孔梅, 陈慰浙, 陈智, 李敏伟[1]2004年在《外源性FHIT基因表达对胃癌细胞株MGC-803凋亡作用的影响》文中研究表明目的 :探讨外源性 FHIT基因的表达对胃癌细胞株凋亡作用的影响。方法 :将载有人外源性 FHIT基因的真核表达质粒 p Rc CMV- FHIT用脂质体介导转入胃癌细胞株 MGC- 80 3,用流式细胞仪、普通光镜、透射电镜观察 FHIT基因的表达对 MGC- 80 3细胞凋亡的影响。结果 :转染 FHIT基因的 MGC- 80 3细胞的凋亡水平 (32 % )与空质粒转染组 (12 .15 % )相比明显增高 ,且存在显着性差异 (P<0 .0 1) ,同时细胞的生长周期出现了明显的 G0 /G1期阻滞 (6 4.375 % vs 4 9.5 % )。结论 :外源性 FHIT基因能诱导胃癌细胞株 MGC- 80 3凋亡 ,细胞生长周期阻滞。
付信娟[2]2007年在《外源性FHIT基因对胃癌细胞增殖和化疗敏感性的影响》文中研究表明【背景与目的】胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,在我国无论发病率还是死亡率都很高,严重威胁人类健康。化疗是治疗胃癌的一个重要手段,而目前对胃癌的化学治疗疗效并不理想,其中肿瘤细胞的抗药性是妨碍其治疗效果的主要原因之一。因此,如何提高化疗药物的疗效是目前肿瘤治疗的一个研究热点。脆性组氨酸叁联体(fragile histidinetriad,FHIT)基因是近年发现的抑癌基因之一,也是第一个将脆性位点和肿瘤联系起来的抑癌基因,很多研究表明FHIT基因异常可能与人类胃癌的发生发展有关。绝大多数化疗药物是通过不同的途径诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用的,凋亡调节可影响某些抑癌基因的表达并且影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,而细胞凋亡机制缺陷是肿瘤细胞产生耐药的关键因素之一。基因治疗为当今肿瘤治疗的热点之一,化疗和基因治疗联合应用成为恶性肿瘤新的综合治疗途径之一。已有研究发现,外源性FHIT基因可促进某些肿瘤细胞发生凋亡,也能改变某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,但对于FHIT基因表达是否能够改变化疗药物对胃癌的疗效研究很少。本研究通过脂质体转染技术将FHIT基因转染到有FHIT基因表达缺失的MGC-803胃癌细胞株,观察FHIT基因表达对胃癌细胞增殖和化疗敏感性的影响。【方法】碱裂解法提取质粒并对所提质粒测序鉴定。通过脂质体介导的方法把质粒pRC/CMV-FHIT及pRC/CMV转染到有FHIT基因表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,经G418筛选获得稳定克隆,并对转染后的胃癌细胞用Western blot鉴定,通过集落形成实验、细胞生长曲线和凋亡率观察FHIT基因对胃癌细胞增殖的影响,通过MTT法检测不同药物浓度下的肿瘤细胞存活率并求得IC_(50)以探讨FHIT基因对胃癌细胞化疗敏感性的影响。【结果】(1)提取的质粒测序结果显示与Gene bank中序列一致,质粒浓度和纯度均符合试验要求。(2)转染FHIT基因的胃癌细胞有外源性FHIT基因的表达。(3)转染FHIT基因的胃癌细胞生长能力下降,MGC-803-FHIT组、MGC-803组和MGC-803-vector组的克隆形成率分别为(19.67±3.16)%、(35.00±3.16)%和(29.50±4.76)%,细胞凋亡率分别为(19.59±2.90)%、(3.38±1.29)%和(4.41±0.94)%,MGC-803-FHIT组的克隆形成率和凋亡率与MGC-803组和MGC-803-vector组差异均有统计学意义。(4)转染FHIT基因的胃癌细胞对顺铂(DDP)引起的细胞存活率下降、对5-氟尿嘧啶(5-FU)引起的细胞存活率提高。顺铂(DDP)引起的MGC-803-FHIT组、MGC-803组和MGC-803-vector组的IC_(50)分别为(2.09±0.50)mg/L、(4.17±0.07)mg/L和(4.06±0.19)mg/L,5-氟尿嘧啶(5-FU)引起的各组IC_(50)分别为(1.78±0.39)mg/L、(0.60±0.08)mg/L和(0.57±0.05)mg/L。以上两种药物作用下MGC-803-FHIT细胞存活率和IC_(50)与MGC-803组和MGC-803-vector组差异均有统计学意义。【结论】外源性FHIT基因可以抑制胃癌细胞增殖、促进其凋亡。FHIT基因转染对不同药物作用下胃癌细胞化疗敏感性的影响不一致,FHIT基因转染可以提高胃癌细胞MGC-803对顺铂(DDP)的敏感性、降低对5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性。以上研究提示,将FHIT基因与抗癌药物联合应用可能会提高或降低化疗药物的作用效果,从而指导临床用药。
