肖卫国[1]2002年在《TNF-α抑制CD34～+细胞来源的GPA～+细胞增生的研究》文中指出前言 慢性疾病相关性贫血是临床上最常见的血液系统异常之一。在其发生发展过程中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)的作用倍受关注。TNF-α是一种多功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞产生。在造血方面，TNF-α对髓系细胞的增殖和分化发挥着正向和负向双重调节作用。TNF-α可以直接地或通过诱导其它细胞产生细胞因子而发挥作用。 TNF-α在体外和体内都能抑制红系造血。TNF-α长期在体内作用于裸鼠，可选择性地抑制红细胞生成，并伴有单核细胞的绝对增多。癌症患者接受TNF-α治疗后，血红蛋白明显下降。一些体外实验也都证实了TNF-α在红细胞集落形成上的抑制作用，但其发生机制目前还不十分清楚。 我们通过体外集落形成法，测定红细胞集落形成单位(CFU-E)，以及在多种细胞因子存在下液体培养CD34~+细胞，使之向红系分化，通过观察血型糖蛋白A(glycophorin A，GPA：一种特异的红系标记)阳性细胞的增生情况，探索哪一阶段的红系祖细胞对TNF-α敏感及与其相关的TNF受体(TNFRs)在红系祖细胞的表达情况。为阐明慢性疾病相关性贫血的发病机制奠定基础。 材料和方法 试剂 牛血清白蛋白(BSA)、Iscove’s Modified Dulhecco’s Medium(IMDM)及propidium iodide(PI)购自Sigma公司。胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素购自Flow Laboratories Inc。胰岛素购自Calbiochem。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD34抗体购自Becton Dickinson公司。藻红蛋白(PE)标记的抗血型糖蛋白A(GPA-PE)购自DAKO公司。抗TNFRⅠ-PE和抗TNFRⅡ-PE购自R&D公司和Caltag实验室。重组人TNF-α由Mochida Pharmaceutical公司惠赠。重组人促红细胞生成素(EPO)由Chugai Pharmaceutical公司惠赠。重组人白细胞介素3(IL-3)和干细胞因子(SCF)由Kirin Brewery公司惠赠。维生素 B12 和叶酸购自 Sankyo Ph。aceuhcd公司。 人 CD34”细胞的纯化 给正常健康志愿者注射重组人粒细胞刺激因子（G－CSF人动员CD34”细胞进人外周血，用细胞分离机分离并收集外周血单个核细胞，再用免疫磁珠分离、纯化 CD34”细胞，置液氮中冻结保存备用。 祖细胞的半固体培养 用平底 48孔的组织培养M，采用含血清的纤维素半固体法进行 CD34”细胞及其祖细胞的集落培养。细胞浓度为500什ml。培养基中含有EPOZu／ml，IL－3 50n／rnl及 SCF 50n牙Inl。TNF－。浓度依次为0、In才ml、10ng／rnl上 和 1000ng／Inl。在 37T，5％CO。浓度，5％O。浓度下孵育一定天数后，固定，联苯胺苏木精染色。将含有8－49个血红素染色的细胞聚合体规定为CF’U－E。 纯化的CD34”细胞的液体悬浮培养 将冻结的外周血 CD34”细胞解冻，悬浮于 IMDM（含30％FCS和 100U／rnl DNA酶）中，然后在4009，4℃下高速离心smin，去上清，洗细胞二次，再悬浮于含 0．3％去离子 BSA的 IMDM中。将 0．5 X 10‘－2．0 X 10VInl的细胞液悬浮于下列混合物中：20％FCS，10％热灭活库存人 AB血清，二％鹏A，胰岛素10 m旷Inl，维生素＊2 10卜算Inl，叶酸15卜4rnl，IL－3 10oU／Inl，SCF 100 ＂g／Inl，EPO 4 U／Inl，p－ME 5 x 10－’mo＊Inl，青霉素 50 U／rnl，链霉素50 U／rnl和IMDM。在37t，5％COh95％大气压下孵育规定的天数后，收集细胞，测定细胞扩增倍数和表面标记。 流式细胞仪分析 细胞由染色介质冲洗2次，用FITC和PE标记的单克隆抗体染色，然后经 FACS（荧光激活细胞分类器）Calibur分析。 