钟万芳[1]2003年在《苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因及几丁质酶基因的克隆与特征分析》文中研究指明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是当前应用最广、最有效的微生物杀虫剂。其突出特征是在形成芽孢的过程中，能形成具有杀虫活性的伴胞晶体。伴孢晶体是Bt杀虫活性的主要来源，它由一种或几种晶体蛋白组成，具有高度特异的杀虫活性，这种蛋白通常被称为杀虫晶体蛋白(ICPs)或δ-内毒素(δ-endotoxins)。ICPs的专一性很强，通常一种毒素只能杀死某一目标昆虫，对益虫及脊椎动物无毒，是一种安全有效的杀虫蛋白。到目前为止，已有二百多种ICP基因被克隆。但是随着Bt应用的不断扩大，Bt-ICPs基因均在不同程度上引发了昆虫的抗性。所以，寻找新的高毒力菌株及基因以延缓昆虫对Bt的抗性是解决昆虫抗性问题的有效途径。 几丁质又叫甲壳素、壳多糖、聚乙酰氨基葡糖，是昆虫外壳及中肠围食膜的主要结构成分。几丁质酶可将几丁质分解成N-乙酰氨基葡萄糖；研究表明，几丁质酶能增强Bt的杀虫效果，有利于克服或延缓昆虫对Bt的抗性。 基于以上考虑，本论文设计了两对引物，应用PCR技术分别从Bt sotto质粒DNA和Bt israelensis基因组DNA中扩增得到杀虫晶体蛋白cry1Aa13基因和几丁质酶ichi基因，并进行了序列分析和功能预测。主要研究结果如下： 1．建立了苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取方法。该方法可有效去除染色体DNA及RNA，省略了苯酚和氯仿抽提过程，不用担心痕量酚对质粒DNA质量的影响。 2．根据cry1A基因保守序列设计引物，利用PCR技术扩增了杀虫晶体蛋白基因，该基因已在GenBank中登录，登录号为AF510713，目前已被Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Aa13。 3．对cry1Aa13进行了生物信息学分析，发现该基因含有一个由3543bp组成的开放阅读框，编码1180个氨基酸，分子量约为133.50kDa。氨基酸序列与cry1Aa类基因高度同源，达95％ 苏云金井他杆菌杀虫品体葫臼基因及几丁匝荫基因的克隆与特征分析 以上；其编码区含有叁个保守结构域，即结构域1、结构域11和结构域m。4－根据儿丁质酶基因保守序列设计引物，利用PCR技术扩增了几丁质酶ci基因，该基因已在 GcnBank中登录，登录号为AF526379。5．对 ichi进行了生物信息学分析，发现该基因序列全长为 2570hp，包括启动于、N码区和终止 子序列，是一个完整的基因。其中编码区由一个m价加的开放阅读框（ORF）组成，编码 688 个氢基酸，推测分子量为 75．79 kDa，等电点 pled．o。Itlll由分泌信号肽（46AA）、催化区 （105AA）、粘蛋白皿型同源区（74AA）和几丁质结合区（4（）A）4个结构域组成。
罗朝辉[2]2007年在《苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因与烟草几丁质酶tchiA21基因的重组表达及功能研究》文中提出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物，苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋自结构和作用机制是目前国内外研究的一个热点；但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，因此在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上，通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。本研究利用苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchi21基因重组获得高效杀虫工程菌株XBU-HUAccB5。