孔梅[3]2003年在《外源性FHIT基因对胃癌细胞株MGC-803凋亡作用的影响》文中研究表明胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,已明确的胃癌的发病机制中,抑癌基因的失活或异常表达占据重要一席。 FHIT(fragile histidine triad)基因是1996年Otha等人在研究某家族性肾细胞癌时利用外显子捕获的方法发现的,并克隆了相应的cDNA。因包含有主要的脆性位点---FRA3B及从属于组胺酸叁联体(Histidine triad(HIT))蛋白超家族,故命名。越来越多的研究发现FHIT基因在大量的原发性肿瘤及细胞株中存在异常,该基因被认为是一个候选的抑癌基因。 为了研究FHIT基因的抑癌机制,已有多人将外源性的FHIT基因转入胰腺癌,食道癌等细胞株中,发现FHIT基因可以诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞,但结果存在争议,而且目前尚无FHIT基因同胃癌细胞凋亡关系的研究报道。 目的:探讨外源性FHIT基因的表达对胃癌细胞凋亡作用的影响。 实验方法:用脂质体将包含有外源性FHIT基因的重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT及作为对照的空真核表达质粒pRcCMV转入FHIT蛋白表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803中,G418筛选42天后,用Western-blot,免疫组化的方法验证了外源性FHIT蛋白的稳定表达,并检测了FHIT蛋白的细胞定位。然后用流式细胞仪,普通光镜及透射电镜对获得稳定FHIT蛋白表达的转染组细胞和空真核表达质粒转染组细胞及未转染的亲本细胞凋亡的状况进行了考察,另外还通过流式细胞仪检测了叁组 浙江大学硕士学位论文细胞生长周期的惰况。 实验结果:发现外源性FH IT基因转染组的胃癌细胞的凋亡率(32.3%)明显高于空质粒转染组和未转染组细胞(12.15%,6.175%),形态学的观察也发现FHIT基因转染组的部分细胞中出现了典型的凋亡变化:细胞体积缩小,细胞膜完整,胞浆浓缩,核染色质边集,核碎裂及凋亡小体等,而其他两组细胞未见明显的上述改变。另外,细胞周期也出现了明显的改变,GO儿 期的细胞百分比也从空载体组的49.5%增加到FHIT基因转染组的64.4%,即出现了明显的GO九 期阻滞。 结论:外源性FHIT基因能诱导胃癌细胞MGC-803凋亡及细胞周期阻滞,提示凋亡失控可能是FHIT基因表达异常的胃癌细胞株恶变的原因,细胞生长周期紊乱可能是FHIT基因表达异常的胃癌细胞株凋亡失控的一个原因。
薛淑芳[4]2007年在《外源性FHIT基因转染对胃癌细胞凋亡、细胞周期及阿霉素敏感性的影响》文中进行了进一步梳理【背景与目的】脆性组氨酸叁联体(fragile histidine triad,FHIT)基因是1996年Ohta等人在研究某家族性肾细胞癌时利用外显子捕获的方法发现的,并克隆了相应的cDNA。因包含有主要的脆性位点FRA3B及从属于组氨酸叁联体(histidine triad,HIT)蛋白超家族,故命名。越来越多的研究发现,FHIT基因在大量的原发性肿瘤及细胞株中存在异常,尤其是在和环境中致癌因素关系密切的恶性肿瘤中其异常率较高。该基因被认为是一个候选的抑癌基因。胃癌是和环境致癌物密切相关的肿瘤,是消化道最常见的恶性肿瘤之一,已明确的胃癌的发病机制中,抑癌基因的失活或异常表达占据重要一席。因而研究胃癌中FHIT基因的异常对胃癌的发生发展及诊断治疗具有重要的理论和临床意义。化疗是胃癌除手术外非常重要的辅助治疗手段。但胃癌细胞对单用一种化疗药物的敏感性较差,且易出现耐药现象。同时,化疗作为临床上应用较多的抗肿瘤治疗方法,在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也有较大的损伤,这在一定程度上限制了其疗效。因此,寻找新型有效的治疗方法并配合传统的治疗手段以提高疗效具有重要的临床意义。随着对癌变机制的深入了解,肿瘤的抑癌基因疗法研究逐渐深入,已有望成为肿瘤治疗的有效辅助手段。有学者将FHIT基因导入肿瘤细胞并有效表达,可以使肿瘤细胞的一些恶性表型得以逆转,还可能诱导肿瘤细胞发生凋亡,从而达到治疗肿瘤或增强传统治疗方法的目的。还有学者将FHIT基因导入肺癌细胞株并有效表达,研究其对一些化疗药物敏感性的影响。但关于FHIT基因对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究,国内尚无报道。本研究将FHIT基因导入该基因表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803,探讨FHIT基因对胃癌细胞凋亡、细胞周期及阿霉素(ADM)敏感性的影响。【方法】用脂质体将包含有外源性FHIT基因的重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT及作为对照的空真核表达质粒pRcCMV转入FHIT蛋白表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803中,G418筛选42天后,用Western Blot的方法验证了外源性FHIT蛋白的稳定表达。