统计学分析 差异检验采用 Stat View 4．oin软件的单因素方差分析瞩cheffe’s Pot＊hoe test）。 结 果 TNF－a对纯化的CD34”细胞集落形成的影响 ·2· 用于本研究的人 CD34”细胞的纯度为 98．5％。1．0％（mean。SD入0．SInl培养基中细胞浓度 1，000／rnl，EPO 2 U／Inl，IL－3 50 U／ml和 SCF 50U／血。TN F－a浓度为O＊，00O n牙ml。结果显示TN F－a降低了代表原始增殖能力的大型红系集落（超过50个幼红细胞）形成的数量。而由8－49个幼红细胞构成的中等大小的红细胞集落明显增多。在TNF－a浓度超过 100 n牙nil时也并不抑制这些细胞的集落形成。由于 CD34”细胞中产生大型集落的红系祖细胞占绝大部分，因此TNF－a似乎降低了红系祖细胞的增殖能力。但在浓度为 l－100 n矿Inl范围内，TNF－a促进非红系集落的生长。 TNF－a对 CD34”细胞由来的 GPA”细胞增生的抑制作用 将纯化的 CD34”细胞在液相 与几一3，SCF，EPO及 TNF－a（10 n矿Inl）共同培养，以诱导红系的分化。在孵育7天之后，用FACS检测总细胞数及增殖细胞的构成，重点观察红系的特征性标记物GPA的表达。结果显示，TNF－a使GPA”细胞的数量显着减少，表明TNF－a抑制CD34”细胞由来的 GPA”细胞的增殖。 TNF－a在红系造血早期阶段的作用 为了探索 TNF－a对红系祖细胞发育阶段的影响，将 CD34”细胞与几J，sc
肖卫国, 翟明[2]2003年在《TNF-α抑制CD34+细胞来源的GPA~+细胞增生的研究》文中认为慢性疾病相关性贫血是临床是最常见的血液系统疾病之一。在其发生发展过程中,肿瘤坏死因子(TNF-a)的作用倍受关注。TNF-a是一种多功能的细胞因子,主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞产生。在造血方面,TNF-a对髓系细胞的增殖和分化发挥着正向和负向双重调节作用。TNF-a可以直接地或通过诱导其他细胞产生细胞因子而发挥作用。TNF-a在体外和体内都可抑制红系造血。TNF-a长期作用于裸鼠可选择性地抑制红细胞生成,并伴有单核细胞的绝对增多。癌症患者接受TNF-a治疗后,血红蛋白明显下降。一些体外试验也证实了TNF-a在红系集落形成上的抑制作用,但其发生机理目前尚不十分清楚。我们通过测定红细胞集落形成单位(CFU-E)和检测CD34~+细胞在多种细胞因子存在下液相培养增殖产生的血型糖蛋白A(glucophorinA,GPA:一种特异的红系标记)阳性细胞的生长情况,探索哪一阶段的红系祖细胞对TNF-a敏感及与其相关的TNF-a受体(TNFRs)在红细胞系的表达情况。为阐明慢性病贫血发病机制奠定基础。
宋洪娟[3]2017年在《清金化痰汤通过P38MAPK/NF-κB信号通路改善大鼠急性气道炎症的作用和机制》文中提出【目的】观察清金化痰汤治疗急性气道炎症模型大鼠气道炎症性损伤和黏液高分泌的作用。通过观察不同时点急性气道炎症和粘液高分泌状态的变化,ELISA法检测急性气道炎症相关细胞因子及黏液分泌标志物黏蛋白的表达情况,运用免疫组化、Western blot检测急性炎症通路相关蛋白及黏蛋白的表达,分析清金化痰汤抑制急性气道炎症及黏液高分泌的可能信号机制,揭示了P38MAPK/NF-κB信号通路在调控大鼠急性气道炎症及抑制其黏液高分泌状态中的重要作用。这将进一步阐明清金化痰汤在治疗急性气道炎症性疾病中的应用价值及其作用机理,为清金化痰汤的临床应用提供实验依据,进而深入论证将“清肺化痰”法作为急性气道炎症性疾病主要治疗方法的可行性和重要性,为传统中医药走向世界奠定基础。【方法】1.健康雄性SD大鼠96只,随机分为6组:空白组(A组)、模型组(B组)、清金化痰汤高剂量组(C组)、清金化痰汤中剂量组(D组)、清金化痰汤低剂量组(E组)、地塞米松组(F组),每组16只。除空白组外,其余各组均用LPS气道滴入建立急性气道炎症大鼠模型,空白组则滴入等量生理盐水。2.由黄芩、栀子、桔梗、麦门冬、浙贝母、橘红等十一味中药组成的清金化痰汤熬制成含生药2.98 g.ml~(-1)的汤剂,每ml含有大鼠给药最高剂量,加水稀释2倍后为中剂量,稀释4倍后为低剂量。3.