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杆状病毒VLF-1功能域的研究及其互作蛋白的筛选

2020-12-08阅读(589)

杆状病毒VLF-1功能域的研究及其互作蛋白的筛选

论文摘要

vlf-1是杆状病毒AcMNPV的核心基因之一,也是病毒感染的必需基因,其同源序列存在于所有已测序的杆状病毒中。最初的研究发现该基因编码的蛋白影响极晚期基因的超表达,因此命名为极晚期表达因子1（very late expression factor 1,VLF-1）。后来研究发现VLF-1对病毒核衣壳形成是必需的,该基因缺失突变病毒能观察到空管状衣壳鞘结构,表明VLF-1参与了病毒核衣壳的组装。vlf-1突变病毒的基因组DNA能被DNA酶完全降解,而其他某些病毒基因缺失也产生空管状衣壳鞘的病毒,其病毒基因组DNA有大约35%被保护而不被DNA酶降解,这表明VLF-1可能参与调控病毒基因组DNA的包裹。另外,VLF-1作为核衣壳结构蛋白,定位于核衣壳的末端。因此,VLF-1在病毒DNA加工、包裹和核衣壳组装的最后阶段有关键作用。本实验从两个方面对VLF-1的功能进行更深一步的研究。一、通过对VLF-1蛋白结构的预测,依据保守型结构域、整合酶家族结构域、DNA断裂-再连接酶结构域以及蛋白、DNA、RNA结合位点对vlf-1基因序列进行针对性的截短,在Bac-to-Bac系统中构建了十二个截短型和拯救型重组杆状病毒质粒并转染Sf9细胞,使用光学显微镜、荧光显微镜观察重组病毒在细胞中的复制情况,分析截短型VLF-1对病毒复制的影响。二、通过酵母双杂交的手段,构建AcMNPV感染的Sf9细胞总cDNA文库,利用结合法筛选,再利用缺陷型培养基逐步验证与VLF-1互作的蛋白。在得出初步结果后利用CO-IP、双分子荧光互补等技术,进一步验证互作蛋白。最后通过亚细胞定位等方式来探究其在细胞中互作的位置。以此来探究VLF-1调控病毒核衣壳组装及极晚期转录的机制。实验结果表明,在一系列截短型重组病毒中,碱基序列为1-1044 bp的截短型在Sf9细胞中的复制和感染情况与野生型和拯救型类似,说明其关键功能域存在于该区域。而在互作蛋白的筛选中,初步筛选出19种可能与VLF-1互作的蛋白,并挑选出以下由AcMNPV编码的蛋白:39K（Ac36）、VLF-1（Ac77）、CG30（Ac88）、VP39（Ac89）、LEF-5（Ac99）、P6.9（Ac100）、ME53（Ac139）,进行深入验证。验证结果表明 39K（Ac36）、CG30（Ac88）、LEF-5（Ac99）与VLF-1存在互作。亚细胞共定位实验表明,39K与VLF-1共定位于细胞核。亚细胞定位实验表明,39K定位于细胞核;CG30定位于细胞核膜;LEF-5定位于细胞核。其中,39K是一个能与单链和双链DNA结合的蛋白;CG30含有一个锌指和亮氨酸指的结构,删除该蛋白后病毒的滴度急剧下降;LEF-5是一个晚期表达因子,含有一个类似于RNA聚合酶II延伸因子（TFIIS）的结构域,主要功能是调节晚期基因转录。我们推测VLF-1可能通过与39K相互作用参与病毒DNA的加工;通过与CG30的互作参与核衣壳的组装;通过与LEF-5的互作调控极晚期基因的超表达。其具体的作用机制仍有待阐明。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 杆状病毒分类
  •   1.2 杆状病毒感染周期
  •     1.2.1 两种杆状病毒粒子
  •     1.2.2 感染周期的阶段
  •   1.3 杆状病毒基因表达
  •     1.3.1 病毒基因组
  •     1.3.2 核心基因
  •     1.3.3 基因表达的时序性
  •     1.3.4 病毒编码蛋白的分类
  •   1.4 杆状病毒应用
  •     1.4.1 生物杀虫剂
  •     1.4.2 表面展示系统
  •     1.4.3 基因治疗
  •     1.4.4 外源基因表达载体
  •     1.4.5 Bac-to-Bac系统
  •   1.5 vlf-1基因的研究背景
  •   1.6 本论文的研究目的和意义
  • 第二章 vLF-1功能域的研究
  •   2.1 前言
  •   2.2 实验材料
  •     2.2.1 细胞系、菌株及质粒
  •     2.2.2 工具酶及相关试剂
  •     2.2.3 培养基
  •     2.2.4 实验仪器
  •     2.2.5 引物
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 PCR扩增目的基因片段
  •     2.3.2 使用AXYGRN DNA纯化回收试剂盒回收DNA片段
  •     2.3.3 DNA酶连反应
  •     2.3.4 酶切反应
  •     2.3.5 转化DH5α感受态细胞