设未转染的亲本胃癌细胞为空白对照组,以阿霉素作用于叁组细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化,用MTT法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测阿霉素处理前后各组胃癌细胞凋亡及细胞周期的变化。【结果】1.获得了FHIT基因稳定表达的胃癌MGC-803细胞。2.胃癌细胞的生长抑制率存在阿霉素浓度依赖性和时间依赖性。3.外源性FHIT基因转染组的胃癌细胞的凋亡率(19.59%)明显高于空质粒转染组和未转染组细胞(4.41%,3.38%)。另外,细胞周期也出现了明显的改变,G_0/G_1期的细胞百分比也从空载体组56.30%的增加到FHIT基因转染组的74.43%。4.经阿霉素处理后,转染FHIT基因的MGC-803细胞的凋亡水平(40.66%)与空质粒转染组(13.94%)及胃癌细胞株组(15.81%)相比明显增高,存在显着性差异(P<0.01),并且FHIT基因与阿霉素有轻度的协同促进凋亡作用(P<0.05);实验组胃癌细胞的生长周期较对照组出现了明显的G_0/G_1期阻滞(99.27%vs95.10%)。【结论】1.FHIT基因能诱导胃癌细胞MGC-803凋亡,并能诱导转染细胞发生G_0/G_1期细胞周期阻滞。2.FHIT基因表达与阿霉素协同促进MGC-803细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加胃癌细胞对阿霉素的敏感性。
罗琼[5]2010年在《shRNA-FHIT对胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响》文中进行了进一步梳理背景和目的:胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,与环境致癌物密切相关,在我国无论发病率还是死亡率都很高,严重威胁人类健康。我国早期胃癌的检出率较低,仅为10%左右,多数病例在确诊时已属中晚期,中晚期胃癌患者的治疗效果差,五年存活率仅为20%~30%,故胃癌的早期诊断和综合治疗是提高疗效的关键所在。胃癌的发生具有多阶段、多因素的特征,在此过程中涉及癌基因的突变和活化、抑癌基因的丢失或表达失调以及凋亡调节机制紊乱等遗传学改变。脆性组氨酸叁联体(fragile histidine triad, FHIT)基因是1996年Ohta等人在研究某家族性肾细胞癌时利用外显子捕获的方法发现的,并克隆了相应的cDNA。因其覆盖肾细胞癌相关性断裂点t(3;8)及主要的脆性位点FRA3B,且蛋白产物从属于组氨酸叁联体(histidine triad, HIT)蛋白超家族,故命名。大量研究显示,FHIT基因是第一个将脆性位点和肿瘤联系起来的抑癌基因。研究发现,FHIT基因在胃癌等与环境致癌因素关系密切的恶性肿瘤中表达缺失和异常率较高,这些均提示FHIT在肿瘤的发生、发展及治疗中可能扮演重要的角色。FHIT基因及其基因产物的抑癌机制目前尚不十分清楚,FHIT很可能从多条途径发挥肿瘤抑制作用。对FHIT作用及机制的深入研究可能为胃癌的诊断和治疗提供新的思路。我们既往研究发现,外源性FHIT基因转染可以提高胃癌细胞MGC-803对顺铂(DDP)和阿霉素(ADM)的敏感性、降低对5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性;FHIT基因表达与阿霉素协同促进MGC-803细胞凋亡及细胞周期阻滞,因此,胃癌患者自然状态下FHIT基因阳性与阴性表达的不同是否可导致化疗敏感性的差异应引起高度关注。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是近年来出现的一种高效地特异性封闭基因的新技术,无论在功能基因组研究还是肿瘤的基因治疗等方面得到广泛的应用。基于此,本研究通过构建靶向抑制脆性组氨酸叁联体基因的短发夹双链RNA (shRNA-FHIT)真核表达质粒,转染入胃癌细胞株BGC-823,筛选获得FHIT稳定低表达细胞模型,并观察FHIT基因抑制后对胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响,为进一步研究其对胃癌化疗敏感性的影响奠定生物学基础并提供实验依据。方法:构建FHIT基因特异性的小RNA干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1、PGPU6/GFP/Neo-shRNA2,利用脂质体LipofactamineTM 2000转染胃癌细胞株BGC-823,实验分为未转染组、阴性对照组(转染PGPU6/GFP/Neo-shNC组)及PGPU6/GFP/Neo-shRNA1转染组和PGPU6/GFP/Neo-shRNA2转染组,G418筛选得到稳定表达株,Real-time PCR检测在mRNA水平干扰质粒对FHIT的抑制效应,MTT法、流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果:1.成功将含靶向FHIT基因的短发夹双链RNA (shRNA)的重组质粒转染FHIT表达阳性的胃癌细胞株BGC-823,经G418压力培养3个月后,获得稳定表达shRNA-FHIT的克隆。2.转染shRNA-FHIT重组质粒的BGC-823细胞FHITmRNA表达明显下降,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.转染干扰质粒组细胞增殖活性增强,凋亡率减低,与未转染组和阴性对照组相比,生长周期出现S期和G2/M期的比例上调,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论:1.成功将重组shRNA-FHIT表达载体转染BGC-823细胞,并筛选出稳定低表达FHIT的细胞。shRNA-FHIT重组质粒对FHIT基因的抑制作用具有长效性。2. shRNA-FHIT可以促进胃癌细胞增殖、降低凋亡率,并消弱G0/G1期阻滞。
