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)进行亚细胞水平定位以及功能鉴定。方法构建Tagsk1-gfp融合基因表达载体并转化拟南芥,以仅携带gfp基因的拟南芥作为对照,利用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在转基因植株根部细胞的分布;利用含不同浓度NaCl的MS培养基对携带有融合基因的拟南芥和Columbia型拟南芥进行耐盐性鉴定,观察主根生长量和侧根生长数目。结果发现TaGSK1存在于细胞质内,且该激酶在根尖分生组织和与侧根发生有关的中柱鞘细胞中分布较多;耐盐性鉴定结果表明,转Tagsk1-gfp融合基因的植株的平均主根生长量和侧根生长数目与Columbia型拟南芥植株的差异均达到极显着水平(P<0.01)。结论TaGSK1定位于细胞质内,该激酶具有促进细胞分裂及提高转基因拟南芥抗渗透、抗胁迫的能力。
吴立柱[2]2004年在《小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）的亚细胞定位及其功能鉴定》文中研究指明本研究利用我室从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的小麦糖原合成酶激酶基因(TaGSK1)，在其C端标记绿色荧光蛋白基因(GFP)构建成双元表达载体pBIN-Ta-GFP，并以空载质粒pBINGFP_4为对照转化农杆菌GV3101，经筛选得到阳性农杆菌，采用浸花法转化Columbia型拟南芥，经卡那霉素筛选得到转基因拟南芥ATaGFP和AGFP。将二者的T2种子分别种植于含有卡那霉素的MS培养基上，6d后用confocal观察根部细胞，发现转融合基因TaGSA1-GFP的拟南芥植株(ATaGFP)的绿色荧光主要分布于细胞质内，而对照植株(AGFP)的绿色荧光主要分布于细胞核和细胞膜部位。 将转基因拟南芥ATaGFP和AGFP种子以及野生型Columbia型拟南芥Ac的种子种植于不同浓度的含盐培养基(70mmol／L NaCl，120mmol／L NaCl)上，7d后测量上述叁类幼苗主根的生长量，在含盐70mmol／L NaCl的培养基上依次为8.509cm、6.722cm和1.493cm，经新复极差(SSR)测验转基因植株ATaGFP与AGFP之间差异极显着(p＜0.01)，ATaGFP与Ac之间差异显着(p＜0.05)；在含盐120mmol／L NaCl的培养基上叁类种子的主根平均生长量依次为4.600cm、2.532cm和0.719cm，经新复极差测验转基因植株ATaGFP与AGFP之间，ATaGFP与Ac之间差异均极显着(p＜0.01)。9d后统计各类植株的侧根生长数量，发现叁者在含盐70mmol／L NaCl的培养基上依次为1.737、0.673和0.034条。在含盐120mmol/L NaCl的培养基上依次为0.976、0.289和0.000条，经差异显着性测定，在两种不同含盐量的培养基上，各类植株间侧根生长数量的差异均达到极显着水平(p＜0.01)。说明小麦糖原合成酶激酶TaGSK1能够提高拟南芥的耐盐能力。同时利用confocal观察转基因植株ATaGFP的根部细胞，发现小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)在根尖分生组织和侧根的基部分布较多，这可能是转有目的基因的拟南芥主根生长量和侧根数量增加的内在原因之一。 将转基因拟南芥ATaGFP和AGFP种子分别种于MS培养基上，6d后用1.3mol／L蔗糖溶液处理二者幼苗的根部，经confocal观察，发现转融合基因TaGSK1-GFP的拟南芥植株(ATaGFP)根部细胞未发生质分离，而对照植株(AGFP)却发生了质壁分离。直至用2.0mol／L蔗糖溶液处理后部分细胞才发生质壁分离。说明小麦糖原合成酶激酶TaGSK1具有增强植物细胞抗胁迫、渗透的能力。
张春宝[3]2010年在《栽培大豆非生物胁迫诱导的蛋白激酶基因GmGSK的克隆及功能分析》文中指出高盐、干旱、低温等非生物胁迫是影响作物产量的重要环境因素。植物通过长期进化逐渐形成特定的机制来抵御外界环境造成的胁迫,减轻对自身的伤害。其中蛋白激酶可通过对底物可逆的磷酸化来参与胁迫信号的传导,从而进一步调节外界胁迫对作物造成的伤害。因此,蛋白激酶在植物的抗逆途径中起到了非常重要的作用。我们以小麦的TaGSK1基因序列为探针,通过电子克隆在栽培大豆中得到一条类似糖原合成酶激酶的cDNA序列,并通过RT-PCR的方法将其克隆。序列分析表明,此cDNA包含一条1230bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,估计的分子量为46.5kD,等电点PI为8.64。蛋白序列分析表明,其编码一个与GSK-3同源的蛋白,含有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性位点,命名为GmGSK (Genbank登录号：FJ460228)。Southern杂交表明,GmGSK基因在栽培大豆基因组中至少有两个拷贝。Northern杂交显示,在栽培大豆的根、茎、叶、叶柄及子叶中均能表达GmGSK,但不同的组织器官中GmGSK基因的表达量不同,在根中分布较多。半定量RT-PCR分析结果显示,GmGSK基因的表达可以被NaCl、NaHCO3、干旱、ABA和低温所诱导,这表明GmGSK可能参与了大豆非生物胁迫的信号传导过程或对非生物胁迫的耐受。利用pCAMBIA1302构建GmGSK:GFP融合载体,通过农杆菌渗入法在烟草中叶片细胞中瞬时表达GmGSK:GFP融合蛋白。对GmGSK进行亚细胞定位发现,其分布在细胞膜与细胞质中。为了进一步研究其功能我们分别将其转入大肠杆菌(BL21)和酿酒酵母(INVScl)中,原核表达显示其蛋白大小确为46.5kD左右；在转GmGSK基因的酿酒酵母中,其对NaCl、NaHCO3和干旱等非生物胁迫的耐受能力明显强于非转基因酿酒酵母。最后,通过构建pCAMBIA3300-GmGSK植物双元表达载体,将GmGSK转入烟草,过量表达GmGSK基因,验证其在植物中的生物学功能。结果表明,在高盐胁迫下转基因植株的生长状态、相对生物量、根系发达程度与对照相比均得到了明显的提高。对转基因烟草和非转基因烟草植株共同浇灌适当浓度NaCl,结果显示转基因烟草能明显提高对高盐的耐受性,而非转基因烟草则在不久后死亡。对其生理指标进行测定显示,在盐胁迫下转基因烟草的可溶性糖含量增长幅度明显快于非转基因对照,而外渗相对电导率增长速率则明显慢于非转基因对照,这些有助于提高转基因烟草的耐盐性。以上结果表明,栽培大豆GmGSK基因在生物抵御外界非生物胁迫过程中有重要作用,过量表达GmGSK基因,能显着提高生物的抗逆性,这也为将来利用耐盐基因改善栽培大豆耐盐性方面,提供了一条新途径。
参考文献：
[1]. 小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)的亚细胞定位及功能鉴定[J]. 吴立柱, 赵宝存, 齐志广, 葛荣朝, 马闻师. 中国农业科学. 2006
[2]. 小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）的亚细胞定位及其功能鉴定[D]. 吴立柱. 河北师范大学. 2004
[3]. 栽培大豆非生物胁迫诱导的蛋白激酶基因GmGSK的克隆及功能分析[D]. 张春宝. 东北师范大学. 2010