从研究室保存的菌株Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)出发，通过设计引物Ac-F／Ac-R和ter-F／ter-R，以其质粒为模版PCR扩增cry1Ac基因及cry1Ac基因的终止子下游序列，设计引物chi-F／chi-R从含有烟草几丁质酶cDNA的质粒中PCR扩增tchi21基因，用NcoⅠ酶切上述两步的PCR产物，回收两个酶切片段进行连接，以连接产物为模板，用chi-F／ter-R引物对扩增融合chi-ter片段，利用构建含Bt 4.0718菌株的cry1Ac基因质粒pUAc19和融合chi-ter片段用BglⅡ和SmaⅠ酶切、回收、连接，构建中间载体质粒pUAccB19，同时将质粒pUAccB19和穿梭表达载体pHT315用SalⅠ／SmalⅠ酶切，回收其目的片段，构建表达载体质粒pHUAccB5，将表达载体pHUAccB5电转化无晶体突变株XBU001获得重组菌株XBU-HUAccB5。对工程菌株XBU-HUAccB5经SDS-PAGE和Western blotting分析：工程菌株分别表达了130 kDa的Cry1Ac蛋白，同时还表达了30 kDa的几丁质酶蛋白，经Western blotting检测，工程菌株XBU-HUAccB5的Cry1Ac蛋白和几丁质酶的表达得到证实，经原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)观察显示，工程菌株XBU-HUAccB5产生晶体蛋白呈有规则的菱形；在对发酵液的几丁质酶酶活性检测中，无晶体突变株在的酶活发酵过程中一直保持在1.5U／ml，工程菌XBU-HUAccB5的几丁质酶酶活一直呈上升的趋势，在72h时达到最高峰为7.5U／ml，是无晶体突变株的5倍，几丁质酶活变化趋势与工程菌的生长曲线一致。生测结果显示：工程菌HTX-42(cry1Ac单价基因转XBU001)对初孵棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)在48h的LC_(50)是117.7780μg／ml，72h的LC_(50)是89.8691μg／ml；工程菌XBU-HUAccB5(cry1Ac与几丁质酶tchi21双价基因转XBU001)对初孵棉铃虫在48h的LC_(50)是10.4240μg／ml，72h的LC_(50)是4.7904μg／ml。工程菌XBU-HUAccB5比工程菌HTX-42对棉铃虫的生测毒力处理在48h时高11.30倍，在72h高18.76倍。结果表明在72h内随着时间的延长，几丁质酶协同Cry1Ac杀虫的效果越显着。本研究已成功构建cry1Ac基因和tchi21基因融合的Bt工程菌，这对进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株，研制出超效、广谱、安全的杀虫剂，以克服Bt杀虫剂存在的杀虫毒力低、易产生抗性等问题的研究提供了新的技术途径。
伍赠玲[3]2004年在《苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位》文中指出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是研究最为深入、使用最为广泛的一种杀虫微生物，在生物防治中占有极其重要的地位。营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs)是一种在对数生长期分泌的活性蛋白，主要分为VIP1、VIP2和VIP3叁类，其中，VIP3A对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性，甚至能毒杀一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫。几丁质酶能够分解作为真菌细胞壁和昆虫围食膜主要成分的几丁质，具有重要的生防价值。研究苏云金杆菌VIP3A、几丁质酶对开发Bt新资源、改良Bt制剂具有重要意义。 Bt基因定位研究可以拓宽Bt杀虫谱，增强杀虫活性。确定了基因在基因组中的位置后，即可对该基因所在的质粒或染色体进行限制性酶谱的构建以及全序列的测定，有助于发现新的基因、研究基因之间的互作关系和表达调控机制。 本研究对Dt编码VIP3A、几丁质酶的基因进行了克隆和定位。主要研究结果如下： 一、对常规的叁种提取Bt质粒DNA的方法进行了比较。煮沸裂解法提取的质粒DNA杂质多，只能作为粗略检测的模板；BGSC法适合于提取分子量较大的质粒DNA；用常规碱裂解法所得的质粒DNA条带不全，大质粒缺失，且重复性差，不适合作Southern杂交的模板DNA。本研究摸索出一种适合于提取Bt质粒的改良碱裂解法，该法提取的质粒DNA条带清晰、无拖尾，谱带齐全，且质粒DNA纯度高，产物可直接用于限制性内切酶消化、PCR扩增等分析，满足Southern杂交的对模板纯度较高的要求。 