罗玲丽[6]2010年在《外源性FHIT基因对奥曲肽诱导胃癌细胞MGC-803凋亡的影响》文中认为目的:本课题通过建立稳定表达FHIT蛋白的人胃癌MGC-803细胞株,探讨外源性FHIT基因表达对奥曲肽诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响及探讨其作用机制。方法:用脂质体法将pRc/CMV-FHIT质粒和空载体转入该基因表达缺失的人类胃癌系MGC-803细胞中,Western blot对获得G418抗性的细胞鉴定FHIT蛋白的表达,随后使用不同浓度的奥曲肽(octreotide, OCT)分别处理各组细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)显色法检测分析细胞增殖情况,western blot法检测细胞Bcl-2和Bax的表达,流式细胞分析技术检测细胞调亡。结果: (1)成功建立稳定表达FHIT蛋白的MGC-803细胞株,Western Blot法检测证实FHIT蛋白表达。(2)奥曲肽处理胃癌细胞后,出现细胞增殖抑制,呈剂量依赖性和时间依赖性。(3)奥曲肽处理48h后,转染FHIT基因组细胞凋亡率(26.777%±1.702%)与染空载体细胞(13.8%±0.511%)及空白组细胞的凋亡率(12.634%±0.479%)相比明显增高(F =245.789,P <0.05,);(4)转染FHIT基因组细胞经奥曲肽处理后Bcl-2蛋白表达减少,Bax蛋白表达增加。结论:外源性FHIT基因表达与奥曲肽可协同促进胃癌细胞MGC-803凋亡,其机制可能与BCL-2家族中的凋亡相关蛋白改变有关。
许洪伟, 付信娟, 秦成勇, 张春清, 杨崇美[7]2007年在《外源性脆性组氨酸叁联体基因对胃癌细胞株治疗敏感性的影响》文中进行了进一步梳理脆性组氨酸叁联体(FHIT)基因是近年发现的抑癌基因之一,有研究表明胃癌中存在较高频率的FHIT基因转录异常和(或)FHIT基因表达降低或缺失,提示FHIT基因异常表达可能与人类胃癌的发生、发展有关。本研究通过脂质体
李建华[8]2009年在《外源性FHIT基因的表达对多西紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡的实验研究》文中研究指明【背景与目的】胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,在我国居恶性肿瘤的发病率和死亡率之首,多数病例在确诊时已属中晚期,手术治疗的5年生存率仅为20%~30%,预后仍然不佳。近年来虽然出现了各种手术方式的改良及化疗、放疗方案的改进,但收效甚微。手术切除无法清除所有的肿瘤细胞,且存在术后复发和转移的弊端。化疗是胃癌除手术外非常重要的辅助治疗手段,但胃癌细胞对单用一种化疗药物的敏感性较差,且易出现耐药现象。同时,化疗作为临床上应用较多的抗肿瘤治疗方法,在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常细胞也有较大的损伤,这在一定程度上限制了其疗效。而近年来作为恶性肿瘤第四种治疗模式的基因治疗研究得到了蓬勃发展,取得了一系列可喜的成果,有望成为手术、放疗和化疗的有效辅助疗法。在肿瘤发生过程中,原癌基因激活、抑癌基因失活、误配修复基因改变等起了重要作用。为了彻底征服癌症,人们一直在进行肿瘤基因的研究,这导致许多癌基因、抑癌基因、误配修复基因的发现,脆性组氨酸叁联体(fragile histidine triad,FHIT)就是其中之一。FHIT基因是1996年Ohta等人在研究某家族性肾细胞癌时利用外显子捕获的方法发现的,并克隆了相应的cDNA。因包含有主要的脆性位点FRA3B及从属于组氨酸叁联体(histidine triad,HIT)蛋白超家族,故命名。FHIT基因自发现后即被拟定为一候选抑癌基因。虽然在早期有学者对它的抑癌作用提出质疑,但越来越多的研究表明,FHIT基因是一个抑癌基因。FHIT基因及其基因产物的抑癌机制目前研究的还不是很清楚,FHIT很可能从多条途径发挥肿瘤抑制作用。研究发现,FHIT基因在胃癌等与环境致癌因素关系密切的恶性肿瘤中表达缺失和异常率较高。有学者将FHIT基因导入肿瘤细胞并有效表达,可以使肿瘤细胞的一些恶性表型得以逆转,还可能诱导肿瘤细胞发生凋亡,从而达到治疗肿瘤或增强传统治疗方法的目的。还有学者将FHIT基因导入肺癌细胞株并有效表达,研究其对一些化疗药物敏感性的影响。化疗药物多西紫杉醇(docetaxel,DOC)作为一种微管稳定剂一直处于胃癌临床研究的领先地位,2期临床试验显示,单药多西紫杉醇一线或二线治疗晚期胃癌的有效率为17%—24%。