造模后24h始至处死止,每日给药1次。空白组、模型组给予生理盐水灌胃0.25m L;清金化痰高、中、低剂量组分别给予清金化痰汤剂灌胃,按大鼠用药量与人的倍数换算为等效剂量,即中剂量,250g大鼠相当于人用药量6倍(高剂量为7.44 g.kg~(-1),中剂量为3.72g.kg~(-1),低剂量为1.86 g.kg~(-1)),每只大鼠每次灌服2.5ml;地塞米松组按照0.001 g.kg~(-1)的剂量腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液。4.观察各组大鼠BALF中白细胞及细胞分类计数;光镜下观察气管和肺组织病理学改变;用ELISA法检测BALF中细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α以及黏蛋白MUC5AC的表达;以确定急性气道炎症及黏液高分泌状态。5.用免疫组织化学方法检测肺组织中粘蛋白MUC5AC、P38MAPK蛋白表达情况;以Western blot法测定肺组织中P38MAPK,IκBα,NF-κBP65的蛋白表达水平。6.统计方法采用SPSS17.0统计软件,计量资料采用均数±标准差()进行统计描述,组间差异比较采用one-way ANOVA方差分析;单因素相关性应用Pearson相关分析,以P<0.05或P<0.01被认为差异有统计学意义。【结果】1.一般情况观察:与空白组比较,各组大鼠在造模后出现活动减少,反应迟钝,双目无神,进水、进食减少,毛发色泽黯淡,口角、鼻孔可见分泌物流出,可闻及咳嗽及痰鸣音;与模型组比较,各治疗组在给药后上述症状、体征得到改善,其中以第7d清金化痰汤高剂量组最为明显,其次为清金化痰汤中剂量组和地塞米松组。2.BALF中白细胞总数和细胞分类:模型组BALF中白细胞总数与同时相空白组比较均有显着升高;清金化痰汤高、中、低剂量组和地塞米松组与同时相模型组比较,白细胞总数均有明显降低(P<0.05或P<0.01),其中清金化痰汤高剂量组第7d白细胞总数基本接近空白组;细胞分类显示,模型组的中性粒细胞和淋巴细胞与同时相空白组比较均有明显增加,清金化痰汤高、中、低组与同时相模型组相比,中性粒细胞和淋巴细胞均有降低(以高剂量组第7d降低明显),巨噬细胞升高,其余各时相大、中剂量组均无明显差异。说明清金化痰汤和地塞米松能抑制气道急性炎症时白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的增多。3.气管和肺组织病理改变:空白组大鼠支气管黏膜上假复层纤毛柱状上皮排列整齐,肺泡结构清晰完整,肺间隔未见增厚,肺泡腔未见炎性细胞浸润,肺间质无水肿。模型组可见气管管壁、肺血管及部分肺泡腔内有炎性细胞浸润(以中性粒细胞、淋巴细胞为主)和大量红细胞渗出,气管腔内可见上皮细胞脱落,肺泡间隔明显增厚,肺间质充血、水肿。给予清金化痰汤后炎症程度减轻,其中以第7d高剂量组最为明显。经炎症分级统计,LPS诱导急性气道炎症大鼠各组与同时相空白组相比较,支气管及肺组织炎症积分均明显升高;与同时相模型组比较,清金化痰汤高、中、低剂量组和地塞米松组病理学炎症积分均明显降低,而以清金化痰汤高剂量组第7d降低尤为明显。说明清金化痰汤和地塞米松均能明显降低支气管及肺组织炎症积分,使上皮损害减轻,炎性细胞浸润减少。4.ELISA检测相关细胞因子及黏蛋白MUC5AC:与同时相空白组相比,模型组BALF中IL-1β,IL-8,TNF-α,MUC5AC均有显着升高(P<0.05或P<0.01);与同时相模型组相比,清金化痰汤高,中,低剂量组(除低剂量第4d天外)和地塞米松组BALF中IL-1β,IL-8,TNF-α,MUC5AC均显着降低,以高剂量组第7d降低明显,P<0.05或P<0.01。5.SP法检测MUC5AC、P38MAPK蛋白的表达:与同时相空白组相比,模型组肺组织中MUC5AC、P38MAPK的表达均有显着升高(P<0.05或P<0.01);与同时相模型组相比,清金化痰汤高,中,低剂量组(除低剂量第4d天外)和地塞米松组肺组织中MUC5AC、P38MAPK的表达均显着降低,以高剂量组第7d降低明显,P<0.05或P<0.01。