二、克隆了WB50的vip3A基因并在GenBank上登录(登录号AY295778)。根据GenBank上已知的Bt vip3A基因序列(登录号：L48811)，设计出扩增vip3A基因的一对含NotⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物VCL1／VCL2，以WB 50的质粒DNA为模板，利用PCR扩增出vip3A基因序列。将PCR产物纯化回收后连接到克隆载体pMD18-T上，用CaCl_2转化法导入到受体菌Escherichia coli JM109中，福建农林大学硕士学位论文摘要在x一gal、IPTG平板上挑选若干个白色菌落，进行限制性酶切和PCR分析，验证阳性克隆子并测序。测序结果经在线的Blast软件进行同源性分析表明:与其高度同源的基因均为人尸3A基因，同源性高达99%以上，该基因在GenBank上的登录号为AY295778。 叁、WB50菌株v动刘基因定位。WB50菌株的v勿3A基因是从质粒DNA中克隆得到的，初步推测viP剑基因定位于质粒上。为进一步验证此推测以及精确定位该基因，将质粒DNA各条带纯化、回收，PCR分别扩增F劫3A基因，结果表明，叮刀别基因不定位在小于23kb的质粒上。以染色体DNA为模板进行PCR扩增，未得到目的片段，确定染色体DNA不编码1材乡3A基因。以F动3A基因468 bp的片段作探针，对WB50的质粒和染色体DNA进行Southern杂交，结果表明，该基因定位于31.8 kb的质粒上。 四、WB50菌株chi基因定位。本研究从Bt菌株wB50的总DNA和染色体 DNA中扩增出几丁质酶基因(chi)，而用质粒DNA则无法扩增出该基因，将该基因初步定位于质粒外的遗传因子上。此外，采用chi基因片段作探针，对WB50菌株的DNA样品进行Southem杂交，进一步精确定位该基因在染色体上。
檀建新[4]2000年在《Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究》文中研究表明苏云金芽孢杆茵产生的杀虫晶体蛋白对鳞翅目等多种害虫具有杀虫活性，几丁质酶对植物真菌病害有防治作用。本文从这两方面入手对苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因克隆、表达和环状芽孢杆菌几丁质酶进行了研究。以期为构建具有杀虫和抗病双重活性的工程菌或转基因植物提供科学依据和有效材料。1．苏云金芽孢杆菌C005是由湖北Bt中心提供的国内自行分离的对鳞 翅目害虫小菜蛾具高毒力的野生菌株，能产生双锥体晶体。PCR-RFLP 鉴定含有cry1Ab基因。以此菌株为出发菌株，PCR扩增产物为探针， 通过Southern blotting证明质粒的PstI酶切产物中8.5kb处有阳性杂 交带，利用PCR方法筛选转化子，克隆了含cry1Ab全长基因的8.5kb 大片段并测序。该基因编码区为3468bps，Cry1Ab13蛋白含1155个 氨基酸、分子量为130.6kDa，等电点为pH4.845。该基因已在 EMBL/GenBank基因库中注册，Accession number为AF254640，被 国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ab13。2．苏云金芽孢杆菌B-G-8是由东北农业大学提供的国内自行分离的野 生菌株，经PCR—RFLP鉴定B-G-8菌株中含有新的cry1A基因。B-G-8 质粒DNA经Sau3AⅠ部分酶切，回收5～7kb片断与pUCP19连接 并转化大肠杆菌，利用PCR方法筛选转化子，克隆了含cry1A全长 基因的6.9kb大片段并测序。序列同源性分析表明3000bps的编码区 序列与cry1Ac5的同源性最高为82.8％，说明该基因是一新的cry1A 基因。该基因编码区长3549bps，编码1182个氨基酸的蛋白质，蛋白 分子量为134kDa，等电点是pH4.985。现已提交EMBL/GenBank基 因库注册，Accession number为AF281866。DE＜将含 CrylAbl3的 8．skb的 PSt大片段插入广宿主载体 pGMll05，构建了含CI’y jAbjJ的重组质粒pGM81，并转化大肠杆菌JM107石，荧光假单胞菌和苏云金芽抱杆菌无晶体突变株CryB”，得到转化子分别是 ETG81－J、ETGS Is，PtTG81和 Bi。tISI，SDS—PAGE电泳证明它们都表达了Cry1Ab 130石kDa蛋白。电镜观察表明BiotI81有双锥体形晶体形成。