基于对多西紫杉醇单药的较好活性和FHIT基因在胃癌的发生、发展和转归过程中作用的认识,本研究采用这两种因素干预FHIT基因表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803,探讨外源性基因FHIT的表达对多西紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡的影响,为胃癌的临床基因与化学药物的联合治疗提供理论基础,国内尚无报道。【方法】采用MTT法检测不同浓度(1.0、5.0、10、20、40μg/ml)及不同时间(24h、48h、72h)下多西紫杉醇对MGC-803细胞的抑制率并选择最佳浓度和作用时间;用脂质体将包含有外源性FHIT基因的重组真核表达质粒稳定转染胃癌细胞株(MGC-803);采用流式细胞术检测FHIT转染和DOC单独及联合作用后的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测干预前后cleaved-Caspase3的蛋白表达【结果】1.获得稳定表达FHIT基因的胃癌细胞。2.DOC对胃癌细胞具有抑制作用,且浓度为20μg/ml、时间为48h时最明显。3.DOC+pRcCMV-FHIT组细胞的凋亡水平(65.54%)较阴性对照组(3.27%)、pRcCMV组(3.55%)、pRcCMV-FHIT组(13.94%)、DOC组(44.13%)、DOC+pRcCMV(45.29%)组明显增高,且差异具有统计学意义(P<0.05);4.DOC+pRcCMV-FHIT组细胞的cleaved-Caspase3蛋白表达较其它各组明显增强。【结论】FHIT基因表达与DOC能够协同促进胃癌细胞的凋亡,这可能与二者能够协同上调Casepase-3蛋白表达相关。
陈伟[9]2009年在《FHIT基因对SW480人结肠癌细胞生长增殖影响的实验研究》文中进行了进一步梳理背景近年来结肠癌发病率和死亡率均呈上升趋势。手术仍是治疗的关键手段,而术后放、化疗对提高生存率作用有限。因此,寻求新的结肠癌早期诊断和治疗的方法对于提高其手术切除率和生存率,改善生活质量具有重要的意义。随着肿瘤免疫学和分子生物学研究的进展,结肠癌发生发展和转移的分子机制已经部份阐明,为结肠癌的基因治疗提供了理论基础。本课题组的前期研究证明脆性组氨酸叁联体(Fragile histidine triad,FHIT)基因表达缺失在结肠癌的发生、发展中起着重要的作用,但目前其应用于基因治疗总的效果仍不理想,许多还处于临床前实验阶段,加上人体基因表达机制十分复杂,到目前为止有些环节还不清楚,需要继续深入研究,以便更好地发挥基因治疗的作用。外源性FHIT基因转染入FHIT基因表达缺失的结肠癌中诱导癌细胞凋亡的分子机制一旦明确,将为结肠癌的治疗提供全新的分子治疗策略。本研究拟通过阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下将基因工程技术构建的真核表达载体pFHIT转染入人结肠癌细胞系SW480中,通过G418筛选、滤纸片法结合有限稀释法挑选单克隆稳定转染株,检测SW480-FHIT、转染空质粒pRc/CMV2的SW480-NEO细胞株以及野生型SW480细胞系的FHIT表达情况;观察FHIT在体外对细胞生长增殖及细胞周期和凋亡的影响;建立BALB/C NU裸鼠SW480皮下结肠癌模型,探讨FHIT在体内抗肿瘤效应。第一部分构建稳定表达FHIT的SW480结肠癌细胞株一.目的构建稳定表达FHIT的SW480结肠癌细胞株。二.方法1.细胞培养SW480细胞复苏后以含10%胎牛血清、高糖DMEM完全培养基常规传代培养。2.真核表达载体的转染、G418筛选及挑选单克隆稳定转染株以阳离子脂质体Lipofectamine 2000介导将FHIT表达载体质粒pFHIT(由本课题组杨平师兄构建)和空载体质粒pRc/CMV2转染人结肠癌细胞株SW480。转染48小时后,采用梯度渐增法确定的含G418完全DMEM培养基对转染细胞进行筛选。维持最适筛选浓度14天后用滤纸消化法结合有限稀释法挑选并扩增单克隆细胞株。3. RT-PCR及Western Blot检测各组细胞FHIT表达的检测Trizol法提取细胞总RNA,样品进行紫外分光光度仪检测及1%琼脂糖胶电泳检测判断产量及质量。RT-PCR检测FHIT表达。PLC蛋白裂解液裂解细胞后提取总蛋白,行SDS-PAGE电泳,转膜后孵育1抗、2抗,ECL发光法检测目的FHIT蛋白表达。叁.结果1.重组质粒的鉴定结果分别以FHIT重组质粒以及pRc/CMV2质粒为模板,加入FHIT引物构建PCR体系进行特异性扩增,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,可见FHIT为模板组出现431bp的条带,而pRc/CMV2则无相应条带。2.真核载体转染、G418筛选、有限稀释法挑选单克隆稳定转染株结果使用Lipofectamine 2000阳离子脂质体进行真核细胞载体的转染对细胞的损伤较小,转染效果满意。对SW480细胞系来说,含800μg/ml G418的完全DMEM培养基为最佳筛选浓度,400μg/ml为合理维持浓度。从转染成功并通过筛选的细胞中通过滤纸消化法和有限稀释法挑选单克隆并建立稳定表达细胞株。3.