6.Western blot测定肺组织P38MAPK、IκBα、NF-κBP65的表达情况:与同时相空白组相比,模型组中P38MAPK,NF-κBP65蛋白的表达均显着升高,而IκBα的表达明显降低(P<0.05或P<0.01),与同时相模型组相比,清金化痰汤高、中、低剂量及地塞米松组,大鼠肺组织P38MAPK,NF-κBP65表达均显着降低,而IκBα的表达明显升高(P<0.05或P<0.01)。7.相关性分析结果显示实验第7d,肺组织P38MAPK蛋白表达量与BALF中白细胞总数、TNF-α、肺组织中MUC5AC、NF-κBP65比较呈明显正相关。【结论】1.本研究证实LPS诱导的急性气道炎症大鼠模型BALF中炎性细胞、细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α,黏蛋白MUC5AC表达明显增多,支气管及肺组织炎症积分均明显升高,说明成功建立急性气道炎症模型大鼠。2.实验发现给予清金化痰汤治疗后BALF中炎性细胞、细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α,支气管及肺组织炎症积分均较模型组有明显的减少,有显着差异;Western blot检测肺组织P38MAPK、IκBα、NF-κBP65的表达量,其中P38MAPK、NF-κBP65表达较模型组有明显减少,而IκBα蛋白的含量明显增加,有显着性差异。实验第7d肺组织中P38MAPK与BALF中白细胞总数、TNF-α、肺组织中NF-κBP65之间呈正相关,由此表明清金化痰汤主要是通过调控细胞因子TNF-α介导的P38MAPK/NF-κB信号通路,下调P38MAPK、NF-κB信号蛋白,抑制IκBα的降解,从而抑制气道炎性细胞分泌和细胞因子的释放,改善气道炎症性损伤。3.实验发现给予清金化痰汤治疗后BALF中黏蛋白MUC5AC较模型组含量明显减少,有显着差异;SP法检测肺组织中MUC5AC、P38MAPK阳性表达较模型组明显减少,有显着差异;而Western blot检测肺组织P38MAPK、IκBα、NF-κBP65的表达量,其中P38MAPK、NF-κBP65表达较模型组有明显减少,而IκBα蛋白的含量明显增加,有显着性差异。实验第7d肺组织中P38MAPK与肺组织中MUC5AC之间呈正相关,由此证明清金化痰汤能够抑制气道黏液高分泌主要是通过调控P38MAPK/NF-κB信号通路,下调P38MAPK、NF-κB,从而减少黏蛋白MUC5AC的表达,以改善气道黏液高分泌状态。4.实验发现清金化痰汤通过调控细胞因子介导的P38MAPK/NF-κB信号通路,抑制炎症信号通路活性,进而减少气道炎症反应,发挥抗黏液高分泌,产生对气道的保护作用,且具有量效依赖性。5.从以上结果可以推测清金化痰汤改善大鼠急性气道炎症的调控机制是:清金化痰汤→激活P38MAPK信号传导通路→下调P38MAPK→抑制IκBα蛋白的降解→下调NF-κBP65→抑制炎性细胞、IL-1β、IL-8、TNF-α、MUC5AC的表达→生物学效应→抑制急性气道炎症反应及黏液高分泌状态。
刘璐瑶, 刘可可, 张雯雯, 曹娟, 杜奥博[4]2019年在《肿瘤相关巨噬细胞分泌的细胞因子在肿瘤微环境中作用的研究进展》文中提出肿瘤微环境(TME)内含多种细胞以及多种细胞因子,在肿瘤的增殖、侵袭以及转移上都起到了重要的作用。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)作为TME的重要组成部分,主要通过其分泌的细胞因子与肿瘤细胞相互作用,进而调控肿瘤的进展。本文对TAMs分泌的细胞因子在TME中的作用进行概述,包括肿瘤的侵袭、迁移以及血管生成等。靶向TME中TAMs分泌细胞因子进行干预,有望成为肿瘤一种新的治疗策略。
参考文献：
[1]. TNF-α抑制CD34～+细胞来源的GPA～+细胞增生的研究[D]. 肖卫国. 中国医科大学. 2002
[2]. TNF-α抑制CD34+细胞来源的GPA~+细胞增生的研究[C]. 肖卫国, 翟明. 第叁届全国血液免疫学学术大会论文集. 2003
[3]. 清金化痰汤通过P38MAPK/NF-κB信号通路改善大鼠急性气道炎症的作用和机制[D]. 宋洪娟. 成都中医药大学. 2017
[4]. 肿瘤相关巨噬细胞分泌的细胞因子在肿瘤微环境中作用的研究进展[J]. 刘璐瑶, 刘可可, 张雯雯, 曹娟, 杜奥博. 中国医药导报. 2019