PffG81和 Bi。tI81均表现出杀虫活性。PffG81原液 48小时使敏感品系的小菜蛾死亡率达 90％，Bi。tISI在 24个时对北京地区小菜蛾（敏感品系）的LC；。为工35qL／mL，对海南地区小菜蛾（抗性品系）24刁时的 LC。。为弓．35卜L／mL。4卜L／g浓度的 BiotI81 和 C005对棉铃虫体重增加的抑制作用分别为 97．7％和 gi二％。 将含有 CryIA基因的大片段插入 E COltst穿梭载体 pHT315，转化大肠杆菌JM、SCSllo和苏云金芽抱杆菌无晶体突变株BE20，也获得了转化子 ETG59－J、ETG59－S和 Bi。tI59，BIOtI59 SDS—PAGE电泳在70kD处有蛋白带表达。电镜下观察到双锥体形晶体。 Bi。tISI和 Bi。tI59比出发菌株 C005和 B．G．8的生长略慢，蛋白质表达也相应推迟，但生长趋势一致。从颐和园等地点采集土样、沙样等共55个，搜集各类细菌228株，在几丁质平板上用透明圈法筛选得到 4株细菌、12株放线菌，60株 BI均有较高的几丁质酶活性，其中CT14菌株的几丁质酶活性最高。CT14菌体形态为长杆状，0．4～0石XI．6～4．8 u m，芽泡膨大中生或近端生，椭圆形，菌落淡黄色、湿润粘稠，经鉴定 CT为环状芽抱杆菌。比较了 CT几丁质酶活性测定方法中的影响因素，确定最佳反应条件是：500 p L反应体系中几丁质酶作用时间20分钟、加入蜗牛酶40u L（0．ic／mL）、保温 30分钟、力入 0．smol＊的 K。B，0，150 u L、DMAB量至少ZmL，并且须在反应结束后30分钟内测定585urn OD值。 不同碳、氮源对 CT几丁质酶活性影响试验表明：在无几丁质的培养基中 CTI4的几丁质酶有一定表达，加入几丁质后可以诱导几丁质酶大量表达：在以几丁质为碳源的含氮源的培养基中，由于无其他单 二中臼农业科学院博士学位论文糖抑制，发酵液有较高的几丁质酶活性。 CT几丁质酶在洲～7的缓冲液中能保持较高的稳定性，pH7时活性最高：几丁质酶在20～40℃条件下保温30分钟仍有较高稳定性，且在 40℃时几丁质酶活性最高。0．lmol／L Na＼ K二 Mg‘＼ Ba‘二 Zn‘”Ga‘”Mn‘”，Cu‘”，Ag”，Fe‘“金属离于均不同程度抑制几丁质酶的活性，但 F／。对几丁质酶有一定激活作用。6．CTI4几丁质粗酶液经阴离子交换柱层析后产生一个穿透峰（PO）和叁 个盐洗脱峰（PI，Pll，Pill），它们都有几丁质酶活性。SDS—PAGE 电泳表明有几丁质酶活性的穿透峰中蛋白质分布在40～50kDa之间， 而盐洗脱峰 PI中蛋白质在 60kDa或 25kDa左右，盐洗脱峰 Pll中的蛋 白质存在于25kDa或20kDa左右，盐洗脱峰Pill中的蛋白质在20kDa 以下。据此推测，CT菌株的几丁质酶可能不只一种。7．抑菌试验表明：0．sing CTI4几丁质酶粗蛋白，对多种病原真菌生长?
刘汉军[5]2005年在《hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究》文中研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)的cry基因中cry1类基因的启动子是一类芽孢依赖型启动子,从芽孢形成T_2期开始被激活。虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ,简称Hwtx-Ⅰ)是虎纹捕鸟蛛分泌产生的一类乙酰胆碱受体阻断剂,作用于神经肌肉的连接处,能阻断神经肌肉的信号传导,其溶液构象为叁对二硫键和叁股反平行β折叠的抑制剂胱氨酸结构模体。同时,其生物学活性表明也是一种N型Ca~(2+)离子通道的阻断剂。本研究根据已知的Hwtx-Ⅰ氨基酸序列,按照苏云金芽孢杆菌偏爱密码,将氨基酸序列转换成核苷酸序列,并将其基因单价体分片段化学合成。将合成片段磷酸化并退火连接。同时设计一段含有核酸内切酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ位点的衔接子linker,利用这两种内切酶酶切后的粘性末端互补这一特性,可将hwtx-Ⅰ基因头尾串联形成四价体。 带有Bt杀虫晶体蛋白基因cry1Ac的质粒pUA19经内切酶BsaBI和MunI酶切后,去掉了cry1Ac基因的ORF,只剩下cry1Ac基因的上游启动子序列和下游终止子序列。将设计的linker片段插入此位点,得到pUAK质粒,利用内切酶SpeⅠ和Xba Ⅰ双酶切后将已退火连接好的hwtx-Ⅰ基因插入其中,得到质粒pUKH1。