稳定转染株FHIT表达评价分别以FHIT重组质粒以及pRc/CMV2质粒和空白SW480细胞株cDNA为模板,进行RT-PCR,转染FHIT重组质粒的实验组样品可扩增出FHIT产物条带,空白对照组、阴性对照组样品均未扩增出FHIT产物条带。而相应的Western blot检测转染FHIT的细胞中有FHIT蛋白表达,而转染空载体的细胞株和阴性对照均无目的条带出现。叁组均可扩增出内参GAPDH条带。四.结论使用Lipofectamine 2000阳离子脂质体进行真核细胞载体的转染可以得到满意的转染效果。通过G418筛选、滤纸法结合有限稀释法挑选单克隆,可以建立FHIT重组质粒稳定转染的人结肠癌细胞株。转染了pFHIT的人结肠癌SW480细胞株可以稳定表达FHIT,转染空质粒pRc/CMV2及未转染质粒的SW480野生型细胞均不表达FHIT。第二部分FHIT对SW480人结肠癌细胞生长增殖影响的体外实验一目的:通过MTT法检测细胞增殖能力、流式细胞仪分析细胞周期和凋亡改变,进而分析FHIT基因转染对SW480人结肠癌细胞生长增殖的影响。二.方法1.分组:挑选稳定表达FHIT的转染株(设定为SW480-FHIT)进行以下实验;挑选不表达FHIT的pRc/CMV2转染株(设定为SW480-NEO)为阴性对照组;以未转染的SW480为空白对照组。2.观察细胞形态使用光学显微镜观察各组细胞形态。3. MTT检测细胞增殖能力将上述叁组细胞以每孔1×104个细胞量接种到96孔板,每组设置4个复孔,接种细胞后于不同的时间点采用MTT法检测细胞增殖能力改变,并绘制细胞生长曲线。4.流式细胞仪分析细胞周期和凋亡于6孔板内接种上述叁组细胞,待细胞长至90%汇合度时,胰酶消化法收取细胞,调整细胞密度为1×106/ml,PI染色,以流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化,每组重复3次。叁.结果1.细胞生长情况正常营养、同等培养条件下,3组细胞的生长状态和形态观察显示无明显差异。2、噻唑蓝比色法(MTT)检测转染前后细胞增殖能力的变化空载体转染细胞SW480-Neo和亲本细胞SW480增殖无显着差异(P>0.05),相比之下,FHIT基因转染的细胞株SW480-FHIT较上述两组细胞生长速度明显减慢,尤其是达到对数生长期后更加明显,差异显着(P<0.05),。3、SW480细胞转染FHIT前后细胞周期和凋亡比率的变化: SW480-Neo和SW480细胞的细胞周期和凋亡比率检测均未见显着差异,而SW480-FHIT细胞和上述两组细胞对比,G2/M期和S期比例显着下降,而G0/G1期的细胞比例显着增加,且凋亡率高于较其它两组(P<0.05)。四.结论FHIT基因可以降低人结肠癌细胞SW480的增殖能力,抑制其细胞周期并增加细胞的凋亡率。第叁部分FHIT对SW480人结肠癌细胞生长增殖影响的体内实验一、目的FHIT基因转染对SW480人结肠癌细胞在裸鼠体内的生长增殖影响,并对其机制进行初步探讨。二、方法1.实验动物分组60只SPF级4~5周龄雄性BALB/C NU裸鼠,随机分为叁组,每组20只,实验组接种SW480-FHIT,阴性对照组接种SW480-NEO,空白对照组接种SW480。2.动物模型的建立常规培养细胞数量足够并生长至对数期时,收集细胞镜下计数,PBS重悬细胞制备单细胞悬液,使活细胞浓度为5×107/ml。每只BALB/C NU裸鼠以0.2ml(即1×107个细胞)接种于右侧背部皮下。3.实验观察观察肿瘤形成情况;接种后第10天开始隔2天测量肿瘤体积,并绘制各组肿瘤生长曲线。肿瘤体积(mm3)以公式0.5×a×b2计算,a(mm)为肿瘤长径,b(mm)为肿瘤短径;待肿瘤体积至500mm3左右时每组随机选取10只小鼠处死用于检测,其余10只继续培养,记录生存时间,比较叁组荷瘤小鼠的生存期。4.肿瘤标本检测内容:(1) RT-PCR和Western Blot检测肿瘤组织中FHIT表达。(2)免疫组化检测肿瘤组织FHIT、P53基因表达。叁、结果1. FHIT对BALB/C NU裸鼠移植瘤生长的影响在接种后7~10天,叁组BALB/C NU裸鼠均可于皮下触及肿瘤。肿瘤生长曲线可见SW480-FHIT组的肿瘤生长比SW480组和SW480-NEO组的肿瘤生长明显为慢,对各时间点的肿瘤体积进行单因素方差分析,比较组间差异有统计学意义(SW480-FHIT组和SW480相比,各时间点p<0.01, SW480-FHIT组和SW480-NEO相比,各时间点p<0.01)。而两对照组间的差异没有统计学意义(各时间点p>0.05)。2. FHIT对BALB/C NU荷瘤裸鼠生存期的影响SW480组的中位生存期为35天,95%CI(30.868,39.132);SW480-NEO组为37天, 95%CI(35.482,38.518);SW480-FHIT为48天,95%CI (43.868,52.132),叁组的平均生存期分别为34.600±1.558、36.100±1.479、50.700±3.685天。Log Rank法分析组间差异,见两对照组间生存期差异无统计学意义(p=0.474),而实验组分别与两对照组相比,差异均有统计学意义(p<0.001)。3.肿瘤组织FHIT基因的表达情况RT-PCR检测结果提示SW480-FHIT组小鼠肿瘤组织中均有不同程度的FHIT基因表达,而Western Blot则表明FHIT蛋白有表达;相比之下,其它各组小鼠mRNA和蛋白水平均未检测到FHIT表达。免疫组化结果显示,SW480-FHIT组小鼠肿瘤组织中有FHIT蛋白表达,而其它两组无表达;P53结果分析显示,各组均有P53表达,但以SW480-FHIT组最为显着。四、结论1、FHIT基因转染结肠癌细胞能显着抑制肿瘤细胞在体内的生长、延长荷瘤裸鼠的生存期;2、FHIT基因转染的SW480细胞接种后形成的肿瘤组织中有FHIT表达,且P53基因表达增加,说明FHIT有可能通过上调P53基因的表达抑制了肿瘤细胞的增殖。