  •     2.3.6 碱裂解法提取质粒
  • 2法制备DH10B感受态'>    2.3.7 用CaCl2法制备DH10B感受态
  •     2.3.8 bacmid转座DH10B感受态细胞
  •     2.3.9 PCR鉴定重组bacmid
  •     2.3.10 OMEGA BAC/PAC DNA提取试剂盒提取bacmid
  •     2.3.11 Sf9细胞传代
  •     2.3.12 bacmid转染Sf9细胞
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 目的基因的克隆
  •     2.4.2 重组供体质粒的构建
  •     2.4.3 重组bacmid的构建
  •     2.4.4 重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达
  •   2.5 小结
  • 第三章 构建AcMNPV感染的Sf9细胞总cDNA文库并筛选与VLF-1互作的蛋白
  •   3.1 前言
  •   3.2 实验材料
  •     3.2.1 细胞系、菌株及质粒
  •     3.2.2 工具酶及相关试剂
  •     3.2.3 培养基
  •     3.2.4 引物
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 目的基因克隆及载体构建
  •     3.3.2 病毒感染的Sf9细胞总RNA的提取
  •     3.3.3 提取mRNA
  •     3.3.4 合成双链cDNA
  •     3.3.5 酵母感受态细胞的制备
  •     3.3.6 cDNA文库的建立
  •     3.3.7 cDNA文库质量鉴定
  •     3.3.8 酵母双杂交载体的自激活鉴定和毒性分析
  •     3.3.9 利用酵母结合法筛选AcMNPV感染的Sf9细胞酵母cDNA文库
  •     3.3.10 PCR鉴定阳性克隆中文库质粒插入片段并测序分析
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 总RNA的提取和mRNA的纯化
  •     3.4.2 文库构建及其质量鉴定
  •     3.4.3 诱饵载体的构建
  •     3.4.4 诱饵载体的转化鉴定、自激活鉴定和毒性分析结果
  •     3.4.5 利用酵母结合法筛选AcMNPV感染的Sf9酵母cDNA文库
  •     3.4.6 测序结果分析
  •   3.5 小结
  • 第四章 初期筛选的VLF-1互作蛋白的验证和初步研究
  •   4.1 前言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 细胞系、菌株及质粒
  •     4.2.2 工具酶及相关试剂
  •     4.2.3 培养基
  •     4.2.4 引物
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 目的基因克隆及载体构建
  •     4.3.2 目的载体和诱饵载体共转化酵母感受态细胞
  •     4.3.3 重组病毒的制备
  •     4.3.4 双分子荧光互补实验
  •     4.3.5 免疫共沉淀实验
  •     4.3.6 Western blot
  •     4.3.7 亚细胞共定位实验操作步骤
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 酵母双杂交验证互作
  •     4.4.2 双分子荧光互补验证互作
  •     4.4.3 免疫共沉淀验证互作
  •     4.4.4 互作蛋白与VLF-1亚细胞共定位
  •     4.4.5 VLF-1与PK-1互作的研究
  •   4.5 小结
  • 第五章 总结与讨论
  •   5.1 实验总结
  •   5.2 讨论分析
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间学术论文发表情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 徐国栋

    导师: 梁昌镛

    关键词: 截短型,功能域,互作蛋白,酵母双杂交筛选

    来源: 扬州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 扬州大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.000758

    总页数: 96

    文件大小: 8786K

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