将质粒pUKH1分别用SalⅠ/SpeⅠ 和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH2,将此质粒分别用SalⅠ/JpeⅠ和Sal Ⅰ/Xba Ⅰ双酶切回收其中目的片段,连接后得到质粒pUKH4。将pUKH4用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收1.1kb片段,与同样双酶切的大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌的穿梭载体pHT304连接得到表达质粒pXH4。将pXH4分别电转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株XBU001和野生型菌株Bt4.0718中,Hwtx-Ⅰ四价体在苏云金芽孢杆菌转化子中得到表达,蛋白质定量分析显示目的蛋白摇瓶发酵表达量达到14.0mg/L。目的蛋白在XBU001的重组子UH04中占可溶性蛋白总量的11.48%,在Bt4.0718的重组子Bh4-4中占可溶性蛋白总量的4.51%。生测结果显
冯学[6]2007年在《苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究》文中指出每年，农业虫害在全球范围内对农作物造成的损害，是农作物减产的最主要因素之一。由于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringensis)对大多数农业害虫都具有特异的杀虫活性，并且，对人畜安全，不污染环境。目前，已成为世界上产量最多、应用最广泛的微生物杀虫剂。特别是，随着植物基因工程的发展，利用转基因植物来防治害虫已经进入到实际运用阶段，其中，在抗虫转基因植物方面，Bt杀虫基因得到了最为普遍的应用。本研究在克隆新的cry基因的基础上，用Cry2Ab、Cry2Aa、Cry1Ca、Vip3Da或Vip3Af杀虫蛋白对水稻二化螟、大螟的杀虫活性进行了生物活性分析；改良了培养Bt菌株的传统牛肉膏蛋白胨培养基。1．本文从实验室自行分离的C006菌株中，经PCR扩增鉴定、酶切分析和构建质粒DNA文库的方法，获得了含有10kb阳性片段转化子，对其进行亚克隆，经测序分析发现该片段含有2种cry基因，其中一个是新的cry1类基因，与己知的cryl类基因的同源性低于80％，并在GeneBank中登记，序列注册号为EF550989。另一个基因核苷酸序列与cry1Ab13一致。2．将crylGb2全长基因分别插入Bt和E coli表达载体，在大肠杆菌BL21和苏云金芽胞杆菌HD73~-中分别表达出133kDa的Cry蛋白，并且在Bt无晶体突变株中能形成典型的双锥体型晶体。这种新蛋白对小菜蛾进行生物活性测定，具有很强的毒力，LC_(50)为7.48μg／mL。3．针对水稻重要鳞翅目害虫二化螟和大螟，从本组已有的基因中选用15种，分别进行单一蛋白杀虫活性筛选，结果表明对水稻二化螟幼虫具有活性的Cry2Aa、Cry2Ab、Vip3Da蛋白，它们的致死中浓度LC_(50)分别为：27.59、13.88和10.29μg／g；毒蛋白组合Cry1Ab与Cry2Aa、Cry1Ab与Cry2Ab、Cry1Ab与Vip3Da、Cry1Ca与Cry2Aa、Cry1Ca与Cry2Ab、Cry1Ca与Vip3Da对二化螟LC_(50)分别为：0.39、0.43、0.15、0.79、0.64和3.39μg／g，不同毒蛋白的协同增效作用显着。4．对夜蛾科害虫大螟的杀虫结果表明：Cry1Ca对水稻大螟具有较显着的活性，Cry1Ca对水稻大螟的LC_(50)为4.28μg／g，Vip3Aa为16.64μg／g，Vip3Af为57.54μg／g，Vip3Da为13.93μg／g。5．对几种不同的Bt培养基进行优化，获得了最佳的配方：含有50mMTris-HCl、pH为7.2的牛肉膏蛋白胨培养基，能获得最大产量的蛋白晶体，该培养基稳定的缓冲能力，减少了晶体在培养过程中的溶解，有效地抑制了Bt菌株内源蛋白酶对晶体蛋白的降解。6．对造成中国林木严重危害的黄斑星天牛的饲养与生物测定方法进行了筛选和探索，建立了饲养和生测方法：同时也筛选到两株对天牛有毒杀活性的菌株，这将为以后对天牛具有杀虫活性的Bt基因的筛选奠定基础。