陈立新[10]2007年在《膀胱癌中FHIT基因异常和3号染色体微卫星杂合性缺失及相关蛋白表达的研究》文中研究表明膀胱肿瘤(tumor of bladder)是我国泌尿生殖系统最常见的肿瘤,高发年龄为50~70岁。男:女为4:1。随着我国人口老年化,膀胱肿瘤的发病也呈逐年增高的趋势,严重威胁人们的生命和健康。膀胱肿瘤95%以上为上皮性肿瘤,其中绝大多数(90%)为移行细胞癌(TCC),其次为鳞状细胞癌占2~3%,腺癌占2~3%。非上皮性肿瘤极少见,多数为肉瘤如横纹肌肉瘤。膀胱癌具有多发性、易复发的特点。近1/3的膀胱癌为多发性肿瘤。膀胱肿瘤病因很多,一般认为与以下危险因素相关:1.长期接触一些致癌物质,如染料、纺织、皮革、橡胶、油漆等。2.吸烟是最常见的致癌因素。3.膀胱癌与长期膀胱慢性感染和异物刺激有关。4.长期服用镇痛药非那西丁可能为膀胱癌的病因或诱因。膀胱癌的确切病因并不清楚。随着分子生物学技术的快速发展及对膀胱癌分子遗传学的深入研究,为膀胱癌早期诊断和生物学治疗提供了一个全新的发展方向。3号染色体短臂是多种肿瘤杂合性丢失和细胞遗传学异常的高发区域,3号染色体短臂上等位基因缺失是膀胱癌最常见的遗传物质改变之一。膀胱癌3号染色体短臂发生杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)的频率很高,该区域早在1979年就被认为存在t(3:8)易断处。此后的研究发现,3p14.2区域有脆性位点FRA3B。3号染色体短臂上与肿瘤发生、发展密切相关的抑癌基因FHIT、hMLH及VHL分别定位于3p14-cen、3p21-22、3p25-26这叁个区段之中。脆性组氨酸叁联体(fragile histindine triad,FHIT)基因是1996年Ohta等用外显子捕获法(exon trapping)确定并克隆出来的人类基因。FHIT存在于大多数正常组织中。研究发现,FHIT基因在人类多种恶性肿瘤及多种恶性肿瘤细胞系中呈现高频率的杂合缺失或甲基化。肿瘤中很少见到FHIT基因点突变的报道。因此,FHIT基因被拟定为抑癌基因。定位于染色体3p14-12区域,具有10个外显子。FHIT基因的功能主要有四个方面:1.FHIT基因功能与其Ap3A水解酶活性有很大的关系,FHIT基因失活导致Ap3A水解酶活性的丧失,从而导致Ap3A或类似复合物水平的升高,刺激DNA聚合酶A合成DNA,通过细胞周期G1期控制点使细胞生长进入S期。2. FHIT基因功能与微管蛋白有关,发现FHIT蛋白和微管蛋白有较强的结合力,而微管蛋白对细胞的分化和增值有作用,有可能FHIT蛋白抑制肿瘤生长也同微管蛋白有关。3. FHIT基因与细胞周期控制和细胞凋亡有关。FHIT基因激活外源性caspases(凋亡蛋白酶)路径,首先激活启动子caspase8,同时,FHIT基因还激活线粒体凋亡途径,使线粒体失去跨膜电位而凋亡。4.FHIT基因与细胞对于外界环境的应激能力有关,FHIT基因失活可能会引起癌变,另外FHIT蛋白具有去除mRNA帽类似体的作用,FHIT蛋白能作用于mRNA帽类似物,影响重要基因mRNA的翻译。目前FHIT基因的分子作用机制仍然不清楚,以下有几种学说来解释FHIT基因抑制肿瘤的机理:1.蛋白激酶C抑制剂(protein kinase C inhibitor,PKCI)假说。认为FHIT蛋白可能是PKCI,当细胞内Ca2+浓度升高达到一定水平时,PKC即被激活,并使相应的底物磷酸化而发挥一系列的生理功能,其中包括细胞内信号的传递、核基因的转录、细胞增殖和凋亡等。2. AP3A水解酶-细胞增殖调节假说。认为FHIT蛋白可能也是一种Ap3A水解酶,FHIT蛋白可以通过水解APnA来抑制细胞增殖。3.ApnA-FHIT聚合物-细胞凋亡传导信号假说。FHIT蛋白与APnA结合形成FHIT-AP3A复合蛋白,与ADP、ATP结合形成ApnP,后者与FHIT蛋白结合发生构像改变而活化,其产物又通过多种途径诱导细胞凋亡。前两个假说已被后来的研究否定,目前认为FHIT蛋白主要通过与AP3A形成复合物,通过细胞凋亡途径发挥作用。Survivin基因是近年来发现的凋亡蛋白抑制因子(IAP)家族中的一个新成员。1997年,Altieri首先发现了survivin基因。它定位于17q25,全长14.7kb,含有3个内显子和4个外显子,编码含有142个氨基酸分子量为16.5KD的胞浆蛋白。它是近年来发现的一个调节细胞性程序死亡的蛋白质家族(IAPs)8个成员之一,Survivin是至今发现作用最强的凋亡抑制蛋白之一。尿液中肿瘤脱落细胞能反映膀胱癌的遗传学特性。而尿液检测是一种简便、无创性的手段。通过尿液检测来早期诊断膀胱癌并监测膀胱癌术后复发的方法很多,如尿脱落细胞细胞学检查、流式细胞学检测、尿液游离膀胱肿瘤标志物检测、尿液中肿瘤相关抗原检测、检测端粒酶活性检测等。