林源特异腐质霉纤维素酶高产突变菌株的筛选鉴定与原生质体转化体系的优化

论文摘要

森林中广泛分布着各种纤维素资源,如林木、土壤凋落物等。纤维素作为自然界中含量最丰富的生物质材料,其降解利用不仅在人类生产生活中具有广泛应用,也对林木资源高效利用及森林生态系统健康维持具有重要意义。在本研究中,我们从森林土壤微生物中挖掘得到具有纤维素高效降解能力的特异腐质霉菌株,并对其进行了一系列研究,深入了对森林微生物的信息挖掘,丰富了森林资源开发利用的内涵,同时对森林生物资源的保护具有重要价值。高温真菌特异腐质霉（Humicola insolens）具有强大的纤维素酶和半纤维素酶生产能力。特异腐质霉来源的纤维素酶因作用温度较高（最高可达70℃）、作用pH为中性且具有良好的热稳定性和pH稳定性,因此在食品、纺织、洗涤、饲料和生物质降解等领域中具有广泛的应用价值和巨大的应用潜力。已有研究主要集中在对特异腐质霉基因克隆及蛋白纯化方面,而对于特异腐质霉菌株的遗传改造和其中纤维素酶表达调控机制的研究相对较少。本研究从特异腐质霉T-DNA随机插入突变体库中筛选鉴定得到一株纤维素酶高产突变菌株T53,对其摇瓶发酵水平的纤维素酶活力以及蛋白分泌量进行了检测分析。随后通过TAIL-PCR鉴定得到其T-DNA插入位点,并推测了插入突变基因的编码产物及其可能的生物学功能。为了进一步鉴定T-DNA插入突变基因在特异腐质霉菌丝生长及纤维素酶表达调控中的重要作用,我们建立并优化了特异腐质霉的原生质体转化系统。对特异腐质霉高效原生质体的制备条件进行一系列实验探索,得到了最优的原生质体制备和再生条件。同时,以含有G418抗性基因表达框的M13-neo为载体,成功实现了特异腐质霉的原生质体转化。相关研究结果的阐述如下:（1）在以微晶纤维素为诱导剂的摇瓶发酵条件下,突变株T53发酵6天的上清中的纤维素酶活包括滤纸酶活力、内切β-1,4葡聚糖酶活力、纤维二糖水解酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力以及木聚糖酶活力较野生型菌株分别提高40%、60%、90%、10%、60%。SDS-PAGE检测发现,与野生型特异腐质霉菌株相比,突变株T53发酵6天的上清中40 kDa左右处有明显增多的蛋白条带,结合质谱鉴定结果,该增加的蛋白确定为纤维素酶Cel6A、Cel6B、Cel7A、Cel7B、CMC3以及半纤维素酶XynA、XynB、XynC、Xyl43A和HIGAL。（2）通过TAIL-PCR克隆鉴定了T53菌株中T-DNA插入位点的侧翼序列,结果表明,T-DNA插入位点位于一个可能的C2H2型锌指蛋白类转录因子编码基因（命名为HicelR1,GenBank accession number MK468690）的上游启动子区域（ATG上游224 bp处）。BLASTP同源蛋白序列比对结果显示,HicelR1与顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的Krueppel-like因子、马杜拉足肿菌（Madurella mycetomatis）的金属硫蛋白表达激活剂、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的转录调节因子prz1分别具有41%、49%、39%的序列一致性。（3）探索了特异腐质霉原生质体的制备条件,发现特异腐质霉孢子萌发9 h、以蔗糖作为渗透压保护剂,以5g/L浓度的裂解酶酶解4 h为特异腐质霉的最优原生质体制备条件。在该条件下制备的原生质体在显微镜下呈正圆形,中部透亮,大小均一,具有高产量、高有效性的优良标准。构建了含有G418抗性基因表达框的载体M13-neo,通过原生质体转化方法转入特异腐质霉野生型菌株中,经PCR验证,成功得到阳性转化子。

论文目录

摘要

第一章引言

1.1 森林资源利用与森林健康

1.2 纤维素和纤维素酶

1.2.1 纤维素及其森林生态分布

1.2.2 纤维素酶

1.2.3 纤维素酶的分类

1.2.4 纤维素酶的作用机理

1.2.5 纤维素酶的应用

1.3 丝状真菌表达系统

1.3.1 丝状真菌表达系统的特点

1.3.2 丝状真菌表达系统的研究现状

1.3.3 丝状真菌纤维素酶基因工程表达策略

1.3.4 提高丝状真菌（半）纤维素酶表达的策略

1.4 特异腐质霉

1.4.1 腐质霉属的特点及分类

1.4.2 特异腐质霉内源纤维素酶与半纤维素酶

1.4.3 特异腐质霉研究进展

1.5 论文主要研究内容

1.5.1 立题科学依据及意义

1.5.2 研究内容

1.6 技术路线

第二章特异腐质霉纤维素酶高产突变菌株的筛选鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株、试剂与仪器

2.2.2 培养基

2.2.3 随机插入突变体的筛选

2.2.4 摇瓶发酵实验及纤维素酶酶活的测定

2.2.5 蛋白电泳检测

2.2.6 突变位点的鉴定

2.3 结果分析

2.3.1 纤维素酶高产突变菌株的筛选

2.3.2 T53 菌株的酶活鉴定

2.3.3 T53 菌株中T-DNA插入位点的鉴定分析

2.4 讨论

第三章特异腐质霉原生质体转化体系的优化

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株、试剂及仪器

3.2.2 培养基

3.2.3 特异腐质霉原生质体制备及转化试剂

3.2.4 特异腐质霉原生质体制备条件优化

3.2.5 特异腐质霉转化载体M13-neo的构建

3.2.6 特异腐质霉原生质体制备及转化方法

3.3 结果分析

3.3.1 特异腐质霉孢子不同萌发时间的菌丝形态

3.3.2 酶解时间对特异腐质霉原生质体制备的影响

3.3.3 特异腐质霉转化载体的构建

3.3.4 特异腐质霉的原生质体转化

3.3.5 特异腐质霉转化子的鉴定分析

3.4 讨论

第四章结论

参考文献

ABSTRACT

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈媛

导师: 张志伟

关键词: 特异腐质霉,纤维素酶,随机插入,锌指蛋白,原生质体转化

来源: 山西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 自然地理学和测绘学,农业基础科学,林业

单位: 山西农业大学

分类号: S714.3

DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000404

总页数: 54

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林源特异腐质霉纤维素酶高产突变菌株的筛选鉴定与原生质体转化体系的优化

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