苏争先[7]2006年在《Bt几丁质酶基因chi7转化枯草芽孢杆菌的研究》文中研究指明摘要：从本室分离保存的几丁质酶高产菌株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringienssis,Bt)Bt50中提取总DNA，再根据已经在GenBank上登录的Bt几丁质酶基因 chi7序列，设计出包含两种不同的限制性内切酶的1对引物ChiF／ChiR，用PCR方法扩增出的几丁质酶全长基因，将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入E. coliJM109中克隆得到2，025bp包含氨基酸全序列的几丁质酶基因chi7。再根据GenBank上登录的Bacillus subtilis subsp. subtilis str．168(简称BS168)序列(在GenBank上的登录注册号为NC 000964)，设计出包含两种不同的限制性内切酶的扩增rpsD启动子的1对引物RpsF/RpsR，用PCR方法扩增出的rpsD启动子基因，将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入E. coli JM109中克隆得到380bp的rpsD启动子基因，命名为rpsP。然后，将几丁质酶基因chi7和rpsD启动子基因rpsP连接到穿梭载体pAD123上，转化E.coli JM109，筛选得到重组原核表达质粒pAD-rpsP-chi7。 将重组原核表达质粒pAD-rpsP-chi7，电激转化到Bacillus subtilis(abbr.BS)受体菌株BS-2中，用PCR检测重组质粒pAD-rpsP-chi7是否导入，最后筛选得到含有Bt几丁质酶基因的BS-2工程菌。初步研究表明在液体培养基上重组质粒的稳定性遗传优于在斜面固体培养基上的稳定性，同样培养到100世代的条件下，液体培养条件下的质粒丢失率为0.0％，而固体培养条件下质粒丢失率达到了46.73％。而对BS-2和BS-2工程菌进行抑菌实验比较，发现含有几丁质酶的Bs-2比没有外源基因的BS-2对番茄茎基腐病菌和葡萄灰霉病菌这两种病原菌的抑制效果更高，可以达到83.0％以上。
林毅, 关雄[8]2004年在《苏云金杆菌HD224菌株几丁质酶基因的克隆与序列分析》文中认为从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)canadensis亚种HD224菌株中分离了几丁质酶基因.其序列全长为2031 bp,编码676个氨基酸,分子量为74.54 kDa,等电点6.12.其编码的氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌几丁质酶CHiB(AB041932)、苏云金杆菌肯尼亚亚种几丁质酶ChiA74(AF424979)、以色列亚种(AF526379)、巴基斯坦亚种(U89796)的相似性分别为98.1%、98.2%、96.7%和87.6%.其编码区包含信号肽、催化区、粘蛋白Ⅲ型同源区及几丁质结合区4个部分.
付祖姣[9]2008年在《苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建》文中提出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)4.0718菌株是新筛选的一株高毒力菌株,现已成功用于商业化生产。该菌株在芽胞形成的同时能够产生菱形和方形两种晶体,对棉铃虫(Helicoverpa armigera)等农业害虫表现出高效杀虫活性。为了全面阐述该菌株高效杀虫的背景,更好地利用该菌株进行生物杀虫剂的开发,本研究系统分析了Bt 4.0718菌株的杀虫基因型及表型,包括质粒带型、杀虫基因类型和晶体蛋白类型的研究。结果显示,Bt 4.0718菌株在质粒带型和蛋白带型上是一个独特的Bt新菌株。PCR检测发现该菌株含有5种cry基因,包括cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa、cry2Ab和cry1Ia基因,同时含有vip3A和几丁质酶基因。采用SDS-PAGE和液质联用质谱仪(LC-MS/MS)分析Bt 4.0718菌株的晶体蛋白,鉴定到该菌株的130 kD蛋白由Cry1Aa和Cry1Ac原毒素组成,而65 kD的蛋白由Cry2Aa原毒素组成。为了更快地筛选具有新的杀虫特性的Bt菌株或杀虫晶体蛋白,本研究创新性地建立了一种对Bt原毒素表达谱进行鉴定的新方法,即通过包埋Bt菌株产生的晶体蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝胶块中,结合LC-MS/MS分析胶内酶解的复合肽段,从而快速鉴定晶体蛋白中原毒素的组成。