但敏感性和特异性各家报道差异性较大。微卫星DNA(microsatellite DNA)又称短串联重复序列,微卫星DNA是广泛分布于原核、真核生物基因组中的短小串联重复的DNA序列,约占人类基因组的5%,由于许多微卫星都与基因紧密连锁甚至位于基因内部,因此微卫星的缺失常表示其连锁基因的缺失。肿瘤中微卫星异常主要表现为微卫星不稳定性(MSI)和微卫星的杂合性缺失。微卫星异常在多种肿瘤组织中可检测到,微卫星异常可作为肿瘤的分子标志应用于临床辅助诊断。基于以上背景,本研究检测49例膀胱TCC组织及10例正常膀胱组织中FHIT基因中4个外显子的缺失、突变和甲基化情况,FHIT蛋白和Survivin蛋白表达,以及组织和尿液中FHIT基因的两个微卫星位点D3S1234和D3S1300、VHL基因连锁的微卫星位点D3S1038、hMLH1基因连锁微卫星位点D3S1561杂合性缺失情况,结合临床资料,旨在:评价FHIT基因改变与膀胱TCC发生的关系及临床意义,分析FHIT蛋白和Survivin蛋白表达在膀胱TCC发生中的临床意义和相互关系,从分子水平探讨膀胱TCC的发病机制,分析组织和尿液中FHIT基因、VHL基因、hMLH1基因微卫星位点杂合性缺失,为膀胱TCC的基因诊断提供实验依据。本实验采用1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)-银染法分析膀胱TCC组织中FHIT基因外显子3、4、5、8缺失和突变情况。2.甲基化特异性PCR(MSP)方法分析膀胱TCC组织中FHIT基因CpG岛甲基化状况甲基化情况。3.用免疫组织化学(S-P)法检测膀胱TCC组织中FHIT基因和Survivin基因蛋白表达。4.聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PCR-PAGE)-银染法分析膀胱TCC组织和尿液中FHIT基因、VHL基因、hMLH1基因微卫星位点杂合性缺失。结果1.49例膀胱TCC组织中21例存在一个或多个FHIT基因外显子杂合性缺失,缺失率为42.9%(21/49)。外显子3杂合性缺失率为8.2%(4/49),外显子4杂合性缺失率为10.2%(5/49),外显子5杂合性缺失率为32.7%(16/49),外显子8杂合性缺失率为0%(0/49)。一例同时出现外显子3、4、5杂合性缺失,2例同时出现外显子4、5杂合性缺失。FH1T基因4个外显子均未发现迁移率的改变即点突变。FHIT基因基因甲基化为16.3%(8/49),正常膀胱组织中无FHIT基因杂合性缺失、点突变和甲基化。2.49例膀胱TCC中,FHIT蛋白阳性表达率为46.9% (23/49)。FHIT蛋白表达随病理分级升高而下降,与膀胱TCC病理分级间存在相关关系,FHIT蛋白阳性表达随临床分期升高而下降;Survivin蛋白阳性表达率为57.1% (28/49),Survivin蛋白表达随病理分级升高而上升,与膀胱TCC病理分级间存在相关关系。Survivin蛋白阳性表达随肿瘤临床分期升高而增高,与膀胱TCC临床分期间存在相关关系;FHIT蛋白与Survivin蛋白表达间呈负相关关系。3.FHIT基因外显子两个微卫星位点D3S1300、D3S1234在膀胱TCC组织和尿液中的杂合性缺失率分别为50%(17/34),40%(12/30)和47.1%(16/34),40%(12/30)。与hMLH1基因连锁的微卫星位点D3S1561在膀胱TCC组织和尿液中的杂合性缺失率为40%(8/20)。与VHL基因连锁的微卫星位点D3S1038在膀胱TCC组织和尿液中的杂合性缺失率分别为35.5%(11/31)和32.3%(10/31);FHIT,hMLH1及VHL基因上述微卫星位点的杂合性缺失之间无相关关系;通过尿液FHIT,hMLH1及VHL基因微卫星位点的杂合性缺失诊断膀胱TCC的敏感性为75.5%(37/49),特异性为100%。常规尿脱落细胞学检查阳性率16.3%(8/49)。结论1.膀胱TCC中存在FHIT基因的杂合性缺失和甲基化,而未检测到点突变。杂合性缺失是FHIT基因主要的失活机制,杂合性缺失以外显子5为主,其次是外显子4和外显子3,未发现外显子8杂合性缺失。2.膀胱TCC中存在FHIT蛋白异常表达,FHIT蛋白异常表达与膀胱TCC恶性程度有关。可能成为一重要的肿瘤抑制蛋白,在膀胱TCC的发生和演化中起着重要的作用。FHIT蛋白检测可作为膀胱TCC诊断指标。Survivin蛋白是膀胱TCC高表达蛋白,与膀胱TCC恶性程度和进展有关,Survivin基因是膀胱TCC发生的晚期分子事件。Survivin蛋白检测可作为膀胱TCC诊断指标。FHIT蛋白和Survivin蛋白在膀胱TCC呈负相关,表明FHIT蛋白可能通过细胞凋亡途径发挥作用。3.3号染色体短臂上FHIT基因,hMLH1基因及VHL基因在膀胱TCC中存在高频杂合性缺失。但在膀胱TCC发生、发展中没有直接内在联系,可能是膀胱TCC发生、发展中的独立分子事件。4.尿液中3号染色体短臂上FHIT基因,hMLH1基因及VHL基因微卫星位点杂合性缺失的联合检测可作为膀胱TCC诊断的一种特异性和敏感性较高的生物学方法。
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