本研究首先以模式菌株Bt库斯塔克亚种(Bt subsp.kurstaki)HD1菌株为对象,采用该方法检测HD1菌株晶体蛋白的组成。结果显示,采用聚丙烯酰胺凝胶块结合LC-MS/MS技术能准确检测到HD1菌株中表达的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa蛋白。同时,本研究以杀虫基因背景很清楚的Bt以色列亚种(Bt subsp.israelensis)4Q2-72和鲇泽亚种(Bt subsp.aizawa)HD133菌株为研究对象,检测到4Q2-72菌株表达了Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、cyt1Aa和Cyt2Ba等6种晶体蛋白,而HD133也表达了Cry1Ab、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Ba、Cry1Ad和Cry1Ka 6种原毒素,其中后两种原毒素还未在任何文献中见报道。这些实验结果证实了该种原毒素检测方法是一种新型的鉴定Bt原毒素表达谱的方法,具有直接、快速、准确的特点。该方法将有力推动Bt菌株的筛选工作,对于其它生物组织的蛋白质组学分析也具有重要的参考价值。为了获得毒力更高和杀虫谱更广的Bt菌株,扩展Bt杀虫剂在农林害虫防治上的应用,本研究采用分子生物学手段将Bt cry1Ac基因与来源于虎纹捕鸟蛛的具有蛋白酶抑制剂活性的基因hwtx-11融合,构建了系列工程菌,并成功地在大肠杆菌和Bt无晶体突变株中检测到了Hwtx-11和融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11的表达。通过检测工程菌发酵产物对甜菜夜蛾和棉铃虫初孵幼虫的生物活性,发现Hwtx-11对甜菜夜蛾有明显毒力,且明显减慢了甜菜夜蛾的生长速度,融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11对两种靶标昆虫表现出比Cry1Ac蛋白更高的杀虫毒力。本研究为构建具有不同杀虫特性的融合蛋白以及构建高毒力的工程菌株奠定了重要基础。
肖亮[10]2010年在《地衣芽孢杆菌MY75几丁质酶特性及表达调控元件的研究》文中进行了进一步梳理MY75菌株是本室保藏的一株革兰氏阳性、芽孢杆菌。当培养基中有几丁质存在时,该菌株能够大量表达胞外几丁质酶,且酶活力在筛选的近1000株芽孢杆菌中是最高的。为了明确MY75菌株的分类地位,首先对该菌株进行了鉴定。在鉴定过程中发现,MY75菌株16S RNA序列与枯草芽孢杆菌菌群(Bacillus subtilis group)中的芽孢杆菌之间具有高度的相似性,而不能利用目前广泛采用的16S RNA序列分析法进行有效地区别。于是,又以另两个蛋白编码基因gyrA(编码DNA促旋酶A亚基,gyrase subunit A)和rpoB(编码DNA介导的RNA聚合酶p亚基,RNA polymerase subunit beta)序列为依据,并参照Biolog微生物自动鉴定的结果,最终确定MY75菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifromis)MY75菌株在培养96小时后,产生的胞外几丁质酶达到顶峰—4.645 U/mL使用从该菌培养上清液中制备的粗蛋白进行了抑真菌实验,发现几丁质诱导后的菌株粗蛋白能够完全抑制小麦赤霉(Gibberella saubinetii)和黑曲霉(Aspergillus niger)孢子的萌发,而未经诱导的样品则没有此效果,初步证明MY75菌株培养上清液的抑真菌活性来源于其高量表达的胞外几丁质酶。将MY75菌株培养液上清中的粗蛋白进行初步分离纯化,经酶谱分析技术检测,发现一条特异的、约55 kDa大小的蛋白带表现出几丁质酶活性。对该蛋白进行飞行时间质谱(time-of-flight mass spectrometer, TOF MS)分析,发现其氨基酸序列与蛋白质数据库中的地衣芽孢杆菌67 kDa大小的几丁质酶同源性很高。根据GenBank中已提交的地衣芽孢杆菌几丁质酶序列设计引物扩增并克隆了MY75菌株中的几丁质酶基因chiMY75。该基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)长度为1797 bp,编码599个氨基酸,预测蛋白大小为67 kDa。该ORF序列与GenBank中已有的地衣芽孢杆菌几丁质酶基因序列的相似性达99%。将chiMY75亚克隆至表达载体pET28a并转化E. coli。在转化子细胞的破碎上清液中检测到了特异表达的67 kDa大小的蛋白。对异源表达的几丁质酶ChiMY75的特性进行了研究。该酶的最佳作用pH值为7.0,最佳作用温度为50℃。锰、铬、锌、银四种离子能够显着地降低ChiMY75的活性；而锂、钠、镁离子则对酶活力有轻微的促进作用；铜和铁两种离子则会使该蛋白完全失去活性。在抑真菌活性检测中,酶活力为6.32 U/mL的ChiMY75能够完全抑制小麦赤霉和黑曲霉的孢子萌发。在杀虫生物测定中,ChiMY75的加入使得苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼虫的毒力提高了27%。为了对芽孢杆菌几丁质酶的调控元件进行研究,克隆了MY75菌株几丁质酶基因完整序列chiMY75full,包括ORF及其上游调节区域的432 bp。同时将本室前期克隆的苏云金芽孢杆菌15A3菌株的几丁质酶完整基因chiB也作为研究对象。利用软件对上述两个几丁质酶基因的上游调节序列进行了分析,预测出潜在的启动子序列等调控元件。序列分析发现,二者的上游序列中均存在长度为16 bp的正向重复序列。两个完整的基因都可以利用自身携带的启动子在E. coli中大量表达几丁质酶。对所发现的重复序列分别进行了定点的部分及全部缺失,从酶活性、蛋白表达量以及特异mRNA转录量叁个水平观察缺失基因调控表达的变化。酶活检测结果证明,缺失chi基因正向重复序列的转化子培养液的酶活力明显高于完整chi基因的转化子；蛋白质SDS-PAGE电泳结果显示,缺失正向重复序列的一系列chi基因所表达的几丁质酶蛋白量显着高于完整的chi基因的转化子；Northern Blot结果显示,缺失重复序列之后,与两种几丁质酶基因相对应的mRNA转录量也有显着提高。这些结果证明,芽孢杆菌几丁质酶基因中的正向重复序列,是基因表达时的负控制调节元件,很有可能是转录抑制物的结合位点。定点缺失结果还显示,缺失全部重复序列的chiB基因与缺失部分重复序列的chiB基因相比较,叁个检测水平都明显增高。本研究中,我们将MY75菌株鉴定为地衣芽孢杆菌。通过在E. coli中的异源表达,确定了MY75菌株中几丁质酶的抑真菌活性及对苏云金芽孢杆菌杀虫的增效作用。在2株芽孢杆菌几丁质酶编码基因的上游,均发现了正向重复序列,通过对正向重复序列的定点缺失,证明该序列是几丁质酶基因表达的负调控元件,能在转录水平上控制几丁质酶的表达。本研究不但为芽孢杆菌几丁质酶基因调控机理的研究提供了基础,还证明了MY75菌株在生物防治方面的应用潜力
参考文献：
[1]. 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因及几丁质酶基因的克隆与特征分析[D]. 钟万芳. 西南农业大学. 2003
[2]. 苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因与烟草几丁质酶tchiA21基因的重组表达及功能研究[D]. 罗朝辉. 湖南师范大学. 2007
[3]. 苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位[D]. 伍赠玲. 福建农林大学. 2004
[4]. Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究[D]. 檀建新. 中国农业科学院. 2000
[5]. hwtx-Ⅰ基因四价体表达载体构建及苏云金芽孢杆菌工程菌株研究[D]. 刘汉军. 湖南师范大学. 2005
[6]. 苏云金芽胞杆菌新基因的克隆及杀虫蛋白生物活性的研究[D]. 冯学. 东北农业大学. 2007
[7]. Bt几丁质酶基因chi7转化枯草芽孢杆菌的研究[D]. 苏争先. 福建农林大学. 2006
[8]. 苏云金杆菌HD224菌株几丁质酶基因的克隆与序列分析[C]. 林毅, 关雄. 中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第六次学术交流会论文集. 2004
[9]. 苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建[D]. 付祖姣. 湖南师范大学. 2008
[10]. 地衣芽孢杆菌MY75几丁质酶特性及表达调控元件的研究[D]. 肖